Исследование неферментативного взаимодействия селена и серебра с цистеином и глутатионом с помощью приборного комплекса МХ-5310 Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

ISSN 0868-5886

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2008, том 18, № 4, c. 79-87

. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИИ. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ДАННЫХ, МЕТОДОЛОГИЯ, ПРИМЕНЕНИЕ

УДК[577.1: 613.6] :: [615.9: 543.632: 585]

© А. В. Новиков, Г. Н. Кошелева, Р. А. Бубляев, А. В. Манойлов,

Ю. П. Козьмин, Н. В. Краснов, О. А. Миргородская

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕФЕРМЕНТАТИВНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ СЕЛЕНА И СЕРЕБРА С ЦИСТЕИНОМ И ГЛУТАТИОНОМ С ПОМОЩЬЮ ПРИБОРНОГО КОМПЛЕКСА МХ-5310

С помощью разработанного в Институте аналитического приборостроения РАН приборного комплекса, включающего времяпролетный масс-спектрометр с электрораспылением МХ-5310 и жидкостной хроматограф Милихром А-02, было проведено исследование взаимодействия селена (8е) с элементами биологических систем на примере цистеина (СуБ) и глутатиона (в8И). Выявлено образование двух типов продуктов — дисульфидов и 8е-дисульфидов и определены условия, позволяющие изменять соотношения концентраций между этими типами продуктов при взаимодействии 8е с в8И. Проведено сравнение процессов взаимодействия 8е с в8И, СуБ, и смеси в8И с СуБ, которое выявило конкуренцию за 8е у таких сульфгидрильных соединений. Определено также, что в конкурентных условиях не происходит образования 8е-дисульфида СуБ, но в значительной степени образуется смешанный дисульфид без 8е и с 8е. Показано, что образование смешанного 8е-дисульфида может протекать через замещение в8И на СуБ в симметричном 8е-дисульфиде в8И. Можно полагать, что именно селективность замещения лежит в основе регуляции физиологических процессов с участием 8е и различных тиолов в биологических средах.

ВВЕДЕНИЕ

Антиоксидантная роль селена (8е) впервые была выявлена английским биохимиком А. Дипло-ком в 1970 г. [1]. В основе этого процесса лежит взаимодействие 8е с глутатионом (08И) [2].

08И присутствует в клетке в восстановленном состоянии (8И) в концентрации около 5 мМ. Фактически такая высокая концентрация 08И в клетке приводит к тому, что он может восстанавливать любую дисульфидную связь (8-8), образующуюся между цистеинами цитозольных белков. При этом восстановленная форма 08И превращается в окисленную форму 08И — дисульфид глутатиона (0880). 0880 может быть восстановлен под действием фермента глутатионредуктазы, который постоянно находится в клетке в активном состоянии и индуцируется при оксидативном стрессе [1]. Важную роль в этих процессах выполняет 8е, участвуя главным образом в функционировании 8е-зависимых глутатионпероксидаз. Было показано, что процесс окисления 08И в безфер-ментативной среде ускоряется в присутствии 8е (обычно в виде 8е02). При этом зарегистрировано образование двух типов продуктов — окисленной формы 08И (08-80) и 8е-дисульфида глутатиона (08-8е-80) [2]. Представляло интерес в рамках настоящей работы изучить особенности этого неферментативного взаимодействия 8е с 08И, а также влияние на этот процесс другого сульф-гидрильного соединения — цистеина (СуБ), при-

сутствующего в сопоставимых с 08И количествах во многих биологических средах [1-2].

В связи с тем что постулируется участие 08И в дезинтоксикации тяжелых металлов [3], представлялось целесообразным проверить возможное конкурентное участие в этом процессе 8е на примере изучения воздействия на этот процесс ионов серебра, относящегося также к классу тяжелых металлов.

Для изучения особенностей неферментативного взаимодействия 08И и СуБ с 8е (в виде 8е02) и в том числе в присутствии ионов серебра использовались два инструментальных метода: масс-спектрометрия с электрораспылением (Б81-о-Т0Р-М8) — для качественной и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) — для количественной оценок.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Независимое взаимодействие 8е™ с С8И и 8е™ с Су8

:Для исследования взаимодействия 8е1У с 08И и 8е с СуБ использовались смеси этих соединений в различных концентрациях. На рис. 1 представлены масс-спектры реакционных смесей, полученных при взаимодействии 8е1У с 08И (а) и 8е1У с СуБ (б) в молярном соотношении 1:1 в водной среде.

