CC BY
16
исследования проводились на нейтрофилах периферической крови человека, что обусловило высокий разброс и противоречивость данных. Для выяснения причин нарушения защитных механизмов организма необходимо использование линейных животных, содержащихся в стандартных условиях. В данной работе использовали мышей инбредной линии С57В1 (самцы 3-24 мес). НеГпрофилы выделяли из перитонеальной полости по стандартной методике через 6 часов после в/б инъекции зимозана. Продукцию супероксидного анион-радикала оценивали по восстановлению НСТ. В качестве стимулятора использовали РМ А. Протеолитическую активность в клеточных экстрактах и супернатантах активированных нейтрофилов измеряли флуориметрическим методом по расщеплению FITC-меченых белков. Белки подвергали окислительной модификации in vitro в системе аскорбат +железо (III). Уровень окислительных повреждений в них оценивали по содержанию карбонильных групп (реакция с 2,4-ДНФГ). Установлено, что протеазы нейтрофилов лучше расщепляют белки, окисленные в присутствии аскорбата+железо (III), чем их исходные формы. Протеазы, специфичные к окисленным белкам, вероятнее всего, локализованы в гранулах и высвобождаются наружу при активации. Ингибиторный анализ установил их принадлежность к классу сериновых протеаз. Однако растворимые белки печени, выделенные из старых мышей той же линии, были заметно более устойчивы к протеолизу ферментами нейтрофилов, чем белки молодых животных. Гликатированный альбумин также расщеплялся нейтрофилами гораздо хуже своей исходной формы. Общая протеолитическая активность лизатов нейтрофилов и специфичность к окисленным белкам с возрастом не снижалась. Высказывается предположение, что повышение аутореактивности иммунной системы при старении может быть, по крайней мере, частично связано с накоплением неких модификаций (вероятнее всего, продуктов поздних стадий реакции гликатирования) в белках организма, которые делают их недоступными для “рестрикционных” протеаз нейтрофилов. Способность нейтрофилов к активации окислительного взрыва под действием РМА была снижена у старых мышей, что может частично объяснять снижение их бактерицидности при старении. Обнаружено, что уровень окислительных повреждений в белках нейтрофилов, полученных из старых мышей, повышен. По-видимому, НАДФН-оксидаза, ответственная за активацию окислительного метаболизма в этих клетках, является первичной мишенью свободных радикалов, образующихся в старом организме с повышенной скоростью [2], поскольку она расположена в плазматической мембране. Локализация протеаз в гранулах, в условиях относительной изоляции от оксидантов, препятствует их инактивации даже у старых животных.
1. Lefkovits, I., Frey, J.R., Kuhn, L., Sadovnikov, V.B., Pleshakova, O.V., and Sukharev, S.A. (1997) J. Immunol., vol. 158, no. 10,4908—4915.
2. Ames, B.N., Shigenaga, M.K., and Hagen, T.M. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90,7915 - 7922.
Исследование нитроксидергических процессов при иммунокорригирующей терапии
Ратников В.И., Рассохина Л.М., Важенина З.П., Ратников К.В., Тренина Е.А.
Челябинская Государствеиная медицинская академия Россия
Выяснение важной роли системы “Ь-аргииин - азота оксид” в регуляции физиологических функций организма, в том числе иммунных реакций и механизмов неспецифической защиты, определяет необходимость изучения и учета характера изменений нитроксидергических процессов при проведении медикаментозной, и в частности, иммунокорригирующей терапии. В этой связи целью настоящего исследования явилась оценка влияния широкого круга препаратов (антинитроксидергические, глюкокортикоидные и антиглюкокортикоидные средства, иммуностимулятор бемитил, антибиотик тиенам) на генерацию оксида азота при назначении в условиях нормальной и измененной иммунологической реактивности. Об уровне продукции оксида азота судили по суммарному содержанию в крови его стабильных конечных метаболитов — нитратов и нитритов, фотометрическое определение которых осуществляли по реакции Грисса.
Установлено, что препараты с антинитроксидерги-ческой активностью, уменьшающие образование оксида азота либо блокирующие его эффекты па уровне гу-анилатциклазы, существенно продлевали сроки функционирования трансплантатов у мышей С57В1, которым пересаживали полнослойные кожные лоскуты от мышей СВА. Этот эффект сохранялся и при комбинированном применении указанных средств с классическими иммунодепрессантами — в частности, с глюкокортико-идами, что позволило оптимизировать схемы применения последних и дало возможность уменьшить дозы и побочные эффекты при сохранении терапевтической эффективности. В свою очередь, глюкокортикоиды (гидрокортизон в дозах 10-50 мг/кг) мало изменяли базальную продукцию азота оксида и существенно снижали активность нитроксидергических процессов на фоне стимуляции липополисахаридом. Нарушение генерации азота оксида под влиянием глюкокортикоидов предотвращалось назначением их рецепторного антагониста — препарата 486 (мифепристона) в дозах 10-50 мг/кг.
Существенное влияние на функционирование системы “Ь-аргинин - азота оксид” выявлено у тиенама — бета-лактамного антибиотика группы карбапенемов. При введении интактным мышам препарат снижал уровень стабильных метаболитов оксида азота, причем выраженность эффекта зависела от дозы.
В клинических исследованиях показано, что интенсивные методы лучевой терапии онкологических больных, при воздействии суммарной очаговой дозы 16-20 Грей, приводят к изменению выраженности нитроксидергических процессов и у части пациентов вызывают тяже-
лыс пострадиационные иммуносупрессии. В этих условиях назначение иммуностимулятора бемитила, являющегося производным меркалтобензимидазола, двухнедельным курсом в суточной дозе 0,25-0,5 грамм нормализует продукцию оксида азота, а также значительно улучшает показатели иммунного статуса организма.
