CC BY
35
Раздел I
БИОЛОГИЯ СЛОЖНЫХ СИСТЕМ. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ И БИОИНФОРМАТИКА В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ
УДК: 616.155.16 + 615.851.001.6 D01:10.12737/21742
ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГЕМОГЛОБИНА С
ГАЛОПЕРИДОЛОМ
М.В. ЛУЩИК, В.И. БОЛОТСКИХ, А.В. МАКЕЕВА, И.В. ГРЕБЕННИКОВА
Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко, ул. Студенческая, д. 10, г. Воронеж, 394036, Россия
Аннотация. Представлены результаты исследования влияния галоперидола на структурно-функциональные свойства гемоглобина человека. Изучено комбинированное влияние температуры и лекарственного вещества на величину светорассеяния. Установлено, что молекулярные комплексы галоперидола с оксигемоглобином характеризуются меньшей термоустойчивостью по сравнению с немодифицированным гембелком. Обнаружено, что наиболее выраженные структурные изменения в молекуле гемоглобина наблюдалисьпри нагревании с лекарственным веществом при температуре 600С. Показано, что модифицирующее действие нейролептика носит выраженную концентрационную зависимость. Наиболее выраженный эффект наблюдался при концентрации лекарственного вещества 5*10-4 моль/л. Методом протолитометрического титрования установлена природа комплексо-образования лекарственного вещества с различными группами белка. Установлено, что галоперидол взаимодействует преимущественно с карбоксильными группами белка, а также с аминогруппами лизина. При взаимодействии гемоглобина с галоперидолом происходит блокирование преимущественно поверхностных или доступных для титрования скрытых ионогенных групп внутри макромолекулы. Анализ ИК-спектров показал, что под воздействием галоперидола в указанных концентрациях не происходит изменений во вторичной структуре белка. Установлено, что исследуемое лекарственное вещество проявляет высокую химическую активность, индуцируя при взаимодействии с гемоглобином конформационные изменения.
Ключевые слова: галоперидол, гемоглобин, тепловая денатурация, буферная емкость.
STUDY OF MOLECULAR MECHANISMS OF INTERACTION OF HEMOGLOBIN WITH HALOPERIDOL
M.V. LUSHIK, V.I. BOLOTSKYKH, A.V. MAKEEVA, I.V. GREBENNIKOVA
Voronezh State N.N. Burdenko Medical Academy, Studencheskaya str., 10, Voronezh, 394036, Russia
Abstract. The article presents the results of studies of the effect of haloperidol on the structural and functional properties of human hemoglobin. The combined effect of temperature and of the drug on the amount of light scattering was studied. It was found that the molecular complexes with haloperidol at oxyhemoglobin are characterized by lower thermal stability compared to the unmodified hemo-protein. It was revealed that there are most marked structural changes in the hemoglobin molecule under heating with the drug substance at a temperature of 600C. It is shown that the modifying effect of neuroleptics is pronounced concentration dependence. The most pronounced effect was observed at drug concentrations of 5 * 10-4 mol / l. Nature of complex formation of the drug with different groups of the protein was determined by the pro-tolith titration. It is found that haloperidol interacts preferentially with carboxyl groups of the protein, as well as with aminogroups of lysine. The interaction of hemoglobin with haloperidol is blocked mostly superficial or available for the titration of latent ionic groups within the macromolecule. Analysis of IR spectra
9
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2016 - V. 23, № 3 - P. 9-13
showed that there was no change in the secondary structure of the protein under the influence the indicated concentrations of haloperidol. It was found that the test drug shows high reactivity to induce the interaction with hemoglobin conformational changes.
Key words: haloperidol, hemoglobin, thermal denaturation, buffering capacity.