Рис. 1. Е81-масс-спектры реакционных смесей, полученных при взаимодействии 8е1У с в8И (а) и 8е1У с Суз (б)

Из рис. 1 следует, что в реакционных смесях образовались продукты окисления, а именно дисульфид глутатиона (GS-SG), представленный в масс-спектре двухзарядным ионом с miz = 307.08 и однозарядным ионом с miz = 613.16 (рис. 1, а), и дисульфид Cys (Cys-Cys) в виде только однозарядного иона с miz = 241.04 (рис. 1, б).

Кроме того, наблюдается образование Se-содержащих продуктов для GSH (GS-Se-SG), представленных в масс-спектре двухзарядным ионом с miz = 307.3 и однозарядным ионом с miz = 693.16 (рис. 1, а), а для Cys-содержащих продуктов — Se-дисульфида (Cys-Se-Cys) (рис. 1, б). Все Se-содержащие продукты имеют изотопное распределение, характерное для Se.

В настоящей работе проведен количественный анализ образующихся продуктов в смеси SeIV с GSH с помощью ВЭЖХ. Результаты обработки полученных данных при различных количествах SeIV и GSH в водной среде представлены в табл. 1. Там же представлены данные по спонтанному окислению GSH без SeIV. Концентрации всех продуктов выражены в процентах, рассчитанных из площадей соответствующих хроматографических пиков, что отражает распределение в них глута-тиона.

Из табл. 1 видно, что уже через 5 мин наблюдается значительная убыль GSH и появление

продуктов окисления, основным из которых при соотношениях с 8е и 08И 1:1 и 1:2 является 08-8е-80. Отметим, что контрольный эксперимент показал, что в тех же условиях, но без 8е окисление 08И не наблюдается по крайней мере в течение часа. Отметим, что доминирование образования 08-8е-80, возникающее на первых 5 минутах, сохраняется в течение длительного времени (~20 ч).

Как показывают результаты представленные в табл. 2, в присутствии бикарбоната аммония (рН 7.4) ускоряется как реакция 08И с 8е, так и скорость спонтанного окисления. В 1 %-й уксусной кислоте скорость взаимодействия с 8е замедляется. При этом как в водной среде, так и в присутствии уксусной кислоты, спонтанное окисление 08И в отсутствие 8е не наблюдается. Из анализа полученных результатов может быть сделан вывод о том, что увеличение в продуктах реакции доли окисленной формы (08-80) при переходе от кислой к щелочной среде связано с изменением концентрации непротонированных сульфгидрильных групп 08И, необходимых для образования этой формы, в то время как образование 08-8е-80 не зависит от рН. В конечном итоге это приводит к перераспределению конечных продуктов реакции и значительному изменению соотношения 08-80 и 08-8е-80.

№ Исходные реагенты Время реакции, мин Состав продуктов, содержащих глутатион, %

п/П SeIV, мМ GSH, мМ GSH GS-SG GS-Se-SG

1 0.33 0.33 5 9 27 64

2 0.165 0.33 5 31 21 48

3 0.165 0.33 60 5 25 70

4 0.165 0.33 1140 0 26 74

5 0 0.33 60 100 0 0

Табл. 1. Количественные характеристики реакционных смесей и продуктов реакции

Табл. 2. Состав реакционной смеси окиси селена и глутатиона при соотношении 1: 1 в разных средах

№ п/п Реакционная среда Время реакции, мин Состав продуктов, содержащих глутатион, %

08И 08-80 08-8е-80

1 Вода 5 9 27 64

2* — " — 60 100 0 0

3 20 мМ ^ИСОз 5 0 69 з1

4* 20 мМ ^ИСОз 5 96 4 0

5 1 % СИзСООИ 14 16 20 64

6 1 % СИзСООИ 90 0 21 79

7* 1 % СИзСООИ 60 100 0 0

Примечание. * — контроль без селена.

Вй

вя-Ср

4:г и

Ul.ll

И . I ■

(СШС)

.<47.16

ш

т 19

а

СМе-Ср

$07.19 сх-ыс

Шв ШЗЗ

61.138 I

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 550 700 750

m/z

Бй

100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750

m/z

Рис. 3. Е81-масс-спектры реакционных смесей, полученных при взаимодействии 8е1У с 08И и СуБ при экви-молярном соотношении концентраций 8е1У и сульфгидрильных соединений 1:1:1 (а) и при концентрации 8е, в 2 раза уменьшенной — 1: 2 : 2 (б)

Конкурентное взаимодействие сульфгидрильных групп цистеина и глутатиона с селеном

Свободный цистеин, являющийся предшественником глутатиона, присутствует в биологических жидкостях одновременно с глутатионом. Оба

соединения являются компонентами антиокси-дантной защиты организма человека. Наличие в каждом из них свободной сульфгидрильной группы позволяет обоим соединениям конкурировать друг с другом при взаимодействии с селеном.

