CC BY
12Оригинальные исследования МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 615.015+615.361
ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА РНК-СОДЕРЖАЩЕГО ПРЕПАРАТА RN-13 В ТЕСТЕ ЭЙМСА
З. Т. Шульгау, Т. Н. Криворучко, О. В. Толмачева, Ш. Д. Сергазы, Б. А. Сагиндыкова, А. Е. Гуляев
Целью исследования явилась апробация мутагенных свойств РНК-содержащего препарата RN-13 в тесте на индукцию генных мутаций (тест Эймса) на четырех штаммах Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537. Ни для одного штамма Salmonella typhimurium не обнаружено статистически значимого дозозависимого увеличения числа колоний ревертантов в присутствии исследуемого препарата в изученном диапазоне доз от 4,0 до 40,0 мг/мл относительно базового уровня спонтанных мутаций. РНК-содержащий препарат RN-13 в исследованном диапазоне доз в отношении штаммов TA98, TA100, TA1535, TA1537 Salmonella typhimurium мутагенной активностью не обладает.
Ключевые слова: RN-13, РНК-препарат, тест Эймса, мутагенные свойства.
ВВЕДЕНИЕ
Разработка биологически активных субстанций на основе олигонуклеотидов ведется в последние несколько лет довольно интенсивно. Открытие ми-кроРНК (англ. т^ЫАБ, ткгопЬопис1е1сааС) в качестве важных регулирующих агентов для экспрессии генов расширило терапевтические возможности для исследования олигонуклеотидов. Существуют сведения о возможности влияния т^ЫАБ на течение возраст-ассоциированных заболеваний, таких как сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания [1-2]. Сформировалась целая область экспериментальной терапии на основе РНК-препаратов, что является предметом нескольких трансляционных исследований [3-5].
Основную массу РНК-препаратов составляют различные варианты микроРНК (тКЫАБ), получаемых методами РНК-интерференции и составляющих перспективный класс регуляторных молекул, однако определенное значение среди РНК-содержа-щих субстанций сохраняют и РНК-препараты - «на-тивные органопрепараты». В качестве типичного примера можно назвать биологически активные
субстанции, известные как экстракты РНК. Биологически активные субстанции на основе РНК в настоящее время благодаря своему уникальному спектру действия широко применяются в качестве биологически активных добавок (БАД). Разнообразное влияние различных видов РНК на отдельные системы отражено в большом количестве данных литературы об использовании нуклеотидов РНК в условиях, когда они являются парамедицинскими препаратами, например, косметическими, гомеопатическими средствами или БАД [6]. В то же время в последние годы начались интенсивные исследования возможности использования РНК в качестве лекарственных средств [7-8].
Следует указать, что ранее РНК-содержащие субстанции в виде органопрепаратов достаточно широко использовались в комплексной терапии различных возраст-ассоциированных болезней. Так, существует целая комбинация парамедицинских препаратов под условным названием «КедепегеБеп», которые содержат в качестве действующего вещества органоспец-ифичные РНК из органов молодых телят и РНК из
67
о rN
ГО
5
а
fr £
I-
U ф
00
STUDY OF MUTAGENIC POTENTIAL OF RNA-CONTAINING DRUG RN-13 IN AMES TEST
Z. T. Shulgau, T. N. Krivoruchko, O. V. Tolmacheva, Sh. D. Sergazy,
B. A. Sagindykova, А. E. Gulyaev
The mutagenic properties of the RNA-containing drug RN-13 were studied in the gene mutation induction test (Ames test) on four strains of Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537. No statistically significant dose-dependent increase in the number of revertant colonies was observed for any strain of Salmonella typhimurium in the presence of the study drug in the studied range of doses from 4.0 to 40.0 mg/ml relative to the baseline level of spontaneous mutations. RNA-containing drug RN-13 in the studied dose range for strains TA98, TA100, TA1535, TA1537 Salmonella typhimurium does not have mutagenic activity.
Keywords: RN-13, RNA-containing drugs, Ames test, mutagenic properties.