Введение. Широкий диапазон использования фармакологических агентов в эксперименте обусловливает постоянный интерес исследователей к вопросам дозирования применяемых лекарств. Лекарственные средства можно рассматривать как своеобразные реагенты, которые, будучи введенными в организм, способны вызывать изменения в структуре ферментов, клеточным мембран, рецепторов и других биополимеров, составляющих молекулярную основу жизни [6]. Кроме того, изучение клеточных механизмов фармакологического эффекта дает возможность выявлять и создавать новые, более активные и селективные лекарственные средства с менее выраженными побочными действиями. Галоперидол - нейролептик, применяемый при шизофрении, бредовых расстройствах и других заболеваниях, сопровождающихся галлюцинациями, психомоторным возбуждением [7]. Некоторые структурные и физико-химические свойства нейролептиков можно считать общими для этого класса в целом (рис. 1).
CI
Рис. 1. Структурная формула галоперидола
К числу таких свойств относится липо-фильность, обусловливающая интенсивное распределение в ткани и медленное, за счет удержания в тканях, выведение из организма путем биотрансформации до гидрофильных продуктов, происходящее преимущественно в печени с участием неспецифической оксиге-назной системы микросом. Физико-химические свойства определяют главные этапы пребывания галоперидола в организме: всасывание из желудочно-кишечного тракта, поступление в кровь, связывание с белками и форменными элементами крови, транспорт через гемато-
энцефалический барьер и другие мембранные структуры, взаимодействие с рецепторными образованиями и, наконец, метаболизм и выведение из организма [4]. Важными фармакоки-нетическими параметрами, которые могут быть исследованы in vitro, является связывание лекарства с белками крови. Для анализа фармакологического эффекта на молекулярном уровне важно знать, какая химическая группа лекарства и какой элемент макромолекулы рецептора взаимодействуют между собой. Гемоглобин является удобной моделью для изучения влияния различных агентов на белки, в частности на ферменты, так как простетическую группу данного гемопротеида - гем - можно рассматривать как аналог активного центра [6].
Цель исследования - так как один из этапов пребывания галоперидола связан с поступлением его в кровь и связыванием с ее белками и форменными элементами, целью настоящей работы стало изучение молекулярных механизмов взаимодействия гемоглобина с галопе-ридолом.
Материалы и методы исследования. В
опытах использовали растворы оксигемоглоби-на (Hb02) в 0,1 моль/л натрий-фосфатном буфере (рН=7,4), полученные из крови взрослых доноров, и растворы галоперидола в натрий-фосфатном буфере (рН 7,4) с концентрациями модификатора 5х10-5,5х10-4, 1х10-4моль/л соответственно. Буферные растворы НЬО2 имели концентрацию 5х10-5моль/л. Для получения растворов оксигемоглобина использовали метод Драбкина с модификацией Блюменфельда [5]. Концентрацию растворов НЬО2 определяли спектрофотометрически [2]. Для изучения инфракрасных спектров образцов применяли метод ИК-спектроскопии. Исследуемые растворы высушивали при комнатной температуре на полуприкрытых чашках Петри. Мелкораздробленные образцы тщательно перемешивали с порошком бромидом калия и прессовали таблетки. Регистрацию ИК-спектров осуществляли на спектрофотометре «Specord М-80» в диапзо-нах 4000-400 и 1600-1300 см-1. О термохимических превращениях гемоглобина, модифицированного галоперидолом, судили по величине т, характер" изующей интенсивность светорассеяния, которая связана пропорциональной
зависимостью от размера и формы исследуемых частиц [1,2]. Состояние последних оценивали косвенным методом: путем измерения светопропускания растворов контрольных и модифицированных галоперидолом образцов с последующим перерасчетом величины светорассеяния. Опыты проводили с помощью фотоколориметра концентрационного КФК-3 при длине волны 490 нм, при которой коэффициент молярной экстинции гемоглобина минимален. Контрольный и опытный растворы термоста-тировали на водяной бане типа LW -2 в течение 30 мин., так как именно за это время происходит полное связывание лекарства с белком. Подвергнутые воздействию температуры белковые растворы охлаждали до комнатной температуры 23 0С. С целью выявления возможных типов химических взаимодействий ионогенных групп белка с функциональными группами га-лоперидола применяли метод протолитомет-рического титрования [3].