В настоящей работе были проведены масс-спектрометрические и хроматографические иссле-

дования взаимодействия 8е1У с 08Н и СуБ при различных концентрациях 8е1У и сульфгидрильных соединений.

На рис. 3 представлены результаты масс-спек-трометрической детекции смесей СуБ и 08Н с 8е в различных концентрациях. Из рис. 3 видно, что в обоих случаях наиболее интенсивным из дисульфидов является ион с т/г 427.24, соответствующий смешанному дисульфиду 80-СуБ. Кроме того, на масс-спектрах присутствуют ионы, соответствующие СуБ-СуБ и 08-80. В обоих спектрах также регистрируется 8е-дисульфиды 08-8е-80 и 08-8е-СуБ в виде одно- и двухзарядных ионов

и "следы" иона 8е-дисульфид-цистеина (СуБ-8е-СуБ) даже в смеси с наибольшей концентрацией 8е.

При хроматографии смесей 8е^ с 08Н и СуБ (рис. 4) регистрируются только продукты, содержащие глутатион, поскольку как сам цистеин, так и его окисленная форма спектрофотометрически не детектируются. Наличие продуктов в хромато-графических пиках, указаных на этих рисунках, подтверждено масс-спектрометрически. Отметим, что в пиках, подходящих для количественного анализа, не зарегистрирован продукт 80-СуБ, однако его концентрация может быть рассчитана из баланса по 08Н.

ОЯ-Яе-ЯО

а

с,кн

СЛ-Ье-Суя

Г/Л -5 >ЛГ7

б

GS-.SC |

Рис. 4. Хроматограммы реакционных смесей, полученных при взаимодействии 8е с в8Н и Суз при эк-вимолярном соотношении концентраций 8е1У и сульфгидрильных соединений 1:1:1 (а) и при концентрации 8е, в 2 раза уменьшенной — 1: 2 : 2 (б)

Табл. 3. Распределение продуктов реакции Суз, в8Н и 8е в водных смесях при различных соотношениях реагентов

№ п/п Исходные реагенты, мМ Состав продуктов, содержащих глутатион, %

8е 08Н СуБ ¿880 08-СуБ 088е80 08-8е-СуБ

1 3.33 3.33 3.33 2.0 14.3 37.9 45.8

2 1.66 3.33 3.33 2.5 31.4 31.8 34.3

3 0.83 3.33 3.33 32.0 28.5 16.4 23.1

4 0.33 3.33 3.33 5.1 68.6 16.6 9.8

С учетом вышеупомянутого из хроматографи-ческих данных было рассчитано содержание продуктов, содержащих GSH (табл. 3). Из представленных в таблице данных следует:

• содержание Se-дисульфидов с GSH (GS-Se-SG и GS-Se-Cys) сопоставимо между собой, но выше, чем соответствующих дисульфидов (GS-SG и GS-Cys);

• концентрация GS-Cys существенно превышает концентрацию GS-SG;

• соотношение концентраций обоих типов дисульфидов и Se-дисульфидов выравнивается при уменьшении концентрации в среде.

Для интерпретации полученного набора несимметричных продуктов, образующихся при одновременном взаимодействии с Se, были проведены специальные эксперименты для оценки возможности последующих превращений симметричных продуктов реакции с участием исходных сульфгидрильных соединений. Для этого первоначально была осуществлена реакция GSH c SeIV до полного превращения GSH в смесь окисленного глутатиона и его Se-дисульфида (рис. 5, а). Далее к реакционной среде, содержащей только продукты GS-SG и GS-Se-SG добавлялись в эквимоляр-ных количествах либо GSH, либо Cys, либо их

смесь в равных соотношениях. Хроматографиче-ский анализ полученных реакционных смесей после 2.5 ч инкубации представлен на рис. 5 (концентрации исходных реагентов и концентрации дополнительно вносимых в реакционную смесь сульфгидрильных соединений приведены в разделе "Материалы и методы").

Анализируя полученные результаты, представленные на рис. 5, можно отметить, что введение дополнительной порции 08И привело к дополнительному образованию 08-80 и 08-8е-80 (б), что указывает на достаточное количество 8еО2 в реакционной среде. Аналогичным образом продолжается реакция и при дополнительном введении смеси 08И и СуБ (в). Однако при внесении одного СуБ в реакционную среду в отсутствие 08И наблюдается исчезновение 08-8е-80 (10.1 мМ), и при этом образуется эквивалентное количество смешанного 8е-дисульфида — 08-8е-СуБ (9.5 мМ).

