CC BY
3УДК 599.322/.324:577.29
А. Н. Верчук, Т. В. Осадчук
ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ДНК-МАРКЕРОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ОСОБЕЙ БОБРА РЕЧНОГО (CASTOR FIBER) В КРИМИНАЛИСТИЧЕСКИХ ЦЕЛЯХ
Государственное учреждение «Научно-практический центр Государственного комитета судебных экспертиз Республики Беларусь» Республика Беларусь, 220114, г. Минск, ул. Филимонова, 25 e-mail: a.n.verchuk@mail.ru
Бобр речной (Castor fiber) является одним из объектов судебной экспертизы, для идентификации которого наиболее актуальным является анализ ДНК, основанный на применении микросателлитных маркеров. Целью работы являлась разработка тест-системы для ДНК-идентификации особей бобра речного в рамках судебно-экспертной деятельности, а также оценка генетического разнообразия исследованной популяции с помощью разработанной тест-системы. Для создания мультилокусной тест-системы были протестированы 30 микросателлитных маркеров, специфичных для бобра речного и его ближайшего родственника — бобра канадского. По результатам проведенного исследования было отобрано 9 STR-локусов (CF17, CF18, CF19, CF30, CF33, CF44, CF49, Сса8, Cca62), на основе которых создана мультилокусная тест-система. По результатам генотипирования 115 особей животных с помощью разработанной тест-системы дана оценка генетического разнообразия белорусской популяции бобра речного. Анализ результатов исследования свидетельствует о невысоком уровне внутривидового разнообразия исследованной выборки.
Ключевые слова: ДНК-маркер, бобр речной, STR-маркеры, мтДНК, судебная экспертиза, генотипирование.
Введение
К роду бобры (Castor) относятся полуводные млекопитающие, которые являются самыми крупными грызунами в Евразии и Северной Америке и вторыми по величине грызунами в мире после капибары (Hydrochoerus capybara). В роду представлены два сохранившихся вида бобра: бобр речной, или европейский (Castor fiber), ареал которого простирается по Европе и Азии, и канадский бобр, или американский (Castor canadensis). Канадский бобр является аборигенным видом для Северной Америки, был завезен в Европу, где и акклиматизировался [1, 2]. Оба вида имеют значительно схожий фенотип, что делает их почти неразличимыми по внешнему виду. Но, несмотря на морфологическое сходство, отмечаются биохимические особенности и различное количество хромосом (в кариотипе речного бобра 48 хромосом, у канадского бобра — 40), что подтверждает их разделение на отдельные виды [3], поэтому для их дифференциации могут применяться молекулярные и цитогенети-ческие методы.
Бобры моногамны и живут поодиночке или семейными группами. Полная семья состоит из 5-8 особей: семейной пары и молодых бобров — приплода прошлого и текущего годов [4].
Бобры являются мощным биогенным фактором и главной преобразующей силой после человека, сильно влияющим на среду в местах их обитания. Они строят плотины и создают запруды, превращая сухие лесные участки в водно-болотные угодья, в которых обеспечивают стабильный уровень воды [1, 2], воздействуя косвенно или напрямую, изменяют химический состав почвы и вод, рельеф, прибрежную флору [5, 6]. Масштабы воздействия зависят от продолжительности жизни колонии данного вида [7].
На протяжении многих веков бобры интенсивно добывались людьми для получения меха и мяса, а также бобровой струи и жира, особенно хвостового, которые использовались в лечебных целях. По этой причине бобр речной, как ценный промысловый вид, привлекал к себе внимание многих охотников и браконье-
ров, а также исследователей [8, 9]. Интенсивная охота привела к постепенному исчезновению бобров с обширных территорий. В начале XX в. на территории Европы бобры практически вымерли [10]. Поэтому с 1920-х гг. были начаты программы реинтродукции бобра речного, который находился под строгой охраной. Благодаря предпринятым мерам численность бобра начала медленно восстанавливаться, что привело к увеличению фактов незаконной охоты.
