CC BY
52
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН _2015, том 58, №4_
ФИЗИКА
УДК 541.64.543.422.23
И.Х.Юсупов, А.Д.Бахдавлатов, Т.М.Алидодов*, Н.Умаров, академик АН Республики Таджикистан Р.Марупов
ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ РАСТЕНИЯ ДОННИК ЛЕКАРСТВЕННЫЙ (MELILOTUS OFFICINALIS L.) МЕТОДОМ
СПИНОВЫХ МЕТОК
Физико-технический институт им.С.У.Умарова АН Республики Таджикистан, Таджикский технический университет им. академика М.С.Осими
Методом спиновой метки изучено влияние экологических условий и уровня естественного радиационного фона места произрастания на стабильность молекулярной подвижности нитроксиль-ного радикала, введённого в матрицу составных частей (стебель, листья, корень) донника лекарственного. Показано, что при комнатной температуре в спектрах ЭПР наблюдается заторможенность вращательной подвижности спиновой метки с временем корреляции гс<10-7с, которая свидетельствует об изменении системы меж- и внутримолекулярных водородных связей в области присоединения метки. Установлено, что в спектрах ЭПР параметры, характеризующие медленновра-щающийся радикал, изменяются незначительно, а параметр h/h - отношение амплитуды низкополь-ных линий слабоиммобилизованных меток, относящийся к быстровращающемуся радикалу, весьма чувствителен к конформационной подвижности макромолекул, что свидетельствует о структурных изменениях в составных частях донника.
Ключевые слова: спиновая метка - лекарственное растение донник - молекулярная структура -спектры ЭПР - экологические условия.
Донник в качестве лекарственного средства известен с древнейших времён. Народная медицина до сих пор использует водный настой этого растения при нервной возбудимости, головной боли, бессоннице, неврастении, меланхолии, в период климакса и при нарушениях менструаций, при бронхите, болях в мочевом пузыре и кишечнике, метеоризме [1-4].
Наибольшую популярность донник лекарственный имеет все же в народной медицине, однако и традиционная медицина часто практикует применение этого растения при назначении лечения и в производстве медикаментов.
В состав донника входят кумарины, в частности тонизирующий венозное кровообращение мелилотозид и флавоноиды [3].
Эффективный метод изучения динамики макромолекул - метод спиновой метки, заключащийся в том, что в макромолекулу вводят стабильный нитроксильный радикал, спектр ЭПР которого чувствителен к конформационной подвижности макромолекулы. Вследствие анизотропии
Адрес для корреспонденции: Юсупов Изатулло Ходжаевич. 734063, Республика Таджикистан, г. Душанбе, ул. Айни, 299/1, Физико-технический институт АН РТ. E-mail: [email protected]
фактора и сверхтонкого взаимодействия электронного спина с ядром атома азота спектр ЭПР нитроксильного радикала зависит от его ориентации во внешнем магнитном поле [5,6].
Стохастические изменения ориентации радикала модулируют магнитные взаимодействия, поэтому форма спектра ЭПР зависит от вращательной подвижности радикала. По форме спектра, регистрируемого в стандартных условиях (первая гармоника сигнала поглощения, ненасыщающие значения микроволновой мощности), можно оценить время корреляции вращательных движений ^радикала в диапазоне 5Л0-11-10-7с. [6].
Целью настоящей работы является изучение методом спиновых меток молекулярной структуры дикорастущего растения донника лекарственного в зависимости от влияния экологических условий и радиационного фона места произрастания. Составные части донника (листья, стебель, корень) были собраны в фазе цветения на различных высотах над уровнем моря с различными уровнями естественной радиации почв (см. табл.) в Согдийской области Республики Таджикистан.