Таким образом, представленные выше эксперименты подтверждают наличие обменных процессов с участием 8е-дисульфидов при наличии соединений со свободными сульфгидрильными группами со скоростями, сопоставимыми с образованием основных продуктов. При этом в процессе замещения

Времн, ьшн Время, мин

Рис. 5. Хроматограммы реакционных смесей до (а) и после дополнительного введения в реакционную среду в8И (б), СуБ (в) и их смеси (г)

г/л'-л^-лт,

б

( 7Л-Л'б

- "7 "Д г \ Ж-Яе- 8С

А1 №

в

ГТЛ'-Л'е-ЛУ?

бл-л'г;

4.9 5.6 Время, мин

3.5 4.2 4.9 5.6 6.3

Бремя, мин

Рис. 6. Хроматограммы реакционных смесей при одновременном добавлении AgNO3 и Se к GSH (а) и при добавлении AgNO3 после взаимодействия GSH с Se

в симметричном 8е-дисульфиде 08 на Cys свободный 08Н не регистрируется, поскольку он вступал бы в реакцию с 8е02 с образованием тех же самых продуктов, которые имелись в реакционной среде до внесения Cys. В конечном итоге система через 2.5 ч приходит к некоторому равновесию, которое представлено набором продуктов, обозначенных на рис. 5, г.

Конкурентное взаимодействие сульфгидрильных групп глутатиона с селеном и ионами серебра

Как уже отмечалось выше, ряд биологически активных соединений и в том числе глутатион принимают активное участие в дезинтоксикациии, вызванной присутствием ионов тяжелых металлов. Такое действие может быть обусловлено взаимодействием с металлами сульфгидрильных групп 08Н. Можно предположить, что и другие компоненты биологических сред, в том числе и селен, могут корректировать этот процесс. В связи с этим нами были проведены эксперименты по выяснению влияния ионов металлов на взаимодействие глутатиона с селеном на примере ионов серебра.

Эксперименты проводились следующим образом: в раствор со смесью селена и азотнокислого серебра добавлялся 08Н. Далее реакционная смесь анализировалась с помощью ВЭЖХ по методике, описанной в предыдущем разделе. На рис. 6 представлены результаты хроматографии

исследованных смесей; анализа хроматограмм — в табл. 4.

В экспериментах контролировалось образование двух продуктов: 08-80 и 08-8е-8О. Отметим, что ни хроматографически, ни масс-спектрометри-чески продукты 08Н с ионами серебра не регистрируются, поскольку образование данного продукта приводит к потере растворимости GS-Ag.

Вместе с тем, как следует из результатов, представленных в табл. 4, при одновременном введении ионов серебра с продуктами реакции пропорционально уменьшается количество двух продуктов 08-80 и 08-8е-80.

Введение ионов серебра после взаимодействия 08Н с селеном не изменяет концентрации продуктов 08-80 и 08-8е-80. Также было обнаружено, что ионы серебра не взаимодействуют с 8е-ди-сульфидами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проделанные эксперименты свидетельствуют о том, что даже неферментативные реакции селена с глутатионом и цистеином представляют собой совокупность сложных процессов, приводящих к образованию набора продуктов, которые продолжают претерпевать изменения при изменении состава реакционной среды. Этим и обусловливается регуляция различных процессов, протекающих с участием 08Н и 8е

а

Табл. 4. Состав реакционных смесей после дополнительного введения азотнокислого серебра в концентрациях от 0 до зз мМ в реакционную среду, состоящую из зз мМ глутатиона и зз мМ селена

№ п/п AgNO3, мM GS-SG и GS-Se-SG GS-Ag, мМ

мМ %

1 0 0.333 100 0

2 0.0165 0.32 96 0.013

3 0.0494 0.28 84 0.053

4 0.0825 0.25 76 0.083

5 0.165 0.08 23 0.253

6 0.333 0 0 0.333

7 0.333* 0.333 100 0

Примечание. * — в течение з0 мин проведена прединкубация в8И с 8е перед добавлением азотнокислого серебра.

в биологических средах, в которых активно участвует и ряд ферментов [4-6]. Отметим, что реальные биологические среды являются более многокомпонентными по набору соединений с сульф-гидрильными группами. Они представлены как в белках и пептидах, так и в виде низкомолекулярных соединений, таких как гомоцистин, концентрация которого при ряде патологий существенно превосходит концентрацию 08И [7].