На территории современной Беларуси целенаправленное изучение бобра речного началось в 1920-х гг., когда он находился на грани полного исчезновения [11]. Основное внимание обращали на поиск мест, где еще могли сохраняться данные животные. К 1929-30 гг. в восточной части страны исследователи насчитывали около 170 бобров в 54 местообитаниях. В результате проводимых мероприятий численность бобра речного в Беларуси стабильно росла, и к концу 1960-х гг. насчитывалось порядка 24-31 тыс. особей. До начала 1990-х гг. численность вида держалась на относительно стабильном уровне, а в период с 1992 по 1996 гг. — резко снизилась с 20 до 12 тыс. особей. Однако в последующие годы произошло быстрое восстановление численности популяции, и к 2010 г. насчитывалось около 65 тыс. особей бобра речного. В настоящее время численность бобров в Беларуси держится на относительно стабильном уровне. На рисунке 1 показана динамика восстановления численности популяции бобра речного на территории Беларуси начиная с 1930 г. [4, 12-15].
Для изучения генетического разнообразия животных, в том числе и бобра речного, обычно используют микросателлитные маркеры (STR, Short Tandem Repeat), которые являются наиболее универсальным инструментом для молекулярно-генетической характеристики и идентификации животных. В настоящее время разработано значительное количество STR-маркеров для вида бобр речной, однако первые исследования начинались с изучения генетического разнообразия бобра канадского. Использование микросателлитов, разработанных для вида C. canadensis, для изучения популяций европейских бобров, описано в различных исследованиях [17, 19-21].
В 2008 г. группой американских ученых были разработаны и охарактеризованы 10 микросателлитных локусов у бобра канадского (C. canadensis). В исследовании были использованы образцы 60 животных из южного и центрального Иллинойса, а для дизайна праймеров было выбрано 50 последовательностей. После проведенного исследования панель отобранных маркеров включала следующие локусы: Сса4, Сса5, Сса8, Сса9, Сса10, Сса13, Сса15, Сса18, Сса19. Данные локусы характеризовались высоким полиморфизмом и имели от 5 до 13 аллелей на локус с наблюдаемой гетерозиготностью от 0,317 до 0,867 [16].
Позднее, в 2009 г., были разработаны еще девять ядерных микросателлитных локусов для C. canadensis: Сса15, Сса20, Сса56, Сса62, Сса76, Сса92, Сса112, Сса122, Сса151. Все разработанные локусы были апробированы на 55 животных из популяций Аризоны и 30 животных из Висконсина. Проведенные иссле-
Рис. 1. Количество особей бобра речного (C. fiber) на территории современной Беларуси с 1930 по 2021 гг.
дования выявили один мономорфный локус Сса151 для обеих исследуемых групп, остальные локусы оказались полиморфными. Количество аллелей в локусах колебалось от 2 до 4 в популяции Аризоны и от 5 до 12 в популяции Висконсина. Средняя гетерозиготность варьировала от 0,27 до 0,65 в популяции Аризоны и от 0,13 до 0,86 в популяции Висконсина. Разработанные в этом исследовании микросател-литные маркеры, а также маркеры, описанные J. Crawfe^ соавторами, были использованы для амплификации на образцах бобра речного [16, 17]; четыре вновь разработанных маркера и восемь ранее описанных маркеров успешно амплифицировались, при этом все четыре новых локуса и пять ранее опубликованных были полиморфными [17].
В 2010 г. с целью изучения генетической структуры популяции и подвидовой дифференциации бобра речного были разработаны 58 пар праймеров, однако только 25 из них давали воспроизводимые ампликоны правильного размера. С помощью дальнейшего анализа было отобрано 15 микросателлитных локу-сов для изучения бобров вида C. fiber: CF05, CF06, CF07, CF17, CF18, CF19, CF21, CF30, CF31, CF32, CF33, CF41, CF44, CF48, CF49. Количество аллелей на локус колебалось от двух до шести с наблюдаемыми значениями гетерозиготности от 0,24 до 0,77. Для трех ло-кусов (CF06, CF18, CF49) наблюдался значительный дефицит гетерозигот [18].
В исследовании, проведенном в 2015 г. для оценки происхождения в колониях бобра речного (38 особей) в Кировской области Российской Федерации, использовали 26 микросателлитных локусов, разработанных для бобра речного и бобра канадского [16-18]. В связи с тем, что амплификация с использованием семи праймеров, первоначально разработанных для бобра канадского, имела низкую эффективность у бобра речного, были внесены изменения в последовательность прайме-ров. Восемь локусов проявили себя как моно-морфные (Cca5, Cca20, CF5, CF7, CF21, CF30, CF48, CF49) и не использовались для дальнейшего анализа. Три локуса показали значительный дефицит гетерозигот (Cca112, CF18, CF33) и также были исключены из дальнейшего исследования. В остальных 15 локусах наблюдалось от 2 до 5 аллелей (в среднем 2,9) [19].