68
о rN
ГО
5
а
I-
U ф
00
дрожжей. Более 50 лет назад профессор Dyckerhoff начал заниматься в Германии разработкой концепции лечения хронических и дегенеративных заболеваний, основанного на принципе регенерации [6]. Из клеток органов молодых телят он выделил РНК, которые после очистки, стабилизации и стерилизации использовались в лечении хронических и дегенеративных заболеваний в контексте натуропатической медицины последние 60 лет.
Многочисленные описания положительного клинического эффекта препаратов «Regeneresen» содержатся в описаниях германских клиник. Во всех случаях констатируется наличие у РНК-содержащих субстанций способности стимулировать регенеративные процессы при различных, в том числе и воз-раст-ассоциированных патологических состояниях. Так, в рамках клинических исследований РНК-содер-жащих препаратов было установлено статистически значимое подавление хронических иммуно-воспали-тельных реакций, типичных в течение процесса старения организма [6].
Таким образом, известные к настоящему времени свойства РНК в биодобавках послужили толчком к проведению исследований с целью выявления их лечебных свойств и создания на их основе эффективных лекарственных средств. Между тем при активном использовании РНК-препаратов не исключена возможность развития мутагенного эффекта и степень риска должна быть оценена, чему собственно и посвящена настоящая работа.
Цель работы - апробировать мутагенные свойства РНК-содержащего препарата RN-13 в тесте на индукцию генных мутаций (тест Эймса) на четырех штаммах Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1537.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования явился РНК-содержащий препарат RN-13 (Dyckerhoff Pharma GmbH&Co. KG, Cologne, Germany), который помимо РНК дрожжей содержит РНК крупного рогатого скота из следующих органов: сосудистая стенка, кора головного мозга, сердце, гипофиз, гипоталамус, печень, селезенка, кора надпочечников, почки, яичники,плацента, семенники, таламус. Одна ампула препарата RN-13 объемом 5 мл содержит 6,3 мг натриевой соли рибонуклеиновой кислоты теленка и дрожжей.
Оценка мутагенных свойств РНК-содержащего препарата RN-13 осуществлена в тесте Эймса на Salmonella typhimurium в микропланшетном формате (набор Ames MPF™ Penta I, Xenometrix, Switzerland) [9-13]. Штаммы бактерий, входящие в набор, соответствуют требованиям руководства по оценке химических соединений OECD 471.
Для оценки мутагенности в тесте Эймса использовали штаммы бактерий Salmonella typhimurium, в гистидиновый оперон которых внесены точковые мутации, ведущие к нарушению синтеза гистидина, и неспособности бактерий к росту на среде, не содержащей гистидин. Индукция в результате мутагенного воздействия обратных мутаций по типу замены пар оснований или сдвига рамки считывания в гене His этих тестерных штаммов приводит к реверсии прототрофности бактерий по этим аминокислотам и способности к росту на безгистидиновой среде. Тестерные штаммы подвергали воздействию различ-
ных концентраций исследуемых образцов и выращивали на среде, не содержащей гистидин. Мутагенный потенциал оценивали по индукции ревертантов от ауксотрофности по гистидину к прототрофности, способных к выживанию и росту на безгистидиновой среде. Штаммы Salmonella typhimurium ТА100, ТА1535 позволяют регистрировать индукцию мутаций по типу замены пар оснований, штаммы Salmonella typhimurium ТА98 и ТА1537 - мутаций по типу сдвига рамки считывания [9-13].
Около 107 бактерий Salmonella typhimurium подвергали воздействию тестируемого образца в 6 концентрациях (а также воздействию позитивного и негативного контролей) в течение 90 мин (время, достаточное для прохождения двух клеточных делений) в среде, содержащей гистидин. Через 90 мин экспонированные культуры разводили в рН-индикаторной среде, не содержащей гистидин, и разливали по 48 лункам 384-луночной микротитровальной планшеты. В течение двух дней бактерии, претерпевшие реверсию к прототрофности по этим аминокислотам, формировали колонии. Продукты метаболизма бактерий снижали значение pH-индикаторной среды, что приводило к изменению ее цвета в лунках. Для каждой концентрации тестируемого образца проводился подсчет количества лунок с ревертантными колониями, полученные показатели сравнивались с показателем для негативного (растворитель) контроля. Для статистической обработки данных каждая концентрация исследовалась в трех повторностях. Диапазон исследованных доз РНК-содержащего препарата RN-13 составил от 4,0 мг/мл до 40 мг/мл (4, 8, 10, 20, 30 и 40 мг/мл).
