CC BY
53
168 |и ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА_'1 (112) март 2018 г.
УДК 616.314.13 + 616.716.4:611.018.2-007.17
A.C. КОРШУНОВ1, С.Н. МОСКОВСКИЙ1, В.П. КОНЕВ1, И.Л. ШЕСТЕЛЬ1, Д.О. СЕРОВ1, Ю.О. ШИШКИНА1, A.B. СУБОЧ2, С.О. МАРКОВСКИЙ3
10мский государственный медицинский университет, 644099, г. Омск, ул. Ленина, д. 12 2Бюро судебной-медицинской экспертизы, 644112, г. Омск, ул. Перелета, д. 9 3Городская клиническая больница №11, 644105, г. Омск, ул. Нахимова, д. 55
Исследование минерального компонента и органического матрикса костной ткани с использованием метода атомно-силовой микроскопии
Контактная информация:
Коршунов Андрей Сергеевич — ассистент кафедры челюстно-лицевой хирургии, тел. +7-904-329-54-49, e-mail: Andrey_K_180588@mail.ru Московский Сергей Николаевич — кандидат медицинских наук, доцент кафедры судебной медицины и правоведения, тел. +7-960-997-63-13, e-mail: moscow55@mail.ru
Конев Владимир Павлович — профессор, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой судебной медицины и правоведения, тел. +7-913-963-05-97, e-mail: vpkonev@mail.ru
Шестель Игорь Леонидович — кандидат медицинских наук, доцент кафедры судебной медицины и правоведения, тел. +7-913-963-05-97, e-mail: vpkonev@mail.ru
Серов Дмитрий Олегович — клинический ординатор кафедры челюстно-лицевой хирургии, тел. +7-913-148-31-68, e-mail: dimon-.93@mail.ru
Шишкина Юлия Олеговна — ассистент кафедры судебной медицины и правоведения, тел. +7-913-963-05-97, e-mail: vpkonev@mail.ru Субоч Андрей Владимирович — заместитель начальника бюро судебной-медицинской экспертизы, тел. +7-913-963-05-97, e-mail: vpkonev@mail.ru
Марковский Сергей Олегович — заведующий отделением челюстно-лицевой хирургии, тел. (3812) 28-42-62, e-mail: muzgkb11@mail.ru Статья поступила: 13.02.2018, принята в печать: 26.03.2018.
Использование методом атомно-силовой микроскопии костной ткани позволяет детально изучить органический матрикс и минеральный компонент, при этом метод позволяет изучить архитектонику уровня минерализации коллагеновых волокон. По результатам исследования костной ткани при патологии соединительной ткани указанным методом удалось визуализировать наличие пустот, что влечет за собой изменение структуры залегания минеральных элементов кости, изменение формирования объединений кристаллов, а также изменение количества минеральных компонентов в единице объема кости.
Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия, костная ткань.
Для цитирования: Коршунов А.С. , Московский С.Н. , Конев В.П., Шестель И.Л., Серов Д.О. , Шишкина Ю.О., Субоч А.В., Марковский С.О. Исследование минерального компонента и органического матрикса костной ткани с использованием метода атомно-силовой микроскопии. Практическая медицина. 2018, 1 (112), С. 168-172.