9 микросателлитов, опубликованных ранее [16], в 2017 г. были амплифицированы у бобра речного из Чехии (32 особи) и Латвии (27 особей) [20]. Для исследованных особей бобра речного из Чешской Республики полиморфизм был показан в шести локусах, в колониях латвийских бобров — только в пяти ло-кусах. В полиморфных локусах выявлялось от 2 до 4 аллелей. Результаты, полученные для чешской популяции в 2017 г., сопоставимы с результатами, полученными для особей речного бобра К. РеЬ^еггапо с соавторами в 2009 г. [17]. Что касается латвийской популяции, результаты также аналогичны, за исключением локуса Сса5, где наблюдался только один аллель [20].
Примерно в это же время было проведено исследование по 11 микросателлитным маркерам, разработанным для канадского бобра [16, 17], с использованием 251 образца бобров из швейцарской популяции. Количество аллелей на локус колебалось от одного (для локусов Сса5 и Сса72) до шести, среднее число аллелей в локусе составило 2,5 [21].
В целом можно отметить, что в описанных популяциях бобра речного было обнаружено низкое аллельное разнообразие или его отсутствие (например у бобров Кировского региона России восемь локусов были мономорфными). Такой довольно низкий уровень генетической изменчивости может быть связан с генетической однородностью реинтродуцированных популяций европейских бобров, которая связана с прохождением популяций бобра через «бутылочное горлышко».
Каждая из исследованных популяций характеризовалась низким внутривидовым полиморфизмом, что может быть результатом вымирания части популяции под воздействием антропогенного фактора, а также может быть следствием изолированности популяций бобров водоразделами крупных европейских рек, выступающих в качестве барьеров и ограничивающих поток генов между ними.
Целью данной работы являлась разработка тест-системы для ДНК-идентификации особей белорусской популяции бобра речного в рамках судебно-экспертной деятельности, а также оценка генетического разнообразия исследованной популяции с помощью разработанной тест-системы.
Материалы и методы
В качестве материала для исследования использовали образцы шкур и мышечной ткани от 115 особей бобра речного, собранных на территории Республики Беларусь: 60 образцов из Минской области, 2 из Брестской, 15 из Витебской, 28 из Гомельской, 1 из Гродненской, 9 из Могилевской.
ДНК выделяли по методике, основанной на высвобождении ДНК в ходе инкубирования биологического материала в лизирую-щем буфере, содержащем 2%-й додецилсуль-фат натрия (SDS), лизат подвергали процедуре очистки на силикагеле [22].
Микросателлитные маркеры отбирали на основе анализа данных литературы. Всего в исследовании было протестировано 30 микросателлитных маркеров: 14 маркеров, разработанных для вида бобр речной (Castor fiber) (CF05, CF06, CF07, CF17, CF18, CF19, CF21, CF30, CF32, CF33, CF41, CF44, CF48, CF49) и 16 маркеров, разработанных для вида бобр канадский (C. canadensis) (Cca4, Cca5, Сса8, Cca9, Cca10, Cca13, Cca15, Cca18, Cca19, Cca20, Cca56, Cca62, Cca76, Cca92, Cca112, Cca122) [16-19].
Для всех исследованных локусов прямые праймеры имели флуоресцентные метки на 5'-конце. Подбор маркеров для тест-системы проводили с учетом температуры отжига праймеров, типа тандемного повтора, ге-терозиготности, длины амплифицированного фрагмента. Для предотвращения загрязнения образцов и последующих ошибок генотипи-рования в каждый анализ включали положительный (образец с выявленным ранее генотипом) и отрицательный (без целевой матрицы) контроли ПЦР.
Анализ результатов ПЦР осуществляли методом капиллярного электрофореза в генетическом анализаторе Applied Biosystems 3500 (Thermo Fisher Scientific, США) в режиме ге-нотипирования. Размер аллелей определяли в парах нуклеотидов (п. н.) путем сравнения длины со стандартом длины Orange 500bp (NimaGen, Нидерланды).
Статистический анализ данных проводили с использованием программ GenAIEx v.6.5 [23], Structure v.2.3.4 [24], Past v.3.17 [25] и Pophelper v1.0.10 [26]. Были рассчитаны показатели, характеризующие генетическую
структуру исследуемой выборки бобра речного: Na (среднее количество выявленных аллелей на локус), Ne (количество эффективных аллелей), Ho (наблюдаемая гетерозиготность), He (ожидаемая гетерозиготность), PIC (мера информационного полиморфизма) [27], I (индекс разнообразия Шеннона) [28], FIS (индивидуальный индекс фиксации) [29]. Для определения комплексного значения вероятности случайного совпадения для системы микросателлитов и значения вероятности разделения двух неродственных особей использовали программу Forstat [30].