Расчеты производили с помощью таблицы калькуляций Excel (Ames_Calculation_Sheet_Ver2_03.xls). Рассчитывали следующие параметры: «среднее число позитивных лунок на концентрацию», которое составляет среднее значение числа позитивных лунок от трех повторностей на одну тестируемую концентрацию; «стандартное отклонение показателя числа позитивных лунок на концентрацию», которое представляет стандартное отклонение среднего значения числа позитивных лунок на тестируемую концентрацию; «кратность превышения относительно нулевой линии», которое определяется как отношение среднего значения числа позитивных лунок на тестируемую концентрацию к нулевой линии негативного (растворитель) контроля. Нулевая линия вычисляется сложением среднего значения числа позитивных лунок для негативного контроля и значения стандартного отклонения. Как правило, кратность превышения числа ревертантов относительно нулевой линии менее чем 2,0 не рассматривается как позитивный эффект, поскольку различия не считаются достоверными. Образец, для которого выявлена концентрационная зависимость эффекта или кратность превышения относительно нулевой линии более чем 2,0, классифицируется как мутаген. T-test Стьюдента (односторонний, непарный) использован для определения статистически значимых различий при уровне р = 0,05.
Увеличение количества ревертантных колоний под действием тестируемого образца по сравнению с негативным контролем свидетельствует о том, что образец проявляет мутагенную активность в тесте Ames MPF™ Penta I.
Оригинальные исследования МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Диапазон исследованных доз РНК-содержащего ных свойств РНК-содержащего препарата RN-13 в те-препарата RN-13 составил от 4,0 до 40,0 мг/мл (4; 8; 10; сте Эймса в отношении Salmonella typhimurium ТА98 20; 30 и 40 мг/мл). Результаты исследования мутаген- представлены в табл. 1.
Таблица 1
Результаты исследования мутагенных свойств РНК-содержащего препарата RN-13 в тесте Эймса в отношении Salmonella typhimurium ТА98
Концентрация РНК-содержащей субстанции RN-13, мг/мл Число повтор-ностей, n Среднее количество позитивных лунок, m Стандартное отклонение показателя числа позитивных лунок, БЭ Нулевая линия Кратность превышения (нулевой линии) t-test, p-значение (непарный, односторонний)
0 6 6,33 1,03 7,37
4 3 7,00 2,00 0,95 0,2582
8 3 5,67 0,58 0,77 0,1712
10 3 5,67 1,53 0,77 0,2281
20 3 7,00 1,00 0,95 0,1938
30 3 5,00 4,00 0,68 0,2206
40 3 7,33 1,53 1,00 0,1377
Позитивный контроль (2-нитрофлюорен) 3 48,00 0,00
Из представленных результатов видно, что РНК-со-держащий препарат РЫ-13 в исследуемом диапазоне доз не способствует увеличению числа колоний ревертан-тов относительно базового уровня спонтанных мутаций. Среднее количество позитивных лунок не отличается от аналогичного значения в негативном контроле. Кратность превышения относительно нулевой линии в иссле-
дуемом диапазоне доз РНК-содержащего препарата RN-13 составляет менее 2,0, поэтому различия не считаются статистически значимыми (уровень значимости p > 0,05).
Результаты исследования мутагенных свойств РНК-содержащего препарата RN-13 в тесте Эймса в отношении Salmonella typhimurium ТА100 представлены в табл. 2.