Образцы донника тщательно очищали от сопутствующих веществ, сушили в тени при комнатной температуре, измельчали и из полученного порошка брали навеску 25 мг. В качестве спиновой метки использовали стабильный нитроксильный радикал (I) (США), имеющий следующую структурную формулу:
Исследуемые образцы лекарственного растения модифицировали спиновой меткой (I) следующим образом: навески образца по 25 мг помещали в 0.9 мм раствора в фосфатный буфер (pH = 9-10) с добавлением 0.1 мл этанолового раствора спиновой метки (I) с концентрацией (10-2 м/л), после чего концентрация радикала (I) в инкубационной среде достигала 4^10 м/л [7,8]. Смесь выдерживали в течение 5 суток при комнатной температуре, затем нагревали 2 ч при 333-343 К. Модифицированные образцы отмывали от непрореагировавшего радикала в следующей последовательности: вода - этанол, вода - этанол и вода до получения неизменного сигнала ЭПР. После многократного промывания образцы сушили при комнатной температуре.
Спектры ЭПР регистрировали на радиоспектрометре РЭ-1306 в стандартных молибденовых ампулах с внутренним диаметром 3.0 мм, в которые помещали по 25 мг спин-меченого образца. Спектры ЭПР записывали при следующих условиях: затухание СВЧ мощности 5 Дб, амплитуда развёртки магнитного поля 200 Э, скорость развёртки магнитного поля 40 Э/мин, амплитуда ВЧ модуляции 100 кГц.
Как показано в работах [9-15], модификация хлопковой целлюлозы спиновой меткой протекает по её гидроксильним группам; в данной работе при модификации лекарственного растения также радикал (1) ковалентно взаимодействует с гидроксильной группой структуры преимущественно с ОН-группой целлюлозной основы лекарственного растения. Об этом свидетельствует вид спектров ЭПР (рис.1), соответствующих заторможенному вращению радикала с частотой вращения у«108с-1. Измерения проводились при комнатной температуре.
На рис.1 и в таблице приведены параметры спектров ЭПР изученных спин-меченых образцов при комнатной температуре: 2Л'2 - расстояние между внешними экстремумами; А/ и Ак - полуширины линии в низком и высоком поле, соответственно; к' / к - отношение амплитуд низкопольных линий слабоиммобилизованных меток и АН0 - ширина линии центрального компонента спектра ЭПР.
Рис.1. ЭПР-спектры спин-меченых образцов составных частей донника (а-стебель, б-листья, в-корень) в зависимости от места произрастания, высоты над уровнем моря и радиационного фона: 1- Худжанд, 380 м, 0.28 мкЗв/ч; 2 - Кайраккум, 400 м, 0.1 мкЗв/ч; 3 - Котма, 450 м, 3.9 мкЗв/ч.
Как видно из рис.1, спектры ЭПР спин-меченых образцов при комнатной температуре представляют собой суперпозиции двух сигналов и сильную заторможенность вращательной подвижности спиновой метки с временем корреляции хс<10"7с, что характеризует неоднородность аморфных
областей в исследуемых образцах, в местах присоединения метки и свидетельствует о изменении системы меж- и внутримолекулярных водородных связей в области её присоединения.