С использованием GenAlEx v.6.5 проведен расчет генетических дистанций. В программе Structure v.2.3.4 рассчитан критерий Q, который характеризует принадлежность каждой отдельной особи к соответствующему кластеру. С использованием веб-приложения Pophelper v1.0.10 (http://pophelper.com) произведена графическая интерпретация результатов, полученных в Structure v.2.3.4. В программе Past v.3.17 выполнено построение графика главных компонент на основе расчета генетических дистанций.
Результаты и обсуждение
По результатам анализа литературы было отмечено, что STR-маркеры, разработанные для обоих видов животных, относящихся к роду Castor, могут перекрестно амплифици-роваться, однако возможность успешной амплификации и полиморфизм будут иметь отличия для популяций бобра речного, обитающих в различных географических регионах Европы [16-21].
Для оценки информативности и возможности включения в разрабатываемую тест-систему отобранных по данным научной литературы STR-маркеров, каждый из маркеров сначала был протестирован в монолокусной реакции на контрольной выборке образцов бобра речного (n = 24 образца), представленной образцами из разных областей Беларуси.
При исследовании 14 STR-маркеров, разработанных для вида бобр речной, локусы CF05, CF07, CF17, CF18, CF19, CF30, CF33, CF44 выявлялись в выборке бобра речного как полиморфные, в то время как локусы CF21 и CF49 были мономорфными. Наиболее высокий уровень полиморфизма был показан для локусов
CF17 и CF44 (по семь аллельных вариантов); наименее полиморфными оказались локусы CF05, CF07, CF18 (по два аллельных варианта). Амплификация STR-маркеров CF06, CF32, CF41, CF48 в условиях мультилокус-ной ПЦР приводила к образованию неспецифичных продуктов, что не позволило включать их в тест-систему.
При исследовании 16 STR-маркеров, разработанных для вида бобр канадский, шесть локусов (Cca5, Cca9, Cca10, Cca15, Cca19, Cca20) оказались мономорфными. Наиболее высокий уровень полиморфизма был показан для локусов Cca8 и Cca62 (по пять аллельных вариантов); наименее полиморфными оказались локусы Cca13 и Cca18 (по два аллель-ных варианта). Маркеры Cca4, Cca56, Cca76, Cca92, Cca112, Cca122 имели несколько мест посадки праймеров, образуя продукты ПЦР различной длины, что может говорить о неоптимальной последовательности праймера для вида Castor fiber — данные STR-маркеры были исключены из тест-системы.
По результатам проведенного на контрольной группе исследования были отобраны восемь наиболее полиморфных маркеров (CF17, CF18, CF19, CF30, CF33, CF44, Cca8, Cca62), подходящих по диапазону длин амплифици-рованных фрагментов для мультиплексной ПЦР. При постановке мультиплексной ПЦР использовали контрольные образцы, для которых в монолокусных реакциях был определен генотип по каждому STR-маркеру. Для получения оптимальной интенсивности продуктов амплификации проводили подбор условий мультиплексной ПЦР: праймеры смешивали в различных концентрациях, амплификацию проводили с использованием диапазона температуры отжига праймеров и различном количестве циклов ПЦР.
Также в мультиплексную ПЦР был добавлен маркер CF49, который возможно использовать для видовой идентификации представителей отряда Rodentia (маркер был протестирован на следующих видах: ондатра, нутрия, шиншилла, дегу, морская свинка). В итоге, тест-система для идентификации бобра речного включала девять STR-маркеров: CF17, CF18, CF19, CF30, CF33, CF44, CF49, Cca8, Cca62. С помощью разработанной тест-системы проведено генотипирование 115 образцов бобра речного,
отобранных из различных областей Республики Беларусь. Генетико-популяционные характеристики исследованных локусов представлены в таблице 1.
