CC BY
56
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Коллектив авторов, 2012
УДК 616.34-007.43-031:031:611.956:612.741.16
ИССЛЕДОВАНИЕ НЕЙРОЭНДОКРИННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РЫБ (Pisces)
Е.С. Савельева, А.Е. Прощина, С.В. Савельев ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН, г. Москва
Проведено иммуногистохимическое исследование иннервации поджелудочной железы шести видов рыб (22 особей) - акула кошачья коричневополосая (Ch. punctatum Müller and Henle, 1838), скат хвостокол речной глазчатый (P. motoro Müller & Henle, 1841), стерлядь (A. ruthenus L., 1758), угорь речной (A. anguilla L., 1758), радужная форель (S. irideus L., 1758), щука обыкновенная (E. lucius L., 1758). Использовались антитела к глюкагону (Lab Vision) и инсулину (Sigma) - для выявления эндокринного компонента поджелудочной железы, нейрон специфической энолазе (Lab Vision), нейрон специфическому ß-III тубулину (Abcam), S-100 (Lab Vision), синаптофизину (Abcam) и нейропептиду Y (Abcam) - для выявления иннервации в железе. Полученные результаты свидетельствуют о наличии двух типов регуляции активности эндокринных и экзокринных клеток. Архаичный механизм построен на прямой регуляции со стороны периферической нервной системы. Другой механизм построен на том, что эндокринные клетки приобрели способность влиять на дифференцировку окружающей ткани за счёт синтеза сигнальных нейропептидов.
Ключевые слова: рыбы, поджелудочная железа, иммуногистохимия, нервная система, нейропептиды.
Исследование организации нейроэндокринного аппарата поджелудочной железы (ПЖ) человека и животных представляет собой одну из актуальных проблем современной морфологии и физиологии углеводного обмена [1, 2, 12]. В настоящее время известно, что в иннервации участвуют парасимпатические, симпатические и сенсорные нервные окончания. Предполагается, что симпатическая нервная система вовлечена в регулировку размеров островков [8] и запускает секрецию гормонов в островке. Было установлено нервное регулирование островка нейропептидами [4, 13]. Однако, эволюционное происхождение различных механизмов регуляции активности эндокринных клеток со стороны нервной системы до настоящего времени не нашло объяс-
нения. Для решения этой проблемы необходимы исследования происхождения иннервации ПЖ у низших позвоночных.
При исследовании ПЖ рыб было выявлено большое разнообразие типов строения как самой железы, так и эндокринной ткани [3, 14]. Исследования иннервации ПЖ рыб в основном посвящены изучению нейропептидов [6]. Так, в работе Pana J.-Z. et al. в 1992 году детально описана структура и локализация NPY в островках, экзокринной ткани и в эпителии протоков ПЖ катрана (Squalus acanthias) [10]. При этом работы по исследованию нервного аппарата ПЖ рыб крайне малочисленны и являются сопутствующими к основным исследованиям [9, 11]. Таким образом, вопрос о происхождении иннервации эндокринной части
ПЖ первичноводных животных, в частности рыб, остается актуальным и в настоящее время.
Материалы и методы В работе нами были использована ткань ПЖ 22 экземпляров следующих видов рыб: акула кошачья коричневопо-лосая (Cb. punctatum Müller and Henle, 1838), скат хвостокол речной глазчатый (P. motoro Müller & Henle, 1841), стерлядь (A. rutbenus L., 1758), угорь речной (A. anguilla L., 1758), радужная форель (S. irideus L., 1758), щука обыкновенная (E. lucius L., 1758).