A.S. KORSHUNOV1, S.N. MOSKOVSKIY1, V.P. KONEV1, I.L. SHESTEL1, D.O. SEROV1, Yu.O. SHISHKINA1, A.V. SUBOCH2, S.O. MARKOVSKiY3
1Omsk State Medical University, 12 Lenin Str., Omsk, Russian Federation, 644099 2Bureau of Forensic Medical Examination, 9 Pereleta Str., Omsk, Russian Federation, 644112 3City Clinical Hospital No. 1, 55 Nakhimov Str., Omsk, Russian Federation, 644105
Research into the mineral component and organic matrix of bone tissue using the method of atomic-force microscopy
Contact:
Korshunov A.S. — Assistant Lecturer of the Department of Maxillofacial Surgery, tel. +7-904-32-95-449, E-mail: Andrey_K_180588@mail.ru Moskovskiy S.N. — Cand. Med. Sc., Associate Professor of the Department of Forensic Medicine and Law, tel. +7-960-997-63-13, e-mail: moscow55@mail.ru
Konev V.P. — Professor, D. Med. Sc., Head of the Department of Forensic Medicine and Law, tel. +7-913-963-05-97, e-mail: vpkonev@mail.ru
Shestel I.L. — Cand. Med. Sc., Associate Professor of the Department of Forensic Medicine and Law, tel. +7-913-963-05-97, e-mail: vpkonev@mail.ru
Serov D.O. — clinical resident doctor of the Department of Maxillofacial Surgery, tel. +7-913-148-31-68, e-mail: dimon-.93@mail.ru Shishkina Yu.O. — Assistant Lecturer of the Department of Forensic Medicine and Law, tel. +7-913-963-05-97, e-mail: vpkonev@mail.ru Suboch A.V. — Deputy Director of the Bureau of Forensic Medical Examination, tel. +7-913-96305-97, e-mail: vpkonev@mail.ru Markovskiy S.O. — Head of the Department of Maxillofacial Surgery, tel. (3812) 28-42-62, e-mail: muzgkb11@mail.ru
The method of atomic-force microscopy of bone tissue allows studying the organic matrix and mineral component in detail. The method makes it possible to study the architectonics of the collagen fibers mineralization level. According to the results of the bone tissue investigation in the presence of connective tissue pathology using this method, it was possible to visualize the presence of cavities, which entails the change in the deposition structure of the bone mineral elements, the change in the formation of crystal combinations, and the change in the amount of mineral components per bone volume unit. Key words: atomic-force microscopy, bone tissue.
Введение
Вопросы исследования костной ткани, несмотря на разнообразные подходы, остаются актуальными и по сегодняшний день [1]. Фундаментальные исследования, включающие макроскопическое исследование костной ткани с оценкой компактного и губчатого вещества, гистологическими исследованиями костной ткани, оставляют многочисленные нерешенные вопросы [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]. Большинство их связано в основном с недостаточным исследованием пространственной организацией костной ткани [1], в то время как результаты соотношения органического и минерального матрикса, особенности организации минеральных частиц и пространственная укладка волокон коллагена внесут существенный вклад в изучение проблемы несовершенного остеогенеза, раннего остеопороза и остеопении, а также вопросы лечения и профилактики данных патологических процессов.
Цель работы: изучить строение минерального компонента и органического матрикса костной ткани с помощью метода атомно-силовой микроскопии (АСМ-исследования).
Материал и методы исследования
Для реализации поставленных задач нами были проведены патоморфологические, рентгенологические и АСМ исследования. В секционных исследованиях мы прибегали к поиску диагностических критериев остеопении, остеопороза (на фоне дисплазии соединительной ткани (ДСТ), при этом были использованы как скрининговые, так и клинические методы исследования. Основной задачей патоморфологических исследований было выявление качественных характеристик костной ткани у лиц с дисплазией соединительной ткани.
Учитывая тот факт, что морфологические исследования у лиц с ДСТ крайне затруднены, были проведены исследования на трупах погибших от несчастных случаев с последующим анализом медицинских документов. Нами обследовано 130 трупов обоего пола в возрасте от 20 до 40 лет с признаками дисплазии соединительной ткани. Группу
сравнения составили 64 секционных наблюдения погибших без ДСТ.
Для морфологического исследования было проведено прицельное исследование архивного биоп-сийного и операционного материала в количестве 120 у лиц в возрасте от 20 до 59 лет.
Морфологическому исследованию подвергались фрагменты плоских(нижней челюсти) и трубчатых костей (бедренная кость).
Для исследования на базе Омского государственного технического университета кафедры «Оборудования и технологии сварочного производства» с использованием полировально — шлифовального станка Нейрис, шлифовальных кругов hermes с разной степенью зернистости, и полировальных кругов с алмазной суспензией Akasel, разного количества микрон. Осмотр образцов осуществлялся на оптическом микроскопе марки Olympusjx 41, с увеличением 1000 крат, при этом изучалось микроскопическое строение костной ткани.