тонитрила от 2 до 90 % (по объему) в растворе 0.25 % муравьиной кислоты со скоростью 100150 мкл/мин. При проведении анализа объем анализируемой пробы составлял 10 мкл, скорость подачи раствора образца — 2 мкл/мин. Площади пиков вычисляли, учитывая, что коэффициент молярной экстинкции глутатиона равен 1.5-107.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы вещества: глута-тион восстановленный; глутатион окисленный; L-цистеин 99 % (Sigma); диоксид селена (ООО Вектон); муравьиная кислота (Merck); ацетонит-рил (НПК Криохром).

Экспериментальные работы по разработке методики исследования влияния ионов тяжелых металлов и селена на биологические объекты проводились на приборе МХ-5310, оборудованном электрораспылительным источникам ионов (elec-trospray ionization, ESI) и времяпролетным масс-анализатором (TOF) с ортогональным вводом ионов, разработанным в Лаборатории биомедицинской масс-спектрометрии ИАнП РАН. Все спектры получены в режиме детектирования положительных ионов.

Хроматографию проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе Милихром А02 (Эконова, Новосибирск). Хроматографическая колонка размером 2 х 75 мм заполнена сорбентом Prontosil 120-5С18АО (Bischoff, Германия). Элю-цию осуществляли градиентом концентрации аце-

1. Shchrauser H. W. Selenium // Elements and their Compounds in the Environment. V. 3: Nonmetals / Ed. Merian et al. Wiley-VCH Verlag, 2003. P.100-106.

2. Новиков А.В., Бубляев Р.А., Краснов Н.В., Козьмин Ю.П., Кураева Т.Е., Миргородская О.А. Изучение конкурентного взаимодействия ионов серебра с цистеинсодержащими пептидами и серосодержащими аминокислотами с помощью ESI-MS // Научное приборостроение. 2007. Т. 17, № 4. C. 29-36.

3. Вапиров В.В., Шубина М.Э., Вапирова Н.В., Беличенко В.И., Шубин И.В. Селен. Некоторые аспекты химии, экологии и участия в развитии патологии (обзор). Петрозаводск: ПетрГУ, 2000. 68 c.

4. Braga P., Montes-Bayon M., Alvarez J., et al. Characterization, Biological Interactions and in-vivo Detection of Selenotrisulfide Derivatives of Glutathion, Cysteine and Homocysteine by HPLC-ICP-MS // J. Anal. At. Spectrom. 2004. V.19. P.1128-1133.

5. Armstrong R.N. Structure, Catalytic Mechanism, and Evolution of the Glutathione Transferases //

Chem. Res. Toxicol. 1997. V. 10, N 1. P. 2-18.

6. Kolesnichenko L.S. et al. Glutathione System in Erythrocytes and Blood Plasma in Strokes and Dyscirculatory Encephalopathy // Biochemistry. Supplemental Series B: Biomedical Chemistry. Moscow, 2008. V. 2, N 2. P. 194-197.

7. Sikora J., Magnucki J., Zietek J., et al. Homocysteine Serum Concentration and Uterine Artery Color Doppler Examination in Cases of Recurrent Miscarriages with Unexplained Etiology // Neuro endocrinology letters. 2007. V. 28, N 4. P. 502506.

Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург (Новиков А.В., Кошелева Г.Н., Буб-ляев Р.А., Манойлов А.В., Краснов Н.В., Миргородская О. А.)

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

(Козьмин Ю.П.)

Материал поступил в редакцию 14.10.2008.

STUDY OF NONENZYMATIC SELENIUM AND SILVER INTERACTION WITH CYSTEINE AND GLUTATHIONE USING MX-5310 COMPLEX

A. V. Novikov1, G. N. Kosheleva1, R. A. Bublyaev1, A. V. Manoilov1, 2 1 1 Yu. P. Kozmin , N. V. Krasnov , O. A. Mirgorodskaya

1 Institute for Analytical Instrumentation RAS, Saint-Petersburg 2Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS, Mosrnw

A study of the interaction of selenium (Se) with elements of biological systems cysteine (Cys) and glutathione (GSH) as an example was performed. The study was carried out using complex which includes the liquid chromatograph Milichrom А02 and time-of-flight mass spectrometer with electrospray ionization МХ-5310, developed in the Institute for Analytical Instrumentations RAS. Result of this study was a new scheme of chemical reactions. Besides a possibility of the analytical complex to perform a research of a competitive interaction of selenium and silver with sulfhydryl groups GSH was demonstrated.