CC BY
72
ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ КАРТИНЫ ПУЛЬПЫ ЗУБОВ И ПЕРИОДОНТА ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ДОНОРА ОКСИДА АЗОТА И БЛОКАТОРА NО-СИНТАЗЫ ПРИ ЭМОЦИОНАЛЬНОМ СТРЕССЕ
ЕЮ. Ермак1, В.Н. Олесова2, В.В. Парилов3, Ю.М. Ермак1, А.К. Кириченко4, В.В. Индюков5
1 МБУЗ Городская стоматологическая поликлиника № 5, Красноярск 2 Институт повышения квалификации Федерального Управления медико-биологических и экстремальных проблем при
Минздравсоцразвития России, Красноярск 3 Стоматологическая клиника "ВОКА", Красноярск 4 ГБОУ ВПО "Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого" Минздравсоцразвития
России
5 МБУЗ Городская стоматологическая поликлиника № 2, Красноярск E-mail: ermak_stom@mail.ru
EXPEREMENTAL PREVENTION OF STRESS CHANGES OF TOOTH PULP TISSUES AND PERIODONTIUM WITH NITRIC OXIDE DONOR MOLECULES
E.Yu. Ermak1, V.N. Olesova2, V.V. Parilov3, Yu.M. Ermak1, A.K. Kirichenko4, V.V. Indyukov5
1 City Dental Clinic No. 5, Krasnoyarsk, Russia 2 The Institute of Improvement of Professional Skills, Federal Management of Medico- Biological and Experimental Problems, Krasnoyarsk,
3 Dentistry Clinic "Voka", Krasnoyarsk, Russia 4 Krasnoyarsk State Medical University n.a. prof. V.F. Voyno-Yasenetsky;
5 City Dental Clinic No. 2, Krasnoyarsk, Russia
В статье приводятся результаты исследования влияния доноров и блокаторов фермента NO-синтазы на морфологическую картину пульпы зубов и тканей периодонта лабораторных животных при стрессорном воздействии. Показано, что донор молекул оксида азота L-аргинин способен ограничивать развитие стресс-реакции и снижать выраженность морфофункциональных нарушений в тканях периодонта и пульпе зубов. Блокатор фермента NO-синтазы L-NNA способствует усилению альтерирующих эффектов стресс-реакции на ткани периодонта и пульпы зубов.
Ключевые слова: оксид азота, эмоционально-болевой стресс, L-аргинин, периодонт.
The research results of influence of donors and anzyme blocker NO-synthesis on morphological state of tooth pulp and periodontium tissues at stress influence on laboratory animals are presented in the article. It is revealed, that nitric oxide donor molecule L-arginine is able to limit the development of stress-reaction and decrease quantity of morphofunctional infrigements in periodontium tissues and teeth stump. Enzyme blocker NO- synthesis L-NNA helps to strengthen alternating effects of stress reaction in periodontium tissue and teeth pulp.
Key words: Nitric oxide, emotionally-painful stress, L-arginine, periodontium.
Введение
Работами отечественных исследователей было показано, что важную роль в повреждении тканей пародонта играют стрессорные воздействия, т.к. в результате активации адренергической и гипоталамо-гипофизарно-ад-реналовой систем происходят нарушения различных видов обмена, чрезмерная активация процессов перекис-ного окисления липидов, расстройства регионарной гемодинамики, что приводит к деструкции клеточных мембран пародонтальных тканей [2, 13].
В предыдущие годы Ф.З. Меерсоном (1981) была выдвинута концепция о стресс-лимитирующих системах организма, которая дала реальную основу для разработки принципов предупреждения чрезмерной активности стресс-реакции и реализации ее патогенных воздействий на различные органы и системы организма [9]. В механизме адаптации наиболее важную роль играют универсальные факторы регуляции физиологических систем и экспрессии генов [6].
Согласно современным представлениям, таким универсальным регулятором является оксид азота (N0) [7, 8]. В организме N0 синтезируется из Ь-аргинина ферментом N0-синтазой. С начала 90-х годов стали появляться доказательства того, что N0 вовлечен в регуляцию активности генетического аппарата как на уровне факторов транскрипции, так и на уровне самих механизмов транскрипции и трансляции мРНК [14, 15].
Наконец, после того как были получены данные о значительных изменениях в продукции N0 при стрессе и в процессе адаптации к разным факторам, возникло предположение о том, что N0 играет важную роль в стрес-сорных и адаптивных ответах организма [12]. Учеными выдвинута гипотеза о том, что N0 участвует в регуляции стресс-реакции, ограничивая ее чрезмерную активацию и ее повреждающие эффекты как на центральном, так и на периферическом уровне [5, 11].
Цель исследования: изучение морфологических особенностей пульпы и периодонта зубов под влиянием эмоционального стресса в ответ на использование активаторов и ингибиторов фермента N0-синтазы в эксперименте.
Материал и методы
Экспериментальные исследования проведены на 220 белых крысах-самцах линии Вистар массой 180-220 г в осенне-зимний период. Все исследования на животных проведены с соблюдением требований приказа № 724 Минздрава СССР от 13.11.1984 г. “Правила проведения работ с экспериментальными животными”. В качестве
модели стресса выбрана методика эмоционально-болевого стресса путем 6-часовой иммобилизации животных на спине. Всех подопытных животных разделили на 4 основные группы. В первой группе исследовались морфологические особенности пульпы зубов и пародонта крыс без стрессорного воздействия в норме (п=20). Во второй группе изучались морфологические изменения тканей пульпы и пародонта через 39 ч после окончания шестичасовой иммобилизации животных (п=60). В третьей и четвертой группах изучались те же показатели через 39 ч после стрессорного воздействия на фоне введения донора молекул оксида азота - Ь-аргинина (п=70) либо блокатора фермента N0-синтазы - Ь-ША (п=70).
В качестве донора молекул оксида азота (N0) использовалась аминокислота Ь-аргинин в дозе 200 мкг/кг веса за 30 мин до иммобилизации и через 30 мин после окончания стрессорного воздействия. Блокатор фермента N0-синтазы - ^нитро-Ь-аргинин (Ь^М) в дозе 50 мг/кг вводился за 30 мин до начала иммобилизации и через 30 мин после окончания стрессорного воздействия для снижения продукции N0.
Для морфологического анализа забранный материал фиксировали в забуференном 10%-м нейтральном формалине и заливали парафином по общепринятой методике. Декальцинация блоков проводилась Трилоном Б. Срезы стандартной толщины (5 мкм) окрашивались гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по Ван-Гизону. Морфометрическое исследование выполнялось с использованием измерительной сетки со 100 равноудаленными точками Г.Г. Автандилова для цито-гисто-стереометрических исследований, накладываемой на фотоснимок на экране монитора произвольно выбранного поля зрения [1]. Методом точечного счета определялись относительные объемы, занимаемые фиброблас-тами, пульпоцитами, аморфным веществом, сосудами, коллагеновыми волокнами, сегменто-ядерными лейкоцитами. Подсчет производился в каждом случае в 20 различных полях зрения при увеличении микроскопа х100.
Полученные данные обрабатывались методом вариационной статистики с помощью программы 81аЙ5Йса 6.0 81а18ой. Различия между группами независимых количественных показателей определялась по и-критерию Манна-Уитни для непараметрических величин по формуле: И=Т-пМ(пМ+1)/2, где Т - сумма рангов наименьшей из сравниваемых групп. Уровень различий рассматривался как статистически значимый при р<0,05 [4].
Результаты
Ранее нами установлено, что у крыс при эмоционально-болевом стрессе реакция гипофизарно-адреналовой
системы имеет фазный характер [2]. Первый период - от начала стрессорного воздействия и до 36 ч после его окончания - соответствует стадии тревоги и характеризуется повышением уровня кортикостерона в плазме крови крыс и развитием выраженной эозинопенической реакции. Второй период, соответствующий моменту перехода стадии тревоги в стадию резистентности, характеризуется пиком эозинофилии к 39 ч и снижением уровня кортикостерона до показателей контрольной группы. Третий период - начиная с 42 ч - соответствует стадии резистентности и характеризуется постепенной нормализацией биоритма эозинофилов и снижением уровня кортикостерона в крови экспериментальных животных до показателей, близких к норме.
Изменения структуры пульпы зубов и пародонта по степени и распространенности достигали максимальной выраженности к 39 ч после окончания стрессорного воздействия, что соответствует переходу стресс-реакции из стадии тревоги в стадию резистентности [3]. В пульпе зубов они характеризовались разрыхлением слоя одонтоб-ластов, полнокровием, появлением мелких вакуолей. Одонтобласты в области разрыхления оказались деформированы. Данные изменения соответствовали состоянию гидропической (вакуольной, водяночной) дистрофии. Размеры, количество и расположение вакуолей какой-либо системы не имели. В ряде полей зрения встречались группы гиперхромных одонтобластов, которые обнаруживались только в области шейки на язычной поверхности зуба. Основное вещество пульпы отличалось очаговой базофилией и менее компактным расположением волокнистых структур, разделенных оптически пустыми более или менее широкими пространствами. Развившиеся преобразования свидетельствовали в пользу обратимой дезорганизации соединительной ткани - му-коидного набухания. Выявленные изменения имели неравномерный характер, занимая не более трети площади пульпы в каждом зубе.
При морфологическом анализе тканей пародонта спустя 39 ч после окончания шестичасовой иммобилизации животных на спине установлено, что количество клеточных элементов периодонта возрастало по направлению к верхушке корня зуба и от центра периодонтальной щели к поверхности цемента. Основную массу клеток периодонтальной щели составляли фибробласты. Они, в основном, имели веретенообразную форму, иногда встречались отростчатые клетки. Наряду с этим наблюдалась миграция небольшого количества нейтрофильных лейкоцитов за пределы сосудов. В окружающей ткани определялся отек с увеличением пространств между коллагеновыми волокнами с некоторым набуханием последних.
Подводя итог результатам морфологического исследования пульпы и периодонта крыс через 39 ч после окончания шестичасовой иммобилизации, можно сделать вывод о развитии существенных гемодинамических расстройств, вызванных стрессом. Установленные нарушения проявлялись неравномерным артериальным и венозным полнокровием, гемостазом, диапедезными кровоизлияниями, умеренным лейкодиапедезом и макрофагаль-ной реакцией. Выявленные структурные изменения были
обратимыми, без дальнейшей отрицательной динамики.
Решая следующие задачи работы, мы изучили возможности ограничения выраженности стрессорных повреждений тканей пульпы зубов и периодонта у животных оксидом азота (NO) путем введения доноров и блокато-ров фермента No-синтазы. Было установлено, что слой одонтобластов в пульпе зубов крыс третьей группы состоит из нескольких слоев. Одонтобласты имели преимущественно грушевидную форму, базофильную мелкозернистую цитоплазму, вытянутые и округлые ядра. В части полей зрения в пульпе резцов в области шейки с язычной поверхности зуба определялись немногочисленные одонтобласты с заметно гиперхромными ядрами. Состав, распределение и количество клеточных элементов центральных отделов пульпы в этой подгруппе мало отличались от таковых в группе сравнения. Сосудистая реакция в виде расширения сосудов и их полнокровия умеренной выраженности наблюдалась во всех случаях данной группы и была неравномерной. В артериях наблюдалось утолщение эндотелия. Сосуды венозной системы оказались расширены более значительно, местами отмечались гемостазы и краевое стояние нейтрофильных лейкоцитов.
В периодонте после стресса на фоне введения молекул оксида азота L-аргинина наблюдалось формирование сосудистого и клеточного ответа. Сосуды были расположены типично для нормального состояния периодонта, т.е. ближе к стенке альвеолы. Эндотелий сосудов не имел признаков дезорганизации, ядра эндотелиальных клеток по структуре не отличались от контроля. Во всех исследуемых группах отмечены полнокровие, диапедезные кровоизлияния и гемостазы. Однако после стрессорного воздействия кровенаполнение сосудов имело неравномерный, преимущественно умеренный характер. Кровоизлияния и стазы крови оказались немногочисленными и выявлялись в небольшом числе наблюдений. Явления стаза в сосудах наблюдались в основном в маргинальном отделе. В сосудах собственно периодонта выявлено краевое стояние нейтрофильных лейкоцитов. Ядра эндотелия в своем большинстве существенно не различались с ядрами нормального эндотелия сосудов периодонта. Целостность эндотелиальной выстилки сосудов не нарушалась.
Изменения клеточного состава характеризовались увеличением размера небольшого числа фибробластов, ядра которых были четко очерчены, а цитоплазма - легко базофильна. Вблизи цемента наблюдалось больше молодых фибробластов, с нечетко контурирующейся цитоплазмой и овальной формы ядрами. Выявлены единичные митозы фибробластов в периодонте, что свидетельствовало о высокой функциональной активности этих клеток. Вокруг кровеносных сосудов располагались единичные лимфоциты, плазмоциты, нейтрофилы, эози-нофилы. Граница между остеонным и безостеонным слоем альвеолы была четкой. В костной ткани ядра остеоци-тов располагались эксцентрично, часть костных лакун оказалась свободной от клеток. По краю альвеолы безос-теонный слой был неравномерной ширины, коллагеновые волокна проходили на всю его глубину, границы их различались. Четко прослеживалась и граница перехода
пучков коллагеновых волокон из периодонта в безосте-онный слой.
Таким образом, сравнение структурных изменений тканей пульпы и периодонта крысы в условиях активации стресс-лимитирующих систем с контролем показало, что через 39 ч после стрессорного воздействия на фоне введения аминокислоты L-аргинина развиваются очаговая дистрофия одонтобластов, а также сосудистые реакции в виде неравномерного полнокровия, немногочисленных гемостазов, слабо выраженного лейкодиапе-деза, участков отека. Индуцированная активация фермента NO-синтазы позволила свести к минимуму гемодина-мические расстройства и вызванные этим повреждения структурных компонентов исследуемых тканей.
В четвертой группе животных, которым вводился бло-катор NO-синтазы L-NNA, морфологические изменения установлены во всех структурных компонентах пульпы и периодонта. Слой одонтобластов на большем протяжении имел неравномерную толщину, оказался разрыхлен, не обладая четкими границами, сливался с субодонтоб-ластическим слоем. Одонтобласты в участках разрыхления деформировались, приобретали чрезмерно вытянутую и неправильную форму. Во многом это было связано с образованием многочисленных вакуолей, располагавшихся преимущественно в базальной части клеток. Вакуоли имели округлую форму, различную величину, местами сливались, формируя относительно крупные полости, выступающие за пределы слоя одонтобластов (баллонная дистрофия). Число и размер вакуолей оказались значительно больше, чем в других группах. Значительная часть одонтобластов характеризовалась более интенсивной базофилией цитоплазмы по сравнению с нормой.
Кровоизлияния занимали 9,3% площади среза. Транссудация жидкой части крови в основное вещество пульпы сопровождалась отеком основного вещества, который местами достигал выраженной степени. В результате этого часть пучков коллагеновых волокон, расположенных в центральных отделах пульпы, разволокнялась, а строма в целом имела неравномерную плотность. В этих полях зрения волокнистые структуры изменяли тинктори-альные свойства в сторону базофилии, что служит проявлением мукоидного набухания. Пучки волокон располагались вдоль оси зуба или под небольшим углом к ней.
Эмиграция лейкоцитов подтверждалась их присутствием в небольшом количестве вблизи сосудов центральной части пульпы. Здесь определялись макрофаги, в цитоплазме которых имелись мелкие вакуоли. Макрофагаль-ная реакция, выявленная у 57,5% животных, отличалась увеличением числа макрофагов в сравнении с другими группами.
При морфологическом исследовании периодонта крыс, подвергнутых иммобилизации, установлено, что после введения блокатора фермента N0-синтазы, так же, как и в контрольной группе, пучки коллагеновых волокон периодонта располагались разнонаправленно. Переплетаясь между собой, они образовывали сеть, пронизывали всю толщу цемента, обеспечивая соединение зуба с периодонтом. Границы коллагеновых волокон на всех уровнях имели не везде четкие контуры, что обусловлено неравномерной степенью выраженности отека. Цемент, подобно таковому в группе контроля, по строению оказался подобен безостеонному слою стенки альвеолы. Кровеносные сосуды располагались как параллельно длинной оси зуба, так и в виде спирали вокруг корня.
Таблица 1
Морфометрические показатели пульпы зуба крысы при иммобилизационном стрессе (M±m)
Структурные компоненты (%) Контроль (n=20) Через 39 ч после иммобилизации
Без премедикации (n=60) На фоне введения L-аргинина (n=70) На фоне введения L-NNA (n=70)
Пульпоциты 14,7+0,49 10,9+1,71 12,2+1,22 7,65+0,98
Аморфное вещество 31,4+0,B4 40,1+0,83 34,6+0,73 38,45+0,91
Сосуды 13,1+0,77 19,B+0,6B 16,3+0,67 29,7+0,74
Коллагеновые волокна и фибробласты 40,8+0,74 29,2+0,62 36,7+0,58 23,6+0,55
Сегменто-ядерные лейкоциты 0 0,3+1,31 0,2+1,23 0,6+1,54
Количество одонтобластов 8,B±1,87 8,1+1,24 8,2+1,24 6,2+0,53
Толщина слоя одонтобластов, мк 22,3+1,B 23,8+2,3B 20,7+1,24 28,9+1,37
Высота одонтобластов, мк 11,4+1,11 13,9+2,08 9+2,24 13,5+1,03
Диаметр сосуда 24,8+2,0B 32,3+1,04 29,6+1,24 35,4+1,06
Таблица 2
Морфометрические показатели пародонта крысы при иммобилизационном стрессе (M±m)
Структурные компоненты (%) Контроль (n=20) Через 39 ч после иммобилизации
Без премедикации (n=60) Введение донора молекул оксида азота L-аргинина (n=70) Введение блокатора фермента NO-синтазы L-NNA (n=70)
Аморфное вещество 2B,9+0,4B 31,4+0,3B 28,5+0,54 37,6+0,39
Сосуды 7,8+0,81 14,9+0,43 10,8+0,69 21,4+0,69
Коллагеновые волокна и фибробласты 66,3+0,47 B3,6+0,48 60,5+0,32 40,8+0,69
Сегменто-ядерные лейкоциты 0 0,1+1,13 0,2+1,14 0,2+1,69
Около альвеолярной кости определялась более густая сосудистая сеть. В маргинальных отделах периодонта наблюдались сосудистые изменения в виде неравномерной
- от умеренной до выраженной - венозной гиперемии, признаков гемостаза, краевого стояния лейкоцитов с явлениями нарастающей клеточной эмиграции.
С целью объективизации полученных результатов в тканях пульпы и пародонта крыс при изучаемых вариантах стрессового воздействия осуществлен морфометрический анализ (табл. 1, 2).
Таким образом, в пульпе и периодонте крыс, подвергшихся иммобилизации на фоне введения блокатора фермента NO-синтазы, развивались очаги повреждения в слое одонтобластов и эндотелии сосудов с гибелью части их клеток. Гемодинамические расстройства сопровождались распространенными гемостазами, различных размеров кровоизлияниями, отеком, лейкодиапедезом и макрофа-гальной реакцией. Данные изменения имели более выраженный, чем в других исследуемых группах характер, являясь частью необратимыми.
Заключение
Полученные результаты дают основания считать, что при длительном и тяжелом стрессорном воздействии, сопровождающимся сильным болевым и психоэмоциональным напряжением, в тканях пульпы и периодонта возникают распространенные гемоциркуляторные и очаговые альтеративные изменения. Это создает условия для развития воспаления и нарушения процессов репарации. Представленные нами данные показали, что использование доноров молекул оксида азота L-аргинина способствует ограничению стрессорного повреждения тканей пульпы зубов и периодонта при длительных эмоционально-болевых воздействиях.
Литература
1. Автандилов Г.Г. Проблемы патогенеза и патологоанатомической диагностики болезней в аспектах морфометрии. -М. : Медицина, 1984. - 285 с.
2. Ермак Е.Ю., Парилов В.В., Индюков В.В. Одонтогенный стресс. - Красноярск, 2003. - 189 с.
3. Ермак Е.Ю., Парилов В.В., Малышев В.В. и др. Морфология пульпы зуба и тканей пародонта при остром иммобилизационном стрессе // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН (Иркутск). - 2000. - № 1 (10). -С. 66-69.
4. Кулаичев А.П. Методы и средства анализа данных в среде Windows STADIA 6.0 - М. : Информатика и компьютеры. 1996. - 257 с.
5. Малышев И.Ю., Манухина Е.Б. Стресс. адаптация и оксид азота // Биохимия. - 1998. - Т. 63. вып. 7. - С. 992-1006.
6. Маеда Х., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции. воспалении и раке // Биохимия. - 1998. -Т. 63. вып. 7. - С. 1007-1019.
7. Малышев И.Ю., Монастырская Е.А.. Смирин Б.В. и др. Гипоксия и оксид азота // Вестн. РАМН. - 2000. - № 9. - С. 44-48.
8. Манухина Е.Б.. Машина С.Ю.. Власова М.А. и др. Роль свободного и депонированного оксида азота в адаптации к гипоксии сердечно-сосудистой системы // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2004. - № 3 (11). -С. 4-11.
9. Меерсон Ф.З. Адаптация. стресс и профилактика - М. : Наука. 1981. - 278 с.
10. Меньщикова Е.Б.. Зенков Н.К.. Реутов В.П. Оксид азота и NO-синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях // Биохимия. - 2000. - Т. 65. вып. 4. - С. 485-503.
11. Петрович Ю.А.. Терехина Н.А.. Реук С.Э. и др. Прооксиданты. мексидол и другие антиоксиданты при герпетическом стоматите. гингивостоматите и хроническом генерализованном пародонтите // Российский стоматологический журнал. - 2010. - № 3. - С. 29-33.
12. Смирин Б.В.. Покидышев Д.А.. Малышев И.Ю. и др. Депонирование оксида азота как фактор адаптационной защиты // Рос. физиол. журн. им. И. Сеченова. - 2000. - Т. 86. № 4. -С. 447-454.
13. Сухова Т.В. Особенности свободнорадикального окисления. антиоксидантной защиты и состояния нервной системы у больных хроническим генерализованным пародонтитом : автореф. дис. ... канд. биол. наук. - М.. 2000. - 40 с.
14. Brown G.C. Nitric oxide and mitochondrial respiration // Biochim. Biophys. Acta. - 1999. - Vol. 1411 (2-3). - P. 351369.
15. Cabrera C.. Bohr D. The role of nitric oxide in the central control of blood pressure // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2005.
- Vol. 206. - Р. 77-81.
Поступила 03.06.2011