Костную ткань распиливали на блоки размером от 0,008 до 0,125 см3, которые помещали в 2% раствор натрия хлорида и проводили высаливание белков, форменных элементов крови и частиц жира из трабекул костной губчатой ткани в течение 24^48 часов. Далее промывали блоки водой, осуществляли гидролиз в 2 % растворе гидроксида натрия в течение 24^48 часов, затем гидролизат сливали, а блоки промывали водой при постоянном помешивании до полной нейтрализации гидрокси-да натрия, помещали блоки в 3-4 % раствор перекиси водорода на 10^16 часов, промывали блоки дистиллированной водой, далее в течение от 48 до 72 часов осуществляли обезжиривание блоков в смеси хлороформа с этанолом, взятых в соотношении 2:1, после чего блоки промывали дистиллированной водой, при постоянном помешивании, затем прогревали, равномерно повышая температуру от 600 до 1200°С, дополнительно прогревали при 1200^1300°С в течение 2-5 минут.
Также технический результат достигался за счет использования для замещения и восстановления костных дефектов костного минерального компонента, полученного в соответствии с вышеописан-
1Z0
ПРАКТИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА
'1 (112) март 2018 г.
Рисунок l. Фибриллы и субфибриллы атомно-силовой микроскопии без ДСТ
Рисунок 2. Фибриллы и субфибриллы атомно-силовой микроскопии без ДСТ
ным способом и выполненного в виде блоков или крошки.
Полученный таким образом костный минеральный компонент использовали в виде блоков или измельчали до получения костной крошки с размером частиц 700-2000 мкм, фасовали в стеклянные флаконы и стерилизовали потоком быстрых электронов. Ультраструктурное строение изучалось на базе Омского государственного университета кафедры «Прикладной и медицинской физики», с использованием сканирующего зондового микроскопа Solver Pro (NT — MPT, Россия). Анализ образцов АСМ-изображения осуществлялся с использованием программного модуля обработки изображения Image Analysis NT — VDT.
Результаты исследования
Основу костного матрикса образуют коллаге-новые фибриллы и аморфное вещество, которые подвергаются процессу минерализации в виде округлых пластин со средней шириной 5-6 мкм, длиной — 6-8 мкм, высотой — 100-120 нм. При зондовой микроскопии костной ткани видно, что молекулы коллагена не связаны между собой «конец в конец», а между ними имеется промежуток в 35-40 нм (рис. 1). Предполагается, что в костной ткани эти промежутки выполняют роль центров минерализации. В пластинчатой костной ткани более 65 % общей массы приходится на внутри- и межфибриллярные минеральные отложения, которые сформированы кристаллами гидроксиапатита. Форма и размеры этих мелких пластинок значительно варьируют. Встречаются варианты овальной, ромбической, треугольной и веретеновидной формы. Наиболее характерными оказались два варианта, различающиеся особенностями морфологии и пространственной ориентации минеральных отложений. Первый вариант представлен чешуевидными пластинками неправильной формы, которые стыкуются или налегают друг на друга. Их размеры показывают следующие средние значения: ширина — 35-70 нм, длина — 170-220 нм, толщина — 3-8 нм. Однако на малых полях скани-
рования хорошо видно, что между ними встречаются минеральные композиты значительно меньших размеров. Это вариант указывает, что в составе отдельных пластинок различимы более мелкие составляющие компоненты в виде округлых минеральных частиц диаметром 14-15 нм и толщиной 1-2 нм, объединения которых и приводят, по-видимому, к формированию пластинок следующих размерных классов.
Второй вариант организации минерального компонента представлен в виде вытянутых веретено-видных кристаллов, ориентированных параллельно друг другу. На отдельных участках они формируют короткие плоские пучки шириной 0,4-0,8 мкм и длиной 1-2 мкм, имеющие ромбовидную форму. У них более тонкая структурная организация этих участков. Отчетливо прослеживаются длинные веретеновидные или цилиндрические минеральные композиты размером 200-500х15-50х10-20 нм, ориентированные параллельно друг другу. На больших площадях сканирования в этих зонах регистрируются ряды длинных, параллельно лежащих волокон с диаметром 50-100 нм, которые представляют собой минеральный каркас коллаге-новых фибрилл.
