CC BY
10Российская оториноларингология № 5 (54) 2011
УДК: 616.28-008.14-07.001.6
ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТНОГО СОСТАВА КЛЕТОК СПИРАЛЬНОГО ОРГАНА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СЕНСОНЕВРАЛЬНОЙ ТУГОУХОСТИ
Т. В. Золотова, Н. В. Дубинская1
THE STUDY OF MICROELEMENT COMPOSITION OF THE SPIRAL ORGAN'S CELLS IN EXPERIMENTAL SENSORINEURAL HEARING LOSS
T. V. Zolotova, N. V. Dubinskaya1
ГОУ ВПО Ростовский государственный медицинский университет (Зав. ЛОР кафедрой — проф. А. Г. Волков) 1МЛПУЗ ГБ № 1 им. Н. А. Семашко, г. Ростов-на-Дону (Главный врач — В. Г. Жданов)
Изучен микроэлементный состав клеток спирального органа 15 крыс методомрентгеноспек-трального микроанализа. У 10 животных с экспериментальной гентамициновой сенсоневраль-ной тугоухостью выявлено изменение содержания микроэлементов по сравнению с контролем. Наибольшие сдвиги отмечены по отношению к изменению доли кальция в норме при экспериментальной сенсоневральной тугоухости.
Ключевые слова: сенсоневральная тугоухость, экспериментальные животные, микроэлементный состав, спиральный орган. Библиография: 12 источников.
Studied microelements composition of the cells of the spiral organ of 15 rats by X-ray microanalysis. The 10 experimental animals with sensorineural hearing loss showed changes in trace element content compared with controls. The greatest improvements were observed in relation to the share of calcium in experimental sensorineural hearing loss.
Key words: sensorineural hearing loss, experimental animals, microelement composition, spiral organ. Bibliography: 12 sources.
Современные тенденции изучения патологических состояний на клеточно-молекулярном уровне диктуют необходимость исследования нарушений электролитного баланса в развитии сенсоневральной тугоухости, в частности, роли кальциевого метаболизма как одного из основных механизмов, участвующих в регуляции гомеостаза [7, 8]. Известно, что система транспорта ионов кальция в мембранных структурах мозга обладает наиболее высокой чувствительностью к перекисному окислению липидов, развивающемуся, например, в острой фазе черепно-мозговой травмы, острого нарушения мозгового кровообращения. Даже незначительное накопление продуктов перекисного окисления липидов в нейрональной мембране приводит к выраженному ингибированию кальций-транспортирующей способности, перегрузке нейрона кальцием. Избыток кальция в цитоплазме нейрона может привести к активации внутриклеточных протеаз и вызвать некробиотические изменения в клетке и ее гибель [2, 4, 5]. Повреждающему действию свободных радикалов, индуцируемому различными факторами, отводится важная роль в развитии тугоухости. В случае гиперпродукции свободных радикалов или ослаблении защитных систем организма могут сложиться условия для клеточного повреждения. В результате воздействия свободных радикалов на билипидный слой мембран значительно увеличивается их проницаемость для ионов кальция, что приводит к запуску патологического процесса [2, 5, 10]. Известно, что сосудистый фактор играет важнейшую роль в этиопатогенезе поражений слухового анализатора. Гипоксическое состояние вследствие реологических расстройств во внутреннем ухе приводит к активации перекисного окисления липидов, что в свою очередь способствует накоплению кальция в цитоплазме и инициации апоптоза [3, 4]. Однако значение изменения содержания микроэлементов в тканях внутреннего уха в целом и, в частности, кальция является малоизученной проблемой, исследуемой лишь
в единичных работах [7]. Между тем, нарушение кальциевого метаболизма может не только играть определенную роль как одного из этиологический факторов, но и участвовать в патогенетических механизмах развития тугоухости.
Цель исследования. Изучить микроэлементный состав клеток спирального органа экспериментальных животных при воспроизведении у них сенсоневральной тугоухости методом рентгеноспектрального микроанализа.
Материал и методы. Для изучения ультраструктурных характеристик улиток и элементного состава клеток спирального органа в настоящей серии экспериментов исследовано 15 белых крыс линии Вистар: 5 интактных (контроль) и 10 экспериментальных, которым проведено моделирование СНТ, из них 5 получали превентивное лечение. Соответственно, после декапитации исследовано 30 улиток крыс, изолированных по Я. А. Винникову и Л. К. Титовой (1961) [1]: 10 улиток здоровых крыс (контроль), 10 — с экспериментальной ототоксической СНТ, и 10 улиток опытных крыс, получавших превентивное лечение. Моделирование СНТ у крыс осуществляли, согласно «Способу моделирования сенсоневральной тугоухости» по Т.В.Золотовой, С.Н. Панченко [3, 4]. После выделения улиток декапитированных крыс, проводили исследование в 5 участках каждого образца улитки, то есть по 50 на одну группу животных, всего — 500 на всю серию данного исследования.
Предварительная подготовка изолированных образцов улиток крыс с последующим использованием углеродного (для рентгеноспектрального микроанализа) или платинового (для визуального анализа) напыления (Polaron) проводилась по общепринятым методикам с использованием сертифицированного оборудования Ростовского областного патологоанатомического бюро.
Сканирующая электронная микроскопия образцов улиток крыс с использованием электронный микроскопа XL-30 позволила определить область волосковых клеток спирального органа для рентгеноспектрального микроанализа.
Рентгеноспектральный микроанализ проводили на встроенном в электронный микроскоп рентгеноспектральном микроанализаторе "Edax" с ультратонким окном (Be/Li), откалибро-ванном по меди и алюминию, при ускоряющем напряжении 25000 вольт. Полуколичественную оценку спектров проводили с помощью прикладных программ; при анализе углерод (С) исключали в связи с углеродным напылением образца.