Статическую обработку результатов экспериментов проводили с использованием стандартных пакетов Microsoft Excel. Рассчитывали средние значения вариант в группе из 4-5 доноров и стандартные отклонения. Полученные данные обрабатывали с использованием параметрических критериев (р<0,05).
Результаты и их обсуждение. Нагревание белковых растворов - один из надежных способов обнаружения внутримолекулярных нарушений белковых молекул в присутствии модифицирующего агента. Для оценки степени структурных превращений в HbО2, при его модифицировании галоперидолом, изучено комбинированное влияние температуры и лекарственного вещества на величину светорассеяния, которая связана пропорциональной зависимостью с размерами и формой исследуемых частиц (рис. 2).
В серии опытов по изучению величины светорассеяния модифицированного галоперидолом гембелка, проводимых при t=200C, установлено, что интенсивность светорассеяния модифицированного образца достоверно не отличается от контроля при концентрации лекарства 5х10-5 моль/л и 1х10-4 моль/л или возрастает на 4±0,23% при концентрации галоперидола 5х10-4 моль/л. В то же время, после инкубации при t=600C, выявлено помутнение и образование агрегатов денатурированного белка с модификатором в концентрации 5х10-4 моль/л. Вероятно, предшествующие этой дозе воздействия индуцируют накопление внутримолекулярных перестроек, которые реализуются резким кон-формационным переходом в глобине лишь при достижении критической суммы структурных
изменений, то есть в условиях достаточного количества модифицирующего агента.
С целью установления минимального порога чувствительности прореагировавших структур белка к действию лекарственного агента было исследовано модифицирующее действие гало-перидола в концентрации 5х10-5 моль/л. Результаты эксперимента показали, что при инкубации гемоглобина в течении 30 мин при ¿=60°С в присутствии данного модифицирующего агента величина тувеличивается на 8±0,31% относительно контроля.
I и
^^ 50
^^Н 40
^^ ^^^ 20
1 ) С^маль/л
Рис. 2. Комбинированное влияние температуры и галоперидола на интенсивность светорассеяния в растворах гемоглобина. Примечание: 1 - 5*10-5 моль/л; 2 - 1х10-4 моль/л; 3 - 5*10-4 моль/л
При повышении содержания галоперидола до 1х10-4 моль/л (при стандартных условиях опыта) установлено, что воздействие реагента при температурах 20 и 40° С на белок не позволяет выявить структурные изменения в апобелке, так как т гемоглобина, модифицированного галоперидолом, достоверно не отличается от контроля. При дальнейшем повышении температуры до 50°С выявлено увеличение интенсивности светорассеяния на 3±0,18% при той же концентрации лекарства. По всей вероятности, установленные нами денатурационные изменения в структуре апобелка отражают процесс химического взаимодействия галоперидола с реакционными центрами белковой глобулы. О степени скрытых структурных превращений, отражающих количество нарушенных связей или нарушение комплекса белка с модификатором, можно судить по величине т при действии максимальной температуры (60°). В опытах было установлено, что т термостатированных образцов белка с галопе-ридолом (С=1х104 моль/л) увеличивается до 18±0,32% относительно контроля.
С целью установления зависимости между числом структурных нарушений в белке и содержанием модификатора в растворе изучалась зависимость т от действия модификатора в концентрации 5х10-4 моль/л в интервале темпе-
ратур 40-50°С. Установлено, что при данных условиях происходит повышение т на 10±0,27 и 11±0,30% соответственно.
Полученные нами экспериментальные данные свидетельствуют в пользу представлений о разворачивании макромолекул модифицированного белка. Результаты исследования указывают на возрастающую доступность лекарственному средству скрытых гидрофобных и реакционных центров апобелка. Наблюдаемое при нагревании с галоперидолом увеличение светорассеяния раствора гемоглобина может указывать на то, что в его молекуле (при более низких температурах) появляются скрытые повреждения, которые увеличиваются, по-видимому, при повышении температуры и становятся более выраженными при 60°С.
Для выявления характера конформацион-ных изменений, происходящих в молекуле гемоглобина, под воздействием лекарственного вещества, исследованы спектры светопропускания гемоглобина в нативном и модифицированном состоянии в инфракрасной области. Анализ ИК-спектров показал, что под воздействием галоперидола в указанных концентрациях не происходит изменений во вторичной структуре белка.
Протолитометрическое титрование белковых растворов дает возможность получить сведения о характере изменения поверхности белковой глобулы при ее химической модификации [3]. Величина относительной буферной емкости белка (Др) (количество (мкл) КОН) определяет разницу между модифицированными нейролептиком образцами гемоглобина и контролем (нативный раствор белка).
Исследованы буферные свойства растворов гемоглобина после его взаимодействия с галопе-ридолом, взятым в концентрации 5*10-4 моль/л. По изменению Др в интервале рН 3-5; 5-9 и 9-11 нами установлены различные типы химических взаимодействий ионогенных групп белка с функциональными группами галоперидола.
Установлено, что степень изменения Др водных растворов ИЬО2, содержащих галопери-дол, неодинакова в выбранных областях рН. Анализ полученных данных проведенной серии опытов показал, что в области титрования карбоксильных групп (рН=3-5) наблюдается уменьшение Др на 56,0%.
В области рН=5-9 нейролептик вызывает уменьшение Др растворов ИЬО2 на 32,6%. Это может быть обусловлено рядом причин: хими-
ческим взаимодействием галоперидола с аминогруппами гистидина, а также с частью ионо-генных групп цистеина, определение которых требует специфического метода исследования.
При титровании растворов модифицированного лекарственным веществом белка в диапазоне рН 9-11 установлено уменьшение Др образцов на 65,2%. Отмеченное снижение величины р обусловлено, по всей вероятности, химическим взаимодействием галоперидола с е-аминогруппами лизина с образованием амид-ной связи типа Шиффовых оснований.
На основании полученных результатов мы предполагаем, что исследуемое лекарственное соединение, представляющее собой по химической структуре ароматический кетоспирт взаимодействует преимущественно с карбоксильными группами, благодаря наличию гидроксила в структуре его молекулы, а также с е-аминогруппами лизина, за счет присутствия химически активной карбоксильной группы. В первом случае возможно протекание реакции этерификации, конечным этапом которой является образование комплексов белка с кетоспир-том по карбоксильной группе р-аспарагиновой и у-глутаминовой аминокислот. Полученные экспериментальные данные соответствуют теоретическим представлениям о соотношении донорской активности первичных, вторичных и третичных аминов. В рассматриваемом случае в полном соответствии с теорией, карбонильная группа галоперидола, полярность которой повышена за счет увеличения фонда п-электронов в ароматическом кольце, вступает прежде всего во взаимодействие с более сильным донором -аминогруппой лизина.
Суммируя результаты проведенных серий опытов, следует отметить, что ароматический кетоспирт обладает выраженной способностью первично взаимодействовать с аминогруппами белка, а также менее активно с его карбоксильными группами, что обусловлено меньшей реакционной способностью гидроксильной группы галоперидола.
Установленная в опытах зависимость величины буферной емкости растворов белка в различных областях рН обусловливает процесс химического взаимодействия реагента с ионо-генными группами глобулы, позволяет сделать вывод о том, что исследуемый нейролептик, обладая выраженными свойствами кетона и в меньшей степени свойствами спирта, характе-
ризуется высоким уровнем стерического взаимодействия с поверхностными участками белковой глобулы и при взаимодействии с ней вызывают не только модификацию ее структуры, но и изменение соотношения числа гидрофобных участков. Вероятно, галоперидол способен не только эффективно проникать через гидрофобные барьеры (мембраны клеток), но также активно преобразовывать белково-липидные структуры за счет двунаправленного процесса химической модификации.
Выводы. На основании полученных данных мы предполагаем, что под воздействием галопе-ридола происходят конформационные перестройки в молекуле гемоглобина, не затрагивающие вторичную структуру. Молекулярные
Литература
1. 2.
