20Известия Кабардино-Балкарского научного центра РАН № 2 (46) 2012
НАУКИ О ЗЕМЛЕ
УДК 575.224.46.044
ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СОИ (GLYCINE MAX. (L.) MERILL) ЛИНИИ Т219
Н.В. РЕУТОВА
ФГБУН «Кабардино-Балкарский научный центр Российской академии наук» Центр географических исследований 360010, КБР, г. Нальчик, ул. Балкарова, 2 E-mail: reutova371@mail.ru
С целью выявления тест-систем, пригодных для обнаружения мутагенного потенциала тяжелых металлов, было проведено исследование мутагенных свойств 8 металлов с использованием растительной тест-системы сои (Glycine max. (L.) Merill) линии Т219. В результате проведенных исследований была доказана пригодность данной тест-системы для определения мутагенных свойств тяжелых металлов.
Ключевые слова: мутагенез, растительные тест-системы, тяжелые металлы.
Тяжелые металлы (ТМ) в настоящее время считаются одними из главных загрязнителей окружающей среды. Это связано с их значительным поступлением за счет деятельности добывающей и обрабатывающей промышленности и транспорта. Токсическое влияние ТМ выявить достаточно легко, а вот скрытое генетическое можно определить только с использованием специальных тест-систем. Такой общепринятой тест-системой является тест Эймса, в котором используются бактерии. Но бактериальные тест-системы не пригодны для определения мутагенной активности тяжелых металлов из-за их высокой токсичности для бактерий. Поэтому достаточно остро стоит вопрос поиска тест-систем, пригодных для этих целей.
В данной работе была проведена оценка мутагенной активности 8 тяжелых металлов с использованием одной из растительных тест-систем сои (Glycine max. (L.) Merill) линии Т219 для определения её пригодности для этих целей.
Методика
Соя (Glycine max. L. (Merill.) была предложена Вигом и Пэддоком в качестве тест-системы для обнаружения мутагенов на первых этапах скрининга загрязнителей окружающей среды. Данная тест-система дает возможность определять специфичность действия мутагенов, поскольку с ее помощью можно дифференцировать типы хромосомных нарушений, вызываемых мутагенами, а именно: соматический кроссинговер, хромосомные делеции, точковые мутации и нерасхождения хромосом. Это единственная система in vivo среди высших эукариот, дающая возможность определить сразу несколько типов мутаций после однократной обработки и определить таким путем специфичность действия мутагенов. Преимуществами данной системы являются ее быстрота, легкость проведения анализа появляющихся после обработки пятен на листьях и пригодность для тестирования соединений в виде растворов, твердых отходов, эмульсий и газообразных веществ [4-7].
Определение мутагенного действия испытываемых веществ ведется путем учета и анализа пятен, появляющихся на листьях. Поскольку появление одного и того же типа пятна может быть обусловлено разными причинами, необходимо анализировать относительное
возрастание частоты всех типов пятен на всех типах листьев, чтобы сделать заключение о специфичности и механизмах мутационного воздействия того или иного реагента.
Поскольку для обнаружения мутагенного действия металлов необходимо, чтобы в клетках шел активный синтез ДНК, обработку мы проводили именно в этот период. Поэтому 12-15 г (100 штук) воздушно-сухих семян замачивали сначала на 20 часов в водопроводной воде, а затем еще на 24 часа в растворе реагента при комнатной температуре.
В качестве отрицательного контроля использовали дистиллированную воду, а положительного - нитрозометилмочевину (НММ) и диэтилсульфат (ДЭС). Эти вещества - известные супермутагены. Далее семена промывали и проращивали в течение 3-4 недель до появления двух первых простых и одного сложного листа. При подсчете тройчато-сложный лист приравнивается к трем простым. Поэтому на каждое растение анализируется по 5 листьев.
Поскольку в зародыше представлены только зачатки двух первых простых и одного сложного листа, то мутаген воздействует только на клетки этих пяти листьев, и проявления мозаицизма, индуцированного мутагеном, можно ожидать только на этих листьях [4, 7]. Поэтому анализ последующих листьев не производят. Наибольшее количество пятен наблюдается, как правило, на двух первых простых листьях, поскольку в зародыше они представлены большим количеством клеток [7]. Более 80% пятен находятся на верхней стороне листьев. По-видимому, губчатая паренхима менее чувствительна к воздействию мутагенов [3]. Поэтому мы просматривали только верхнюю поверхность листьев.
Данные приводили в виде числа пятен на лист и анализировали как общее их количество, так и частоту каждого отдельного типа пятен по каждому типу листа, чтобы можно было сделать заключение о специфичности действия мутагена.
Результаты и обсуждение
Судя по имеющимся литературным данным, эта очень интересная тест-система практически не использовалась для генетического мониторинга загрязнения окружающей среды за последнее десятилетие. Это растение очень удобно для целей мониторинга, т.к. позволяет определить не только наличие (или отсутствие) мутагенного эффекта, но и тип мутаций, что дает возможность судить о специфичности действия мутагена.