В девяти исследованных микросателлитных локусах идентифицировали 41 аллель, в том числе 15 редких (с частотой встречаемости менее 5,0%), что составляет 36,6% от общего количества выявленных аллелей. Наибольшее число редких аллелей выявлено для STR-локу-сов CF17 (четыре аллеля, суммарная частота 3,5%) и CF33 (три аллеля, суммарная частота 3,9%). Число эффективных аллелей (Ne) в локусах варьировало от 1,000 (CF49) до 3,474 (CF44), при среднем значении 2,510 ± 0,672 аллеля на локус. Для некоторых STR-локусов с большим числом наблюдаемых аллелей (например, для CF17), характерны относительно невысокие значения числа эффективных аллелей (Ne), что можно объяснить наличием в этих локусах редких аллелей.
Анализ гетерозиготности исследуемой выборки бобра позволил выявить достаточно высокий уровень генетического разнообразия в локусах CF17, CF30, CF44, значения показателей наблюдаемой гетерозиготности (Ho) для которых составили 0,513, 0,526 и 0,583 соответственно. Достаточно большое количество гетерозиготных генотипов также было выявлено для локусов CF19, Cca8 и Cca62 со значениями 0,447, 0,504 и 0,478 соответственно. Для других микросателлитов системы (CF18, CF33) частота встречаемости гетерозиготных генотипов была значительно ниже и составила 0,088 и 0,211 соответственно. Среднее значение Ho для 8 локусов составило 0,419 ± 0,174. Наибольшее значение показателя ожидаемой гетерозиготности (Не) выявлено для локусов CF44 (0,712) и Cca8 (0,686), наименьшее — для локуса CF18 (0,266), при среднем значении 0,570 ± 0,140.
Большая часть маркеров характеризовалась неравномерным распределением аллельных вариантов, о чем свидетельствует наличие большого количества как редких аллелей, так и частых. Для локусов CF30, CF44, Cca62 было выявлено по одному мажорному аллелю с частотой встречаемости 0,519, 0,422 и 0,63 соответственно, при этом другие варианты аллелей встречались со средней частотой 0,16, 0,096, 0,092. Для локусов CF33, CF17 и CF19
Таблица 1
Генетико-популяционные характеристики исследованных локусов
Локус Na Ne Ho He F IS I PIC
CF17 7 2,708 0,513 0,631 0,187 1,152 0,560
CF18 2 1,362 0,088 0,266 0,670 0,436 0,231
CF19 5 2,233 0,447 0,552 0,190 0,928 0,466
CF30 4 2,807 0,526 0,644 0,183 1,188 0,593
CF33 5 2,149 0,211 0,535 0,606 0,867 0,429
CF44 7 3,474 0,583 0,712 0,182 1,465 0,668
Cca8 5 3,187 0,504 0,686 0,265 1,215 0,621
Cca62 5 2,158 0,478 0,537 0,109 0,999 0,483
Среднее значение 5 2,510 0,419 0,570 0,299 1,031 0,506
Стандартное отклонение (SD) - 0,672 0,174 0,140 0,214 0,306 0,138
CF49 1 1,000 - - - - -
обнаружено по два наиболее частых аллеля с частотами встречаемости от 0,361 до 0,557.
Среднее значение информационного содержания полиморфизма (PIC) определяется способностью маркера устанавливать полиморфизм популяции в зависимости от числа обнаруженных аллелей и распределения их частот. Среднее значение PIC для исследованных маркеров было 0,506 ± 0,138, при этом наиболее информативным для идентификации отдельной особи оказался локус CF44 (PIC = 0,668). Высокие значения PIC рассчитаны для локусов CF30 и Cca8 со значениями 0,593 и 0,621 соответственно, а наименее информативным оказался CF18 (PIC = 0,231). Комплексное значение вероятности случайного совпадения для системы из восьми микросателлитов составило 105,245 х 10-7. Значение вероятности разделения двух неродственных особей по комплексу выявляемых признаков достигло 99,9989%.
Индивидуальный индекс фиксации (FIS) — коэффициент инбридинга особей в субпопуляциях, указывающий на редукцию гетеро-зиготности из-за неслучайного спаривания, означает меру отклонения частот встреча-
емости генотипов от таковых при равновесии Харди-Вайнберга внутри субпопуляций с точки зрения недостатка или избытка гете-розигот [29]. Дефицит гетерозиготных особей (близкородственное спаривание, FIS >0), показан для всех 8 локусов (за исключением CF49, который является мономорфным) с показателями от 0,109 (Cca62) до 0,670 (CF18), со средним значением показателя 0,299 ± 0,214, т. е. существенное смещение генетического равновесия в сторону инбридинга. Данный показатель может свидетельствовать о частых близкородственных спариваниях внутри популяции бобра, подтверждая эффекты «бутылочного горлышка». Данное предположение может подтверждаться индексом биоразнообразия Шеннона (I), рассчитанного для совокупности восьми STR-локусов, который составил в среднем 1,031 ± 0,306, что указывает на низкое генетическое разнообразие вида и однородность структуры популяции бобра речного на территории Республики Беларусь.