Исследование органического матрикса методом атомно-силовой микроскопии показало, что фиксированные и контрастированные фибриллы коллагена выглядят поперечно исчерченными с периодом 67 нм, который включает одну темную и одну светлую полоски, с диаметром в среднем 100 нм. Зарегистрированная толщина предполагает наложение и/или объединение двух или более пластин (рис.1). Подобный механизм формирования и роста минеральных объединений приводит к образованию первого варианта минеральных частиц. Его описание преобладает в литературе и представляется в виде стыкующихся пластинок неправильной формы или чешуек. Анализ полученных в представленной работе АСМ-изображений позволяет предположить, что такие объединения кристаллов соответствуют минерализованному аморфному веществу на сформированных участках костной по-
верхности. Считают, что такое строение максимально повышает сопротивление всего агрегата растягивающим нагрузкам.
При этом у лиц с патологией соединительной ткани мы наблюдали, что сопоставимые измерения длины и поперечника коллагеновых волокон сильно варьировали, с увеличением промежутка между волокнами до 98 нм (в среднем 84 нм) и уменьшения поперечного размера волокон до 40 нм (в среднем 56 нм). На определенном уровне структурной организации могут появляться и объединения второго морфологического варианта — в виде веретеновидных частиц. Их строгая параллельная ориентация, размеры и анализ взаимного расположения, включая и формирование пучков, позволяют заключить, что эти минеральные компоненты ассоциированы с коллагеновыми фибриллами (рис. 2).
Заключение
Таким образом, минеральные объединения и пространственная архитектоника костной ткани дают возможность определить уровни минерализации коллагеновых волокон. При оценке результатов исследования костной ткани видно, что основным различием между группой контроля и пациентами с патологией соединительной ткани (остеопенией, остеопорозом) является наличие пустот, что влечет за собой изменение структуры залегания минеральных элементов кости, изменение формирования объединений кристаллов в виде второго варианта, а также изменение количества минеральных компонентов в единице объема кости. По своему
максимальному диаметру и характерному расположению они, вероятнее всего, связаны с поверхностью коллагеновых фибрилл, в которых процесс минерализации еще не завершен (или нарушен).
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, финансовой поддержки, о которых необходимо сообщить.
ЛИТЕРАТУРА
1.Московский С.Н., Коршунов А.С., Шестель И.Л. Использование атомно-силовой микроскопии в изучении плотных тканей орофациальной области // Казанский медицинский журнал. — Т.93. — № 6. — 2012. — С. 887-890.
2. Jaschouz D., Paris O., Roschger P., Hwang H.S., Fratzl P. Pole figure analysis of mineral nanoparticle orientation in individual trabecular of human vertebral bone // J. Appl. Crystallogr. — 2003. — V. 36. — P. 494-498.
3. Kuangshin T., Hang J.Q., Ortis C. Effect of mineral content on the nanoindentation properties and nanoscale deformation mechanisms of bovine tibial cortical bone // J. Materials science: Materials in medicine. — 2005. — V. 16 — № 8. — P. 1-12.
4. Landis W.J., Song M.J., Leith A., McEwen L. Mineral and organic matrix interaction in normally calcifying tendon visualized in three dimensions by high-voltage electron microscopic tomography and graphic image reconstruction // J. Struct. Biol. — 1993. — № 110. — P. 39-54.
5. Landis W.J., Hodgens K.J. Mineralization of collagen may occur on fibril surfaces: evidence from conventional and high-voltage electron microscopy and three-dimensional imaging // J. Struct. Biol. — 1996. — V. 117. — С. 24-35.
6. Lees S., Prostak K.S., Ingle V.K., Kjoller K. The loci of mineral in turkey leg tendon as seen by atomic force microscope and electron microscopy // Caicif. Tissue Int. — 1994. — V. 55. — P. 180-189.
7. Rubin M.A., Jasiuk L., Taylor J, Rubin J., Ganey T., Apkarian R.P. ТЕМ analysis of the nanostructure of normal and osteoporotic human trabecular bone // Bоnе. — 2003. — V. 33. — № 3. — Р. 270-282.