Результаты и обсуждение
Сравнительное исследование морфофункциональной организации ПЖ рыб показало основные эволюционные этапы становления её нервного аппарата. Наиболее архаичной конструкцией обладает ПЖ акул. Гистологическое и иммуноги-стохимическое исследования ПЖ акулы (Ск. рып^аШт) позволили установить, что железа имеет паренхиматозное строение, в ней нет ясных границ и четко выраженной базальной мембраны вокруг скоплений экзокринных клеток. Эндокринная ткань представлена отдельными клетками, образующими эндокринные поля. Исследование реактивности ПЖ акулы к ней-
Эвтаназия животных проводилась согласно международным правилам [5, 7]. Для изучения иннервации эндокринной ткани ПЖ было предпринято иммуноги-стохимическое исследование на смежных срезах (5-10 мкм) по выявлению моноклональными и поликлональными антителами инсулина, глюкагона, нейрон-специфической энолазы (К8Б), Р-Ш тубу-лина, 8-100, синаптофизина и нейропептида У (КРУ). Список использованных антител, их разведения и иммунореактивность представлены в таблице 1.
рон-специфической энолазе (К8Б) выявило экспрессию маркера в зонах локализации секретирующих эндокринных клеток (Рис. 3, Б1). Также наблюдается позитивная реакция в зоне эндокринных протоков, в стенках артериол и венул. Иммуно-позитивная реакция на Р-Ш тубулин (Рис. 1, А) выявлена в нервах и нервных окончаниях, окружающих артериолы, а также в единичных нервных клетках, локализованных к эндокринной паренхиме. Имму-нопозитивная реакция с антителами к 8100 и КРУ также наблюдалась в оболочке ПЖ и стенках артериол. Таким образом, у этой группы животных собственный нервный аппарат поджелудочной железы
х. антитела виды рьіоЧ,, ß-III тубулин Abcam (1:500) NSE Abcam (1:400) Синапто- физин Abcam (1:650) NPY Abcam (1:500) S-100 Lab Vision (1:150) к Инсулину Морск. свинки Sigma (1:300) к Глюкагону Кролик по-ликл. Lab Vision(1:100)
акула (Ch. Punctatum) + + + + + + +
скат (P. motoro) + + + + - + +
стерлядь (A.ruthenus) + + + + + + +
угорь (A. anguilla) + - + + + + +
форель (S. Irideus) + + + + - + +
щука (E. Lucius) + - + + + + +
отсутствует, однако наблюдается некоторое количество, вероятно, эмбрионально депонированных, нервных клеток. Функцию иннервации органа выполняют нервные волокна, проникающие как в эндокринную, так и экзокринную части железы в составе сосудисто-нервных пучков, ха-
рактерных для всех позвоночных. Войдя в железу вместе с артериоллами, эти волокна формируют локальные зоны иннервации, которые не имеют выраженных контактов ни с эндокринными, ни с экзок-ринными клетками.
f -. •: ' • - V. ?-*Ч ••• V • \ »• . *..> -. • " * * % - -Т- Г \ 4 . ■ - / «. Y ^ —— У
* t гЧ.У * • * 4 / • . . . '* * І 1 W . _ ,J ’ f*t % Н • і - ^ '
^ *1 ^ т ^ .gl .w з* - «¿л •bJf- 'JSSiíCF ;JL ■ *» . v . • «0^ & " * » ъ ъ 'У?' > Щ / і • _ -ц? Д w jiSílii
Рис. 1. Иммуногистохимическая реакция с антителами к p-III Тубулину в поджелудочной железе рыб:
А - акулы (Ch. punctatum) х 20; Б - ската (P. motoro), В - стерляди (A. ruthenus), Г - угря (A. anguilla), Д - форели (S. irideus), Е - щуки (E. lucius) х 40
У стерляди наблюдается столь же архаичный вариант иннервации железы. Заметным отличием от акулы является незначительное связывание нейральных маркёров с эндокринными скоплениями клеток, что характерно для млекопитающих. У стерляди обнаружены не паренхи-
матозные скопления экзокринных и эндокринных клеток, а полноценные островки Лангерганса и ацинарная ткань с выраженными протоками. При этом нервный аппарат представляет собой разветвления волокон, отделившихся от сосудисто-нервного пучка, как и у акул. Имму-
ногистохимическая реакция с антителами к нейрон-специфическому Р-Ш тубулину выявлена в нервах и их отростках, принадлежащих сосудам и каппилярам, также наблюдалась слабая реактивность эндокринных кластеров и отдельных клеток (рис. 1, В). Однако в островках реакция на антитела к Р-Ш тубулину была негативной. Иммуногистохимическая реактивность в ПЖ стерляди к антителам 8-100 была выявлена в единичных клетках и нервных окончаниях, окружающих островки и артериолы (рис. 3, В3). Иммуно-гистохимическое окрашивание антителами к КРУ (рис. 2, Б) было позитивным в нервах и их отростках в ацинарной ткани, а также в зонах локализации глюкагон- и соматостатин-позитивных клеток.