Поскольку бобр речной распространяется по руслам рек, было принято решение оценить субпопуляционную подразделенность анали-
зируемой выборки бобра речного. С помощью веб-приложения Pophelper v1.0.10 и программы Structure v.2.3.4 провели обработку результатов для выявления подгрупп внутри сформированной выборки бобра речного (n = 115). Генетическую структуру исследуемой выборки оценивали с помощью анализа главных компонент (principal component analysis, PCA) посредством кластеризации в программе STRUCTURE 2.3.4 (Pritchard с соавторами, 2000) с использованием смешанной моде-
После анализа полученных результатов и их графического представления, было выявлено 37 образцов (32,17% от общего объема выборки), не вошедших ни в один из 4 кластеров: 6 — из Витебской области, 6 — из Гомельской, 21 — из Минской, 4 — из Могилевской, что может быть связано с наличием редких аллелей. Однако, выравнивание и увеличение выборки может снизить процент образ-
ли (число предполагаемых кластеров K — от 2 до 10; длина burn-in периода — 50K; модель Марковских цепей Монте-Карло — 5K). Для каждого значения K выполнялось по 10 итераций. С помощью данного анализа оценивалась субпопуляционная подразделенность анализируемой выборки бобра речного. По полученным результатам (опираясь на показатель ДК = 31,813) было сделано предположение о наличии 4 кластеров внутри выборки (рис. 2).
от 2 до 9
цов, не отнесенных ни к одному из кластеров. Наиболее гомогенной оказалась подгруппа из Гомельской области — 71,4% (20/28) особей бобра речного вошли в один кластер, точность отнесения — 87,8 ± 5,7% (рис. 3). Подгруппа из Минской области разделилась на три кластера: 13,3% (8/60) особей вошли в первый кластер (точность — 84,1 ± 6,2%); 18,3% (11/60) особей составили второй кластер (точ-
1. . 2 з 4 5
52 54 56 58 60 62 84 66 68 70 72 74 76 78 30 82 64 86 88 90 92 94 95 98 100
5 6
102 104 10В 108 110 112 114
Рис. 3. Результаты кластеризации исследуемой выборки бобра речного для K = 4 (адаптировано из Structure v.2.3.4.); 1 — Брестская область, 2 — Витебская область, 3 — Гомельская область, 4 — Гродненская область, 5 — Минская
область, 6 — Могилевская область
ность — 84,4 ± 6,6%); 31,7% (19/60) — в третий кластер (точность — 92,4 ± 5,4%). Для подгрупп из других областей Республики Беларусь выраженная подразделенность на кластеры отсутствовала, предположительно из-за небольшого количества особей.
На основании анализа генетических дистанций по маркерам, входящим в тест-систему, построены графики главных компонент
(PCA, Principal Component Analysis). На рисунках 4-5 представлены результаты анализа главных компонент для 115 образцов исследуемой выборки бобра речного.
Согласно полученным данным, на долю первых трех компонент приходится 71,6% вариации признака, отражающие взаимное сходство или различие исследованных особей бобра речного.
-Ï0 -20
10 20 30
Рис. 4. Результаты анализа главных компонент 1 и 2 (по совокупности 8 STR-локусов) для 115 образцов бобра речного; цветовая палитра аналогична представленной на рис. 3. Серым цветом обозначены образцы, не вошедшие ни в один кластер
Рис. 5. Результаты анализа главных компонент 1 и 3 (по совокупности 8 STR-локусов) для 115 образцов бобра речного; цветовая палитра аналогична представленной на рис. 3. Серым цветом обозначены образцы, не вошедшие ни в один кластер
Заключение
В результате проведенного исследования создана мультилокусная тест-система, состоящая из девяти STR-локусов (CF17, CF18, CF19, CF30, CF33, CF44, CF49, Сса8, Cca62), позволяющая проводить идентификацию особей бобра речного.