3. Баева Е.С., Резван С.Г., Артюхов В.Г. Изучение механизмов взаимодействия антибиотиков различных классов с гемоглобином // Вестник ВГУ, серия: Химия. Биология. Фармация. 2012. № 2. С. 119-124.
4. Белоусов Ю.Б., Моисеев В.С., Лепахин В.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия. Руководство для врачей. М.: Универсум паблишинг, 1997. 531 с.
5. Козлов А.А., Простакова Т.М., Берковский А.Л. Пособие для врачей-лаборантов по методу определения гемоглобина. М., 2008. С. 8.
6. Макеева А.В., Лущик М.В., Болотских В.И. Исследование структурно- функциональных изменений гемоглобина человека под воздействием галоперидола // Современные проблемы науки и образования. Электронное издание. 2015. № 3. URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id= 17760 (дата обращения 01.02.2016).
7. Фурсова У.Н., Лущик М.В.Гемическая гипоксия и изменение функциональной активности гемоглобина // Международный студенческий научный вестник. 2015. № 2. С. 122-123.
комплексы галоперидола с оксигемоглобином характеризуются меньшей термоустойчивостью по сравнению с немодифицированным гембел-ком. При взаимодействии белковой молекулы с нейролептиком происходит блокирование преимущественно поверхностных или доступных для титрования скрытых ионогенных групп внутри макромолекулы, обусловленное накоплением скрытых структурных повреждений, которые были обнаружены спектрофотометриче-ски при нагревании исследуемых образцов модификатора белка при 60°С. Полученные данные позволяют констатировать, что галоперидол, проявляет высокую химическую активность, индуцируя при взаимодействии с глобулой необратимые конформационные изменения.
References
Artyukhov VG, Shmelev VP, Kovaleva TA. Biofizika [Biophysics]. Voronezh: Izd-vo VGU; 1994. Russian. Artyukhov VG, Nakvasina MA, Rezvan SG Vashanov GA. Workshop on biophysics [Workshop on Biophysics]. Voronezh: Publishing house of the Voronezh State University; 2001. Russian.
Baeva ES, Rezvan SG, Artyukhov VG. Izuchenie mek-hanizmov vzaimodeystviya antibiotikov razlichnykh klassov s gemoglobinom [The study of the mechanisms of interaction of antibiotics of different classes to hemoglobin]. Vestnik VGU, seriya: Khimiya. Biologiya. Farmatsiya. 2012;2:119-24. Russian. Belousov YuB, Moiseev VS, Lepakhin VK. Klini-cheskaya farmakologiya i farmakoterapiya. Ruko-vodstvo dlya vrachey [Clinical pharmacology and pharmacotherapy. Guidelines for doctors]. Moscow: Universum pablishing; 1997. Russian. Kozlov AA, Prostakova TM, Berkovskiy AL. Posobie dlya vrachey-laborantov po metodu opredeleniya gemoglobina [Manual for laboratory doctors by the method of determination of hemoglobin]. Moscow; 2008. Russian. Makeeva AV, Lushchik MV, Bolotskikh VI. Issledova-nie strukturno- funktsional'nykh izmeneniy gemoglobina cheloveka pod vozdeystviem galoperidola [The study of functional human hemoglobin structural changes under the influence of haloperidol]. Sovre-mennye problemy nauki i obrazovaniya. Elektronnoe izdanie. 2015;3. Available from: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id= 17760 (data obrash-cheniya 01.02.2016).
Fursova UN, Lushchik MV. Gemicheskaya gipoksiya i izmenenie funktsional'noy aktivnosti gemoglobina. Mezhdunarodnyy studencheskiy nauchnyy vestnik. 2015;2:122-3. Russian.
Артюхов В.Г., Шмелев В.П., Ковалева Т.А. Биофизика. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1994. 327 с. Артюхов В.Г., Наквасина М.А., Резван С.Г., Ваша-нов Г.А. Практикум по биофизике. Воронеж: Изд-во ВГУ, 2001. 224 с.