69
о rN
m
Таблица 2
Результаты исследования мутагенных свойств РНК-содержащего препарата RN-13 в тесте Эймса в отношении Salmonella typhimurium ТА100
Концентрация РНК-содержащей субстанции RN-13, мг/мл Число повтор-ностей, n Среднее количество позитивных лунок, m Стандартное отклонение показателя числа позитивных лунок, БЭ Нулевая линия Кратность превышения (нулевой линии) t-test, p-значение (непарный, односторонний)
0 6 5,33 1,63 6,97
4 3 4,67 0,58 0,67 0,2632
8 3 7,00 1,00 1,00 0,0776
10 3 7,33 2,08 1,05 0,0773
20 3 4,33 0,58 0,62 0,1753
30 3 4,67 0,58 0,67 0,2632
40 3 7,00 1,00 1,00 0,0776
Позитивный контроль (N-оксид 4-нитрохинолин) 3 45,33 0,58
5
а
fr £
I-
u ф
со
Из представленных результатов видно, что РНК-со-держащий препарат РЫ-13 в исследуемом диапазоне доз не способствует увеличению числа колоний ревертан-тов относительно базового уровня спонтанных мутаций. Среднее количество позитивных лунок не отличается от аналогичного значения в негативном контроле. Кратность превышения относительно нулевой линии в иссле-
дуемом диапазоне доз РНК-содержащего препарата RN-13 составляет менее 2,0, поэтому различия не считаются статистически значимыми (уровень значимости p > 0,05).
Результаты исследования мутагенных свойств РНК-содержащего препарата RN-13 в тесте Эймса в отношении Salmonella typhimurium ТА1535 представлены в табл. 3.
Таблица 3
Результаты исследования мутагенных свойств РНК-содержащего препарата RN-1 в тесте Эймса в отношении Salmonella typhimurium ТА1535
Концентрация РНК-содержащей субстанции RN-13, мг/мл Число по-вторностей, n Среднее количество позитивных лунок, m Стандартное отклонение показателя числа позитивных лунок, БЭ Нулевая линия Кратность превышения (нулевой линии) t-test, p-значение (непарный, односторонний)
0 6 1,50 0,55 2,05
4 3 1,67 0,58 0,81 0,3423
8 3 2,33 1,53 1,14 0,1248
10 3 1,67 1,53 0,81 0,4045
20 3 2,00 1,00 0,98 0,1753
30 3 1,33 0,58 0,65 0,3423
40 3 1,00 1,00 0,49 0,1753
Позитивный контроль (№-амино-цитидин) 3 48,00 0,00
70
о rN
ГО
я
X S
5
а
fr £
I-
U ф
со
Из представленных результатов видно, что РНК-со-держащий препарат РМ-13 в исследуемом диапазоне доз не способствуют увеличению числа колоний ревертан-тов относительно базового уровня спонтанных мутаций. Среднее количество позитивных лунок не отличается от аналогичного значения в негативном контроле. Кратность превышения относительно нулевой линии в иссле-
дуемом диапазоне доз РНК-содержащего препарата RN-13 составляет менее 2,0, поэтому различия не считаются статистически значимыми (уровень значимости p > 0,05).
Результаты исследования мутагенных свойств РНК-содержащего препарата RN-13 в тесте Эймса в отношении Salmonella typhimurium ТА1537 представлены в табл. 4.