При анализе научной литературы и результатов собственных исследований выборки бобра речного (Castorfiber), географически локализованного на территории Республики Беларусь, установлено, что рассчитанные параметры генетического разнообразия сопоставимы с данными из аналогичных исследований бобров в других странах Европы. Для всех популяций характерен невысокий уровень полиморфизма STR-локусов, который можно объяснить прохождением популяций бобра речного через эффект «бутылочного горлышка». В исследованной нами выборке бобра речного в большинстве локусов были обнаружены относительно невысокие значения числа эффективных аллелей (Ne), что можно объяснить наличием в этих локусах редких аллелей, наблюдающихся также и для популяций бобра в других странах Европы.
Комплексное значение вероятности случайного совпадения для системы из восьми микросателлитов составило 105,245 х 10-7. Значение вероятности разделения двух неродственных особей по комплексу выявляемых признаков достигло 99,9989%.
Список использованных источников
1. Fatty acid composition, cholesterol content and lipid oxidation indices of intramuscular fat from skeletal muscles of beaver (Castor fiber L.) / P. Domaradzki [et al.] // Meat Sci. - 2019. -Vol. 150. - P. 131-140.
2. First case of Trichinella spiralis infection in beavers (Castor fiber) in Poland and Europe / M. Rozycki [et al.] // Int. J. Parasitol. Parasites Wildl. - 2020. - Vol. 11. - P. 46-49.
3. Cytogenetics of beavers: a case of speciation by monobrachial centric fusions / O. G. Ward [et al.] // Genome. - 1991. - Vol. 34, № 3. - P. 324-328.
4. Бондаревич, В. Бобр обыкновенный / В. Бондаревич // Лесное и охотничье хозяйство. - 2015. - № 12. - С. 44-47.
5. Can beaver impact promote river renatural-ization? The example of the Raba River, south-
ern Poland / E. Gorczyca [et al.] // Sci. Total Environ. - 2018. - Vol. 615. - P. 1 048-1 060.
6. Mitsch, W. J. Wetlands and carbon revisited / W. J. Mitsch, U. Mander // Ecol. Eng. - 2018. -Vol. 114. - P. 1-6.
7. Giriat, D. Beaver ponds' impact on fluvial processes (Beskid Niski Mts., SE Poland) / D. Giriat, E. Gorczyca, M. Sobucki // Sci. Total Environ. - 2016. - Vol. 544. - P. 339-353.
8. Characterization of Fatty Acid Composition in the European Beaver (Castor fiber L.) / K. Zalewski [et al.] // Polish J. of Environ. Stud.
- 2009. - Vol. 18, № 3. - P. 493-499.
9. Proximate composition and physicochemical properties of European beaver (Castor fiber L.) meat / M. Florek [et al.] // Meat Sci. - 2017. -Vol. 123. - P. 8-12.
10. Admixture of two phylogeographic lineages of the Eurasian beaver in Poland / A. Biedrzycka [et al.] // Mamm. Biol. - 2014. - Vol. 79, № 5. -P. 287-296.
11. Официальный сайт «Фауна Беларуси» [интернет ресурс]: Позвоночные Бобр речной или европейский (Castor fiber). - Режим доступа: https://gurkov2n.jimdofree.com/мле-копитающие/грызуны/бобр/. - Дата доступа: 24.09.2022.
12. Охрана окружающей среды в Республике Беларусь: Статистический сборник / Национальный статистический комитет Республики Беларусь; редкол.: И. В. Медведева (гл. ред.) [и др.]. - Минск, 2020. - С. 169-170.
13. Состояние природной среды Беларуси: экологический бюллетень/ Е. И. Громадская [и др.]; под общ. ред. к.т.н., С. А. Дубенок. -Минск: РУП «ЦНИИКИВР», 2021. - С. 60-63.
14. Отчет о ведении охотничьего хозяйства за 2021 год. Министерство лесного хозяйства Республики Беларусь [Электронный ресурс].
- Режим доступа: http://mlh.by/documents/. -Дата доступа: 18.05.2022.
15. minpriroda.gov.by [Электронный ресурс].
- Режим доступа: https://minpriroda.gov.by/up-loads/files/gl-8.pdf. - Дата доступа: 20.09.2022.
16. Isolation and characterization of microsatellite loci in the beaver (Castor canadensis) / J. C. Crawford [et al.] // Mol Ecol Resour. - 2008. -Vol. 8. - P. 616-618.
17. Development of nine new microsatellite loci for the American beaver, Castor canadensis (Rodentia: Castoridae), and cross-species
amplification in the European beaver, Castorfiber / K. Pelz-Serrano [et al.] // Mol Ecol Resour. -2009. - Vol. 9. - P. 551-554.