В результате гистологического исследования ПЖ ската установлено, что эндокринная ткань представлена лентовидными островками и кластерами клеток. Иммунопозитивная реакция с антителами к 8-100 (рис. 3, В1) наблюдалась как в нервах между ацинусов, так и вдоль сосудов и капилляров, пронизывающих поджелудочную железу ската. Иммуноги-стохимическая реакция с антителами к КРУ (рис. 2, А) выявлена в зонах локализации глюкагон-позитивных клеток и нервных окончаниях. Иммуногистохими-ческая реакция с антителами к нейрон-специфическому Р-Ш тубулину (рис. 1, Б) выявлена в нервах и их отростках, находящихся в эндокринной ткани ПЖ ската.
Рис. 2. Иммуногистохимическая реакция с антителами к нейропептиду Y в поджелудочной железе рыб:
А - ската (P. motoro), А1 х 20, А2 х 40; Б - стерляди (A. ruthenus), х 40; В - угря (A. anguilla), х 40, В1 - островок
среднего размера и меленький островок, В2 - маленькие островки; Г - форели (£. irideus), х 40
Позитивное окрашивание на Р-Ш ту-булин позволяет охарактеризовать взаимодействие эндокринной ткани и нервного аппарата как нейроэндокринные комплексы. Также обнаружены одиночные клетки с немногочисленными отростками, располагающиеся преимущественно в эндокринной ткани. Таким образом, у скатов система иннервации усложняется появлением отдельных нервных клеток, расположенных в строме поджелудочной железы. Это первое эволюционное формирование обособленных нейронов, специализированных для функционального обслуживания ПЖ. Следовательно, можно заключить, что происхождение нервного аппарата ПЖ не зависит от уровня дифференцировки и морфологического обособления эндокринной и экзокринной ткани. Эти данные позволяют предположить, что эволюционное становление иннервации ПЖ происходило преимущественно под влиянием развития специфических механизмов регуляции углеводного обмена.
Еще более сложный вариант организации нервного аппарата ПЖ выявлен у угря с развитый структурой островков и ацинарной ткани.
Иммунопозитивная реакция с антителами к нейрон-специфическому Р-Ш тубулину (рис. 1, Г) выявлена в нервах, пронизывающих ацинарную ткань ПЖ, но отсутствовала в островках. Аналогичное распределение можно наблюдать при иммунопо-зитивной реакции на 8-100 в ПЖ стерляди. Иммунопозитивная реакция с антителами к К8Е обнаружена в единичных клетках островков и некоторых нервных окончаниях, отходящих от артериол. КРУ- позитивная реакция (рис. 2, В) наблюдается в нервах, сопутствующих артериям, единичных клетках в ацинарной ткани и островках.
Распределения КРУ-позитивных клеток в островках различно. В небольших островках (до 200 мкм диаметром) они распределяются как по периферии, так и по всему объему островков. В островках около 300 мкм диаметром клетки преимущественно распределены по периферии, но единичные КРУ-позитивные клетки встре-
чаются в центре островков. В крупных островках диаметром более 320 мкм имму-нопозитивная реакция с антителами к КРУ наблюдалась или по периферии островков, или полностью отсутствовала. Иммунопо-зитивная реакция с антителами к К8Е тоже обнаружена в островках. Таким образом, при отсутствии специализированных нейронов ПЖ их функции по синтезу нейральных белков начинают выполнять эндокринные клетки. По-видимому, нехарактерные для ПЖ нейропептиды появились в эволюции для контроля за секреторной или морфогенетической активностью эндокринных клеток.