Таблица 4
Результаты исследования мутагенных свойств РНК-содержащего препарата RN-13 в тесте Эймса в отношении Salmonella typhimurium ТА1537
Концентра-ция РНК-содержащей субстанции RN-13, мг/мл Число по-вторностей, n Среднее количество позитивных лунок, m Стандартное отклонение показателя числа позитивных лунок, БЭ Нулевая линия Кратность превышения (нулевой линии) t-test, p-значение (непарный, односторонний)
0 6 6,33 1,03 7,37
4 3 7,33 1,53 1,00 0,1377
8 3 6,33 0,58 0,86 0,5000
10 3 6,67 1,15 0,91 0,3363
20 3 5,67 0,58 0,77 0,1712
30 3 7,00 1,73 0,95 0,2414
40 3 7,33 0,58 1,00 0,0852
Позитивный контроль (9-аминоакридин) 3 48,00 0,00
Оригинальные исследования МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
Из представленных результатов видно, что РНК-со-держащий препарат КЫ-13 в исследуемом диапазоне доз не способствует увеличению числа колоний ре-вертантов относительно базового уровня спонтанных мутаций. Среднее количество позитивных лунок во всех исследованных концентрациях РНК-содержащего препарата КЫ-13 не отличается от аналогичного значения в негативном контроле. Кратность превышения относительно нулевой линии в исследуемом диапазоне доз РНК-содержащей субстанции КЫ-13 составляет менее 2.0, поэтому различия не считаются статистически значимым (уровень значимости р > 0,05).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изучены мутагенные свойства РНК-содержащего препарата КЫ-13 в тесте Эймса в отношении штаммов
Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TAI 537. Ни для одного штамма Salmonella typhimurium не обнаружено статистически значимого дозозависимого увеличения числа колоний ревертантов в присутствии исследуемого препарата в изученном диапазоне доз от 4,0 до 40,0 мг/мл относительно базового уровня спонтанных мутаций. Таким образом, на основании отрицательного ответа, полученного в тесте Эймса, можно сделать вывод, что РНК-содержащий препарат RN-13 в исследованном диапазоне доз от 4,0 до 40,0 мг/мл (4; 8; 10; 20; 30 и 40 мг/мл) в отношении штаммов TA98, TA100, TA1535, TA1537 Salmonella typhimurium мутагенной активностью не обладает.
ЛИТЕРАТУРА
1. Dimmeler S., Nicotera P. MicroRNAs in age-related diseases // EMBO molecular medicine. 2013. Vol. 5. № 2. P. 180-190.
2. Smith-Vikos T., Slack F. J. MicroRNAs and their roles in aging // Journal of cell science. 2012. Vol. 125. P. 7-17.
3. Baumann V., Winkler J. miRNA-based therapies: strategies and delivery platforms for oligonucleotide and non-oligonucleotide agents // Future medicinal chemistry. 2014. Vol. 6. № 17. P. 1967-1984.
4. Sehgal A., Vaishnaw A., Fitzgerald K. Liver as a target for oligonucleotide therapeutics // Journal of hepatology. 2013. Vol. 59. Issue 6. P. 1354-1359.
5. Zeliadt N. Big pharma shows signs of renewed interest in RNAi drugs // Nature Medicine. 2014. Vol. 20. № 2. P.109.
6. Stommel G., Schuehlein S., Schuehlein K. H., Rainsford K. D. Therapeutic Effects of Ribunucleinate (Ribonucleotides) in Immuno-Inflammatory and Arthritic Diseases // Prog Drug Res. 2015. Vol. 70. P. 35-89.
7. Sullenger B. A., Gilboa E. Emerging clinical applications of RNA // Nature. 2002. Vol. 418. P. 252-258.
8. Coaker H. Team demonstrates the rational design of drugs from RNA sequence // Future Med Chem. 2014. Vol. 6 (5). P. 495.
10
11
9. Ames B. N., McCann J., Yamasaki E. Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity // Test Mutation Res. 1975. Vol. 31. P. 347-364. Maron D. M., Ames B. N. Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test // Mutation Res. 1983. Vol. 113. P. 173-215.
Gatehouse D., Haworth S., Cebula T., Gocke E., Kier L., Matsushima T., Melcion C., Nohmi T., Venitt S., Zeiger E. Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays // Mutation Res. 1994. Vol. 312. P. 217-233.
12. Fluckiger-Isler S., Kamber M. Direct comparison of the Ames microplate format (MPF) test in liquid medium with the standard Ames pre-incubation assay on agar plates by use of equivocal to weakly positive test compounds // Mutation Res. 2012. Vol. 747. № 1. P. 36-45.
13. Kamber M., Fluckiger-Isler S., Engelhardt G., Jaeckh R., Zeiger E. Comparison of the Ames II and traditional Ames test responses with respect to mutagenicity, strain specificities, need for metabolism and correlation with rodent carcinogenicity // Mutagenesis. 2009. Vol. 24. № 4. P. 359-366.
71
о rN
m
5
a £
i-
u Ф
oa