Были протестированы неорганические соединения восьми металлов с использованием этой тест-системы. Это Л§, Си, Сё, Сг, Н^, Мо, РЬ, Часть из них очень токсичны (Л§, Си, Сг, Н§), некоторые являются известными канцерогенами (Сё, Сг и РЬ), есть и необходимые для живых организмов в качестве микроэлементов (Си, Мо), а Л§ и ' с точки зрения их мутагенных свойств практически не были изучены.
Полученные результаты приведены в табл. 1 и 2. Для всех протестированных ТМ в таблицах приведены низшие мутагенные концентрации. Металлы расположены в порядке возрастания низших мутагенных концентраций. Данные по серебру, свинцу и меди взяты из ранее опубликованных работ [2]. Данные по Сг, ' и Мо взяты из работы М.Л. Гогуа [1].
У данной тест-системы имел место разный спонтанный уровень мутаций в контроле, что, возможно, связано с тем, что использовались семена разных сроков хранения и разных годов выращивания. Семена для проведения опытов выращиваются в открытом грунте, а погодные условия в разные годы различаются. Спонтанный уровень соматических мутаций на листьях сои в контроле колебался от 0,154 до 1,948 пятен на лист. Таким образом, у всех использованных тест-систем спонтанный уровень мутаций весьма нестабильный.
В таблицах металлы расположены в порядке возрастания их низших мутагенных кон-
ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СОИ (GLYCINEMAX. (L.) MERILL) ЛИНИИ Т219.
центраций. Часть металлов (Ag, Pb, Hg, Cu) была протестирована в виде двух солей - плохо растворимых иодидов и хорошо растворимых нитратов. Остальные в виде хорошо растворимых соединений.
Таблица 1.
Влияние тяжелых металлов на сою линии Т219 (общие данные)
Вариант Концентрация Всхожесть Пятен на лист
(М) %
Контроль - 33 0,616
AgNO3 5°10-6 35 1,729
Agi 1,510-8 26 1,490
Контроль* 41 0,326
K2Cr2O7* 10-6 38 0,883
Контроль - 27 0,154
Hg(NO3)2°H2O 10-5 28 0,407
Контроль - 52 0,761
HgI2 10-5 35 1,620
Контроль - 23,5 0,492
Cd(NO3)2^2H2O 10-4 41,5 1,193
Контроль - 39 0,826
PbI2 10-3 37 3,375
Pb(NO3)2 10-2 18 1,159
Контроль* 30 0,391
Na2MoO4.2H2O* 10-3 42 0,638
Na2WO4.2H2O* 10-2 36,5 0,405
Контроль - 53 0,966
CuI 10-5 52 1,110
Контроль - 45 0,793
Cu(NO3)2 10-2 43 0,778
Контроль - 32 1,948
ДЭС 10-3 49 3,957
НММ 2°10-3 37 20,282
* Данные М.Л. Гогуа (2003).
Плохо растворимые иодиды серебра, свинца и ртути оказались мутагенными в более низких концентрациях, чем их хорошо растворимые нитраты. Медь не оказала никакого мутагенного действия ни в виде нитрата, ни в виде иодида.
Супермутагены (положительный контроль) оказали значительно более сильное мутагенное действие. Наблюдался заметный рост числа пятен на лист в 2-10 раз по сравнению с контролем. Тяжелые металлы в среднем вызывали примерно двукратное повышение уровня мутаций. Но у супермутагенов действующие концентрации были 10-3М, что в 10-1000 раз выше, чем действующие концентрации большинства тяжелых металлов, обладающих мутагенным потенциалом.
Что касается токсичности, то AgNO3 был токсичен в концентрации 3°10-5М; для К2Сг207 токсической была концентрация 10-3М; не был токсичен вплоть до предела растворимости, а ^(N0^ не оказывал токсического влияния и в концентрации 10- М. Для иодида свинца даже насыщенные растворы не были токсичными. Остальные металлы вплоть до концентрации
10-1М токсическими не были. Таким образом, ряд токсичности металлов для сои выглядит следующим образом: Ag > Сг6+ > ^ > РЬ > Сё, Си, Мо6+, В конце ряда мы поставили металлы, для которых токсические концентрации не были определены.
Что касается мутагенных свойств, то субтоксические концентрации большинства изученных металлов были мутагенными. Не проявили мутагенных свойств только соединения меди и вольфрама.
Ряд мутагенной активности изученных тяжелых металлов для сои получился такой: Л§ + > Сг6+ > > Сё > РЬ > Мо6+ > Си, Коэффициент корреляции между токсичностью и мутагенностью составил 0,87, что свидетельствует о наличии бесспорной связи между токсическими и мутагенными свойствами тяжелых металлов. Чем выше токсичность, тем выше мутагенность металла.