18. Frosch, C. First set of microsatellite markers for genetic characterization of the Eurasian beaver (Castorfiber) based on tissue and hair samples / C. Frosch, P. Haase, C. Nowak // Eur J Wildl Res.
- 2011. - Vol. 57, № 3. - P. 679-682.
19. Genetic relationships within colonies suggest genetic monogamy in the Eurasian beaver (Castor fiber) / A. Syrucková [et al.] // Mamm Res. - 2015. - Vol. 60. - P. 139-147. -DOI: 10.1007/s13364-015-0219-z
20. Comparison of Czech and Latvian Beaver Population by Microsatellite Analysis and Genetic Differences between Castor Fiber and Castor Canadensis / M. Ernst [et al.] // Transylvanian Review. - 2017. - Vol. 1. - P. 5 339-5 349.
21. Minnig, S. Genetic monitoring of Eurasian beaver (Castor fiber) in Switzerland and implications for the management of the species / S. Minnig, C. Angst, G. Jacob // Russian J. Theriol. - 2016. - Vol. 15, № 1. - P. 20-27.
22. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom [et al.] // J Clin Microbiol. - 1990. - Vol. 28, № 3. - P. 495-503.
- DOI: 10.1128/jcm.28.3.495-503.1990
23. Peakall, R. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-an update / R. Peakall, P. E. Smouse // Bioinformatics. - 2012. - Vol. 28, № 19. - P. 2 537-
2 539. - DOI: 10.1093/bioinformatics/bts460
24. Pritchard, J. K. Inference of Population Structure Using Multilocus Genotype Data / J. K. Pritchard, M. Stephens, P. Donnelly // Genetics. - 2000. - Vol. 155, № 2. - P. 945-959.
25. Hammer, 0. Past: Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis / 0. Hammer, D. A. T. Harper, P. D. Ryan // Palaeontologia Electronica. - 2001. - Vol. 4, № 1. - P. 1-9.
26. Francis, R. M. Pophelper: an R package and web app to analyse and visualize population structure / R. M. Francis // Mol Ecol Resour.
- 2017. - Vol. 17, № 1. - P. 27-32. - DOI: 10.1111/1755-0998.12509
27. Чесноков, Ю. В. Оценка меры информационного полиморфизма генетического разнообразия / Ю. В. Чесноков, А. М. Артемьева // Сельскохозяйственная биология. - 2015.
- Т. 50, № 5. - С. 571-578.
28. Шайхутдинова, А. А. Методы оценки биоразнообразия: методические указания / А. А. Шайхутдинова // Оренбургский гос. ун-т.
- Оренбург: ОГУ, 2019. - 37 с.
29. Кузнецов, В. М. F-статистики Райта: Оценка и интерпретация / В. М. Кузнецов // Проблемы биологии продуктивных животных.
- 2014. - № 4. - С. 80-104.
30. Forstat [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://fdl-uwc.shinyapps.io/forstat/. -Дата доступа: 13.10.2022.
A. N. Viarchuk, T. V. Asadchuk
INVESTIGATION INTO MICROSATELLITE DNA MARKERS FOR IDENTIFICATION OF EURASIAN BEAVER (CASTOR FIBER) INDIVIDUALS FOR FORENSIC PURPOSES
Government agency
"Scientific and Practical Center of the State Committee for Forensic Examinations of the Republic of Belarus"
25 Filimonova St., 220114 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: a.n.verchuk@mail.ru
The Eurasian beaver (Castor fiber) is one of the forensic examination objects for the identification of which the DNA analysis based on the use of microsatellite markers is most relevant. The aim of work was to develop a test system for the DNA identification of Eurasian beaver individuals as part of forensic activity, as well as to assess the genetic diversity of the population studied using the developed test system. Thirty microsatellite markers, specific to the Eurasian beaver and its closest relative — the North American beaver (Castor canadensis), were tested to create a multilocus test system. Using the study results, 9 STR loci (CF17, CF18, CF19, CF30, CF33, CF44, CF49, Cca8, and Cca62) were selected, and a multilocus test system was developed based on them. An assessment of the genetic diversity of the Eurasian beaver population in the Republic of Belarus was provided based on the genotyping results of 115 animals using the test system developed. Analysis of the study findings evidences a low level of the interspecies diversity of the sampling examined.
Keywords: DNA marker, Castor fiber, STR markers, mtDNA, forensic examination, genotyping.
Дата поступления в редакцию: 30 января 2023 г.