Наиболее сложная организация ПЖ была обнаружена у щуки и форели. Для этих рыб характерна архаичная иннервация железы в сочетании с глубокой дифферен-цировкой эндокринных островков по топологической специализации синтеза белков нервной ткани. В этих случаях Р-Ш тубу-лин (рис. 1, Д) выявляется по всему объему островков. Более того, КРУ-позитивная реакция была обнаружена у форели в зонах локализации глюкагон-позитивных клеток
- по периферии островков (рис. 2, Г), а у щуки во всех клетках островка Лангерган-са. К8Е- позитивная реакция у форели отмечалась в тонких нервах и их отростках, а также внутри мелких островков. Реакция на антитела к нейрон-специфической эно-лазе в ПЖ щуки была негативной. Эти данные подтверждают уже высказанное предположение о возможности различных вариантов нейропепдидной регуляции углеводного обмена.
Выводы
По-видимому, у низших позвоночных в процессе эволюции появилось два механизма косвенного контроля за функциональной активностью ПЖ. Наиболее архаичный механизм построен на прямой регуляции активности эндокринных и экзокринных клеток со стороны периферической нервной системы. Этот вариант был обнаружен у акулы, стерляди и ската, в ПЖ которых были найдены специализированные нервные клетки, являющиеся
Рис. 3. Иммуногистохимическое исследование поджелудочной железы рыб (антитела к синаптофизину, NSE, S-100): А - синаптофизин-позитивная реакция в ПЖ: А1 - ската (P. motoro), х 20; А2 - щуки (E. lucius), х 40; Б - NSE-позитивная реакция в ПЖ, х 40: Б1 - акулы (Ch. punctatum), Б2 - форели (S. irideus); В - позитивная реакция с антителами к S-100, х 40: В1 - ската (P. motoro), В2 - щуки (E. lucius), В3 - стерляди (A. ruthenus); В4 - позитивная реакция с антителами к S-100 в ПЖ щуки (E. lucius) х 20
Другой механизм построен на том, что эндокринные клетки приобрели способность влиять на дифференцировку окружающей ткани за счёт синтеза сигнальных нейропептидов. Сам принцип взаимного влияния секреторных клеток при помощи нейропептидов пока не известен, что требу-
ет дополнительных исследований.
Литература
1. Нейроэндокринные комплексы в поджелудочной железе нутрии (МуосаБйг соуриБ) (иммуногистохимическое исследование) / Ю.С. Кри-
вова [и др.] // Морфология. - 2009. -Т. 135, №3. - С. 59-62.
2. Неврогенные механизмы развития сахарного диабета 1-го типа / С.В. Савельев [и др.] // Архив патологии. - 2008. - Т. 70, №6. - С. 9-13.
3. Яглов В.В. Морфология эндокринной части поджелудочной железы костистых рыб / В.В. Яглов // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1978. - Т.74, №1. - С. 111-115.
4. Ahre'N.B. Neuropeptides and the Regulation of Islet Function / N.B. Ahre, N. Wierup, F. Sundler // Diabetes. - 2006.
- Vol. 55, №2. - Р. 98-107.
5. Carbone L. Pain in Laboratory
Animals: The Ethical and Regulatory Imperatives / L. Carbone // PLoS ONE (www.plosone.org). - 2011. - Vol. 6, Issue 9. - P. e21578.
6. El-Salhy M. Immunocytochemical
investigation of the gastro-enteropancreatic (GEP) neurohormonal peptides in the pancreas and
gastrointestinal tract of the dogfish Squalus acanthias / M. El-Salhy // Histochemiatry. - 1984. - Vol. 80. - Р. 193-205.