Что касается типов вызываемых мутаций, то серебро, кадмий, молибден и нитрат ртути вызывали равномерное повышение уровня всех типов пятен (табл. 2), что говорит об отсутствии специфического мутагенного влияния. Иодид ртути в основном вызывал прямые генные мутации и/или делеции, а иодид свинца - обратные генные мутации (табл. 2).
Таблица 2.
Влияние тяжелых металлов на сою линии Т219 (данные по типам листьев)
Вариант Концентрация (М) Светло-зеленые листья Желтые листья Темно-зеленые листья
Темно-зеленые пятна Желтые пятна Парные пятна Светло-зеленые пятна Светло-зеленые пятна
Контроль - 0,716 0,243 0,054 0,286 0,120
AgNO3 5°10-6 1,954 0,583 0,296 0,613 0,082
Agi 1,5-10-8 1,854 0,146 0,104 0,928 1,083
Контроль* 0,192 0,187 0,028 0,575 0,000
K2&2O7* 10-6 0,638 0,172 0,015 0,801 0,067
Контроль - 0,117 0,023 0,023 0,208 0,062
Hg(NO3)2°H2O 10-5 0,170 0,163 0,096 0,690 0,068
Контроль - 0,042 0,734 0 0,523 0,861
Hgl2 10-5 0 1,924 0 0,301 1,653
Контроль - 0,160 0,142 0,009 2,73 0
Cd(NO3^2H2O 10-4 0,748 0,595 0,029 2,41 0,079
Контроль = 0,729 0,252 0,140 0,350 0,275
Pbl2 10-3 3,875 0,258 0,342 1,200 0,474
Pb(NO3)2 10"2 1,320 0,160 0,120 1,578 0,158
Контроль* 0,235 0,309 0,025 0,375 0,000
Na2MoO42H2O* 10-3 0,396 0,369 0,028 1,206 0,000
Na2WO42H2O* 10"2 0,396 0,369 0,028 1,206 0,000
Контроль - 0,849 0,340 0,154 2,143 0,017
CuI 10-5 0,743 0,381 0,142 2,125 0,023
Контроль - 0,672 0,320 0,120 1,250 0
Cu(NO3)2 10"2 0,754 0,292 0,108 1,823 0,040
Контроль - 2,303 0,280 0,228 0,828 0,083
ДЭС 10-3 3,550 1,217 0,442 5,750 0,774
Контроль - 0,190 0,034 - 0,565 0,137
НММ 2°10-3 8,10 15,60 0,75 3,25 20,08
* Данные М.Л. Гогуа (2003).
Исходя из результатов наших исследований можно с уверенностью сделать заключение, что данная растительная тест-система вполне пригодна для тестирования тяжелых
ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СОИ (GLYCINEMAX. (L.) MERILL) ЛИНИИ Т219.
металлов как на токсичность, так и на мутагенность и является весьма чувствительной к такому типу загрязнителей, поскольку выявленные с её помощью действующие концентрации тяжелых металлов значительно ниже, чем мутагенные концентрации супермутагенов (ДЭС и НММ).
ЛИТЕРАТУРА
1. Гогуа М.Л. Изучение генотоксического потенциала солей хрома, молибдена, вольфрама на растительных тест-системах. Диссертация. на соиск. степени к.б.н. М., 2003.
2. Реутова Н.В. Мутагенное влияние иодидов и нитратов серебра и свинца // Генетика, 1993. Т. 29. № 6. С. 928-934.
3. Vig B.K. Somatic crossing over in Glycine max. (L.) Merill: effect of some ingibitors of DNA synthesis on induction of somatic crossing-over and point mutation // Genetics, 1973. № 73. P. 583-596.
4. Vig B.K. Soybean (Glycine max) a new test system for study of genetic parametres as affected by environmental mutagens // Mutat. Res, 1975. № 31. P. 49-56.
5. Vig B.K. Somatic mosaicism in plants with special reference to somatic crossing over. // Environ. Health Persp., 1978. V. 27. P. 27-36.
6. Vig B.K. Somatic crossing over in higher plants // In: Environmental mutagenesis, carcinogenesis and plant biology. Vol. II. Praeger Press, 1982. P. 26-54.
7. Vig B.K. Soybean (Glycine max. (L.) Merill) as a short-term assay for study of environmental mutagens // Mutat. Res., 1982 а. V. 99. P. 339-347.
THE INVESTIGATION OF HEAVY METALS' MUTAGENIC POTENTIAL USING SOYBEAN GLYCINE MAX. (L.) MERILL AS A TEST-SYSTEM
N.V. REUTOVA
The centre of geographical researches of KBSC of the Russian Academy of Sciences 360010, КБР, Nalchik, 2, Balkarova street E-mail: reutova371@mail.ru
Mutagenic properties of 8 heavy metals was studied using Glycine max. (L.) Merill. as plant testsystem for determination of test-systems, suitable for revealing of heavy metals' mutagenic potential. As a result, suitability of this test system was demonstrated.
Key words: mutagenesis, plant test-systems, heavy metals.
Работа поступила 16. 03. 2012 г.