Таблица
Параметры спектров ЭПР спин-меченых образцов составных частей донника в зависимости от высоты над уровнем моря и радиационного фона места произрастания
Место произрастания и высота м над ур.м. Радиоактивный фон, Я, мкЗв/ч. Составные части растения А1 Гс АН Гс АНо Гс 2Аг Гс И/Н
Худжанд 380 0.28 стебель 12.0 13.2 30.0 190.8 1.0
листья 12.0 12.0 27.6 183.6 0.9
корень - - - - -
Кайраккум 400 0.1 стебель 10.8 19.2 16.8 181.2 0.41
листья 9.6 7.2 28.8 183.6 1.08
корень 9.6 13.2 25.2 183.6 0.43
Котма 450 3.9 стебель 13.2 14.4 27.6 190.8 1.0
листья 8.4 12.0 26.4 183.4 0.36
корень 7.2 9.6 26.4 193.2 0.33
Из таблицы и рис.2 следует, что для составных частей донника параметры А/ и АН в спектрах ЭПР, относящиеся к медленновращающемуся (указанные стрелками II, рис.1) радикалу, изменяются в зависимости от радиационного фона места произрастания: то есть параметр АН для стебля донника (рис. 2. кривая 1) вначале резко уменьшается, а после 0.28 мкЗв/час незначительно увеличивается; для листьев (рис. 2. кривая 2) до 0.28 мкЗв/час вначале параметр АН резко увеличивается, затем практически остаётся неизменным; параметр А/ для стебля изменяется незначительно, практически прямая линия (рис.2, кривая 3), а для листьев, сначала резко увеличивается до 0.28 мкЗв/час, затем уменьшается (рис.2, кривая 4). Характер изменения параметра 2Л[также соответствует характеру изменений параметров А/ и АН (см. табл. и рис. 2).
Рис.2. Зависимость параметров ЭПР- спектра АкиА1 от радиационного фона Я, мкЗв/м , места произрастания донника, АН: 1 - стебель, 2 - листья; А1: 3 - стебель, 4 - листья.
Эти изменения свидетельствуют о появлении нового компонента в сигнале ЭПР, относящегося к быстровращающемуся радикалу (указаны стрелками I на рис.1), что свидетельствует о увеличении вращательной подвижности спиновой метки со временем корреляции тс—10 с, к°т°р°е характеризует изменение системы меж- и внутримолекулярных водородных связей в области присоединения метки.
На рис. 3 приведены графики изменения относительных параметров к' / к от радиационного фона места произрастания. Как видно из рисунка, параметр к' / к для стебля до 0.28 мкЗв/ч резко увеличивается, а потом практически остается неизменным (рис.3, кривая 1); для листьев сначала практически не изменяется, а потом резко уменьшается (рис.3, кривая 2), то есть при 0.38 мкЗв/ч происходят структурные переходы.
А '/И 1.0
0.8-
0.6-
0.4-
0.2
0.1
0.2
0,3
0.4
4 Я.мкШн
Рис.3. Зависимость параметров И /Ь спектров ЭПР от радиационного фона {Я, мкЗв/ч) и места произрастания
донника: 1 - стебель, 2 - листья.
Можно заключить, что параметры вращательной диффузии радикала, присоединённого к структуре донника, зависят от влияния экологических условий и радиационного фона места произрастания, и что параметр И /И, относящийся к быстровращающемуся радикалу, весьма чувствителен к конформационной подвижности макромолекул, что свидетельствует о структурных изменениях в составных частях донника.
Авторы благодарны профессору Г.И.Лихтенштейну за постоянный интерес к работе и практическую помощь в представлении нитроксильного радикала, столь необходимого при исследованиях молекулярной структуры методом спиновых меток.
Поступило 04.02.2015 г.
ЛИТЕРАТУРА
1. Валягина Е.Т. Лекарственные растения России. - СПб.: Издатель, 1997, 284 с.
2. Корсун У.Ф. Фитотерапевтический оздоровительный комплекс. - М.: Фитосан-Интер,1994. 31 с.
3. Гаммерман А.Ф., Гром И.И. Дикорастущие лекарственные растения СССР. - М.:Медицина, 1976, 288 с.
4. Ходжиматов М. - Дикорастущие лекарственные растения Таджикистана. - Гл. научн. ред. ТСЭ, 1989,с.114-117.
5. Фрид Д.Ж. Метод спиновых меток. Теория и применение. - М.,1979, с.97.
6. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. - М.: Наука, 1977, с. 256.
7. Юсупов И.Х., Бахдавлатов А.Д., Марупов Р. - ДАН РТ, 2012, т.55, №11, с. 880-886.
8. Юсупов И.Х., Бахдавлатов А.Д., Марупов Р. - Теоретическая и прикладная экология, 2014, №2, с. 61-65.
9. Юсупов И Х., Бободжанов П.Х., Марупов Р. и др. - ВМС. Сер. А, 1984, т.26, №2, с.369-374.
10. Марупов Р., Юсупов И.Х., Бободжанов П.Х. и др. - ДАН АН СССР, 1981, т.256, №2, с. 414-17.
11. Куликов А.В., Юсупов И.Х., Бабаджанов П.Х. и др. - ЖПС, 1991, т.55, №6, с. 961-965.
12. Бабаджанов П.Х., Юсупов И.Х., Марупов Р. - ЖПС, 1992, т.56, №3, с. 424-428.
13. Юсупов И.Х., Бабаджанов П.Х. - Изв. АН РТ. Отд.физ.-мат., хим., геол. и техн.н., 2012, №2(147), с. 52-57.
14. Юсупов И.Х., Лихтенштейн Г.И. - Биофизика, 2012, т.57, №2, с. 286-291.
И.Х.Юсупов, А.Д.Бахдавлатов, Т.М.Алидодов*, Н.Умаров, Р.Марупов
ТАДЦИЦИ ТАРКИБИ МОЛЕКУЛАВИИ РАСТАНИИ ЗАРБЕХИ ДОРУВОРЙ(MELILOTUS OFFICINALIS L.) БО УСУЛИ НИШОНАХОИ СПИНЙ
Институти физикаю-техникаи ба номи С.У.Умарови Академияи илм^ои Цум^урии Тоцикистон, *Донишго%и техникии Тоцикистон ба номи академик М.С.Осими
Бо усули нишонахои спинй таъсири мухити экологй ва радиатсионии чои сабзиш дар ус-тувории серхаракатии радикалхои нитроксиле, ки вориди матрисаи кисмхои таркибй (тана, барг, реша) зарбехи доруворй шуда, омухта шудаанд. Нишон дода шудааст, ки дар хароратхои хонагй дар спектрхои радикалии электромагнитию парамагнитй, холати харакати сустдаврза-нии нишонахо бо вакти коррелятсионии Тс<10_7с мушохида карда мешавад, ки ин аз тагйирёбии системахои байнй - ва дохилии молекулавии алокахои гидрогенй маълумот медихад, муайян карда шудааст, ки параметри h/h, ки ба амплитудахои майдони паст моликанд ва ба радикалхои зудтагйирёбанда тааллук доранд, бенихоят хассос мебошанд, ки дар бораи таъгирёбии гуногунии структураи кисмхои таркибии донника гувохй медиханд. Калима^ои калиди: нишонаи спинй - растании дорувории зарбех - сохти молекулавй- спектрхои радикалии электронию парамагнитй - мухити экологи.
I.Kh.Yusupov, A.D.Bahdavlatov, T.M.Alidodov*, N.Umarov, R.Marupov ANALYZING MOLECULAR STRUCTURE OF A MEDICINAL PLANT CLOVER (MELILOTUS OFFICINALIS L.) METHOD SPIN LABELS
S.U. Umarov Physico-Tehnical Institute, Academy of Sciences of the Republic of Tajikistan, Tajik Technical University named academic M.S.Osimi
Spin label method to study the effect of environmental conditions and the level of natural background radiation locus on the stability of the molecular mobility nitrooksil radical introduced into the matrix components (stem, leaf, root) medical melilotus. It is shown that at room temperature EPR spectra observed retardation of rotational mobility of the spin label with the correlation time xs<10"7s, which indicates changes in the system of between- and intramolecular hydrogen bonds in joining the mark. It was established that in the EPR spectra parameters characterizing slowly rotation changes radical, and the parameter h'/h- ratio of the amplitude of low-floor line weakly mobilized marks belong to the radical high speed very sensitive, indicating that the various structural changes in the components of the clover.
Key words: spin label - a medical plant clover - molecular structure-EPR spectra - the environmental conditions.