7. Improving Bioscience Research
Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research / C. Kilkenny [et al.] // PLoS Biology
(www.plosbio-logy.org). - 2010. - Vol. 8, Issue 6. -
Р. e1000412.
8. Vagal control of p-cell proliferation / J. Lausier [et al.] // Am J Physiol Endocrinol Metabolism. - 2010. - Vol. 299. - P. E786-E793.
9. Noorden S. Vasoactive intestinal
polypeptide-like immunoreactivity in
nerves of the pancreatic islet of the teleost fish, Gillichthys mirabilis / S. Noorden,
G.J. Patent // Cell and Tissue Research.
- 1980. - Vol. 212, №1. - P. 139-146.
10. The primary structure of peptide Y
(PY) of the spiny dogfish, Squalus acanthias: Immunocytochemical
localisation and isolation from the pancreas / J.-Z. Pana [et al.] // Comparative Biochemistry and Physiology, Part B: Comparative
Biochemistry. - 1992. - Vol. 102, Issue 1. - P. 1-5.
11. Putti R. An immunocytochemical study of intrapancreatic ganglia, nerve fibres and neuroglandular junctions in Brockmann bodies of the tompot blenny (Blennius gattoruggine), a marine teleost / R. Putti, M. Maglio, G. Odierna // The Histochemical Journal. -2000. - Vol. 32. - P. 607-616.
12. Innervation Patterns of Autonomic Axons in the Human Endocrine Pancreas / R. Rodriguez-Diaz [et al.] // Cell Metabolism. - 2011. - Vol. 14. -P. 45-54.
13. Teff K. Townsend R. Early phase insulin infusion and muscarinic blockade in obese and lean subjects / K. Teff // American Journal Physiology Regul Integr Comp Physiol. - 1999. -Vol. 277. - P. R198-R208.
14. Youson J. H. Ontogenetic and
Phylogenetic Development of the
Endocrine Pancreas (Islet Organ) in Fishes /
J.H. Youson, A.A. Al-Mahrouki // General and Comparative
Endocrinology. - 1999. - Vol. 116. - P. 303-335.
INVESTIGATION OF PANCREAS NEUROENDOCRINE ORGANIZATION OF SOME FISHES’ SPECIES (Pisces)
E.S. Savelieva, A.E. Proshchina, S.V. Saveliev
Immunhistochemical analysis of endocrine pancreas innervation of fishes was spent on 6 species (22 specimen) - Brown-banded cat shark (Ch. punctatum Müller and Henle, 1838), Motoro Sting Ray (P. motoro Müller & Henle, 1841), Sterlet (A. ruthenus L., 1758), Anguilla river (A. anguilla L., 1758), Trout rainbow (S. irideus L., 1758), Pike usual (E. lucius L., 1758). Antibodies to glucagon (Lab Vision), insulin (Sigma), neuron specific enolase (Lab Vision), neuron specific ß-III tubulin (Abcam), S-100 (Lab Vision), synaptophysin (Abcam) end neuropeptide Y (Abcam) were used for immunhistochemical study. Two mechanism of control functional activity of pancreas were detected. One of them (archaic mechanism) is under construction on immediate regulation of activity endocrine end exocrine cells and functions by means of peripheral nervous system. The other operates by means of synthesis of signal endocrine cells’ neuropeptides.
Key words: fishes, pancreas, immunohistochemistry, nervous system, neuropeptides.
Савельева Екатерина Сергеевна - научный сотрудник лаборатории развития нервной системы НИИ Морфологии Человека РАМН.
117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д. 3.
E-mail: [email protected].
Прощина Александра Евгеньевна - к.б.н., доц., ст. науч. сотрудник лаборатории развития нервной системы НИИ Морфологии Человека РАМН.
117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д. 3.
E-mail: [email protected].
Савельев С.В. - д.б.н., проф., заведующий лабораторией развития нервной системы ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН.
E-mail: [email protected].
Исследование поддержано специализированным фондом управления целевым капиталом для поддержки научно-исследовательских работ в области биологии и медицины
« Фундаментальны й ».