Таким образом, результаты проведенных исследований выявили существенные изменения в регуляторной системе “Ь-аргинин - азота оксид” под действием имму-номодулируюших препаратов, что следует учитывать при проведении иммунокорригирующей терапии.
Неспецифический иммуногенный шок у мышей и его отмена
Семенова И.В., Кузнецов С.И.
Медицинская академия последипломного образования Санкт-Петербург, Россия
Ранее мы сообщали об открытом нами лабораторном феномене “переноса смерти”. Последний заключается в гибели большинства мышей, получивших сппеноциты от доноров, подвергавшихся воздействиям экстремальных факторов. Патологический процесс, наблюдаемый при этом, мы назвали неспецифическим иммуногенным шоком (НИШ), так как, подобно любому шоку, он имеет стадии возбуждения и торможения, вызывается иммуноцитами, но не требует специфической сенсибилизации. Симптомами НИШ служат: взъерошивание шерсти, гипсрсаливация, отеки дыхательных путей, катаракты. НИШ, как правило, сопровождается неврологической симптоматикой: чаще это судороги, реже—нарушение координации движений, в отдельных случаях—параличи и парезы конечностей, атетоз.
В настоящей работе удалось показать возможность предотвращения феномена “переноса смерти” с полным предупреждением всей его симптоматики. Для этого требовалось предварительное (за 1 мин.) введение животным значительно меньшей дозы тех же донорских спленоцитов, которые в контроле вызывали шок и гибель реципиентов. Результаты были идентичны на самцах и самках как в синген-ной системе (с использованием мышей СВА и С17В16),так и в аллогенной (у беспородных, а также в группе, где донорами служили мыши С„В16, а реципиентами - СВА). В качестве контроля использовалось введение среды 199 перед инъекцией спленоцитов от стрессированных животных, которое не отменяло возникновение указанного феномена. Нами показано также, что защитная доза спленоцитов зависит от степени выраженности симптоматики и вероятности гибели животных в соответствующей контрольной группе.
Таким образом, показана возможность предотвращения лабораторного феномена “переноса смерти”. Немаловажен тот факт, что приобретение устойчивости к летальной дозе спленоцитов от стрессированных мышей происходит очень быстро, практически мгновенно. Хочется надеяться, что выявление способа предупреждения неспецифического иммуногенного шока облегчит дальнейшее уточнение природы этого явления.
Формирование иммунного ответа на белок аллергена ASP F2 начинается с подавления !-Ed рестрикгированного представления антигена
Свирщевская Е.В.
Институт биоорганической химии
им. М.М.Шемякина и Ю.В.Овчинникова РАН
Москва, Россия
Формирование иммунного ответа на белковые антигены начинается с распознавания Т-хелперами комплекса пептид-молекула ГКГС II класса. Показано, что ответ на белки чаще всего рестриктирован преимущественно одной молекулой ГКГС, чаще — молекулой I-А. В данной работе изучали динамику формирования иммунного ответа на рекомбинантный белок аллергена AspJ2. Мышей линии В ALB/c иммунизировали 50 мкг/мышь AspJ2, п.к. в подушечки задних лап. Лимфатические узлы, дренирующие место инъекции, забирали через 6, 12 и 25 дней. В качестве антигенпредставляющих клеток (АПК) использовали макрофаги (Мф) либо В-лимфоциты, для чего Мф выделяли адгезией на пластике, а В-лимфоциты получали из неадгезивной фракции спленоцитов пеннингом на антителах к IgG мыши. Для анализа участия молекул ГКГС II класса использовали антитела к l-Ad либо I-Ad/l-Ed. Распознавание антигена Т-хелперами определяли in vitro по продукции интерлейкина-2 (ИЛ-2). На 6 день после иммунизации в условиях in vitro можно было наблюдать ответ Т-клеток только на антиген, представленный Мф, но не В-клетками. Добавление антител к I-А приводило к значительному усилению продукции ИЛ-2 Т-клетками в ответ на представление антигена Мф и к появлению ответа на антиген, представленный В-клетками. Добавление антител к обеим молекулам ГКГС II класса полностью блокировало продукцию ИЛ-2. Через 12 дней после иммунизации наблюдался трехфазный, по-видимому, полиспецифичный, ответТ-клеток in vitro на антиген, представленный как Мф, так и В-клетками. Антитела к молекуле 1-А полностью отменяли ответ на пептиды, представленные Мф. При ответе на В-клетки, нагруженные антигеном в низкой и средней концентрации (< 10 мкг/мл), ответ также подавлялся а) ггите-лами к I-А. При высокой концентрации антигена (12-50 мкг/ мл) В-клетки были способны представлять антиген в ассоциации с молекулой 1-Е. Далее, к 25 дню, при ответе на Мф формировался затухающий и, по-видимому, моноспеци-фичный иммунный ответ, рестриктированный по молекуле I-А. Ответ выражался in vitro в виде колоколообразной кривой с одним пиком в районе 5 мкг/мл AspJ2. При представлении антигена В-клетками выявлялось два пика ответа. Первый пик наблюдался при концентрации 5 мкг/мл и был I-А рестриктирован, а второй пик наблюдался при высокой концентрации (более 25 мкг/мл) и был рестриктирован по молекуле 1-Е, так как наблюдался и при добавление антител к I-А. Таким образом, формирование иммунного ответа на Asp t2 начинается с подавления ответа Т-клеток, распознающих пептиды антигена, представлен-