Метод рентгеноспектрального локального микроанализа относится к спектральным методам анализа и позволяет получать информацию о содержании химических элементов по регистрируемому характеристическому спектру рентгеновского излучения, используя в качестве зонда пучок электронов. Цифровое управление лучом сканирующего микроскопа даёт возможность получить поточечное картирование локальных концентраций с выведением концентрационных карт распределения (в атомарных и объёмных процентах) химических элементов. Программированное определение масс-фракций для каждого элемента осуществлялось на основании следующих положений: интенсивность пика рентгеновского излучения элемента (I х) пропорциональна локальной массе этого элемента; интенсивность фонового излучения (W) пропорциональна общей массе всех элементов. Нами использована количественная оценка содержания элементов в образцах, выраженная в объёмных процентах. Полученные электроннограммы и элементные спектры сопоставляли, результаты обрабатывали с помощью статистических программ.
Результаты исследования. Полученные данные рентгеноспектрального микроанализа клеток спирального органа улитки интактных крыс (контроль) в виде элементного спектра и значения весового процента (Wt%) представлены в табл. 1.
Анализ результатов свидетельствовал о преобладании среди микроэлементов, содержащихся в волосковых клетках интактного спирального органа (в Wt%), кислорода (65,01±2,45), фосфора (15,00±0,09), серы (8,59±0,24), натрия (7,84±0,51), селена (1,04±0,05). В небольших количествах (менее 1,0) определялись магний, хлор, калий, кальций, медь, железо. Эти данные служили контролем для наших дальнейших исследований.
Результаты рентгеноспектрального микроанализа клеток спирального органа улитки крысы при экспериментальной сенсоневральной тугоухости (модель) представлены в табл. 2.
При экспериментальной сенсоневральной тугоухости (модель) в спектре микроэлементов клеток спирального органа улитки крысы преобладали ( в Wt%) кислород (40,01±2,11), каль-
^63 3?-
Российская оториноларингология № 5 (54) 2011
Таблица 1
Микроэлементный состав клеток спирального органа образцов улитки крысы (в весовых процентах, п = 50)
Химический элемент Wt % (М±т)
О 65,01±2,45
№ 7,84±0,51
Mg 0,22±0,02
8е 1,04±0,05
Р 15,00±0,09
8 8,59±0,24
С1 0,21±0,03
К 0,28±0,06
Са 0,52±0,12
Fe 0,78±0,07
Си 0,51±0,13
Zn 0,00
Итого 100%
Примечание. Здесь и далее: обозначение химических элементов — по периодической системе Д. И. Менделеева; Wt % — весовой процент.
Таблица 2
Микроэлементный состав клеток спирального органа образцов улитки крысы при экспериментальной сенсоневральной тугоухости (п = 50)
Химический элемент Wt % (М±т)
О 40,01±2,11
№ 3,97±0,24
Mg 1,44±0,087
8е 0,08±0,005
Р 19,93±1,56
8 0,41±0,027
С1 0,06±0,004
К 0,24±0,021
Са 32,83±3,03
Fe 0,18±0.02
Си 0,17±0,018
Zn 0,67±0,063
Итого 100%
ций (32,83±3,03), фосфор (19,93±1,56), натрий (3,97±0,24), магний (1,44±0,087). В небольших количествах содержались селен, сера, хлор, калий, железо, медь, цинк. При этом отмечено статистически достоверное (Р < 0,01) уменьшение весового процента серы в 21 раз; селена в 13; хлора в в 3,5; меди в 3; натрия в 2; кислорода в 1,6; калия в 1,2 раза и, наоборот, увеличения кальция в 62; магния в 6,5 раза; железа в 4,3; фосфора в 1,3 раза.
Сравнительный анализ спектра химических элементов клеток спирального органа улиток контрольных образцов и при экспериментальном моделировании тугоухости и оценка соотношений их весовых процентов свидетельствует о достоверном уменьшении (р < 0,001) при экспериментальной тугоухости кислорода — в 1,6 раза, натрия в 2 раза, селена — в 13 раз, серы в 21 раз, хлора в 3,5 раза, меди в 3 раза и, наоборот, увеличения (р < 0,001) магния — в 6,5 раза; фосфора — в 1,3 раза; кальция — в 62 раза, железа в 4,3 раза, в небольшом количестве обнаружен отсутствующий при контрольном исследовании цинк. Содержание калия остаётся относительно стабильным — его уменьшение по сравнению с контролем недостоверно (р > 0,05).
Исследование элементного состава клеток спирального органа улиток крыс, которым было проведено экспериментальное моделирование сенсоневральной тугоухости с одновременным лечением биоактивной сывороткой «Аудиоинвит» и микронутриентом «Биоселен» [3], свидетельствовало об изменении в микроэлементном спектре. Результаты рентгеноспектрального
Таблица 3
Микроэлементный состав клеток спирального органа образцов улитки крысы при экспериментальной сенсоневральной тугоухости с одновременным лечением (п=50)
Химический элемент Wt % (M±m)
О 78,93±3,99
Na 4,04±0,29
Mg 0,87±0,08
Se 0,62±0,07
P 7,56±0,39
S 6,30±0,33
Cl 0,57±0,03
K 0,06±0,002
Ca 0,39±0,01
Fe 0,64 0,21
Cu 0,26±0,01
Zn 0,41±0,014
Итого 100%
микроанализа клеток спирального органа улитки крысы при экспериментальном моделировании тугоухости с одновременным лечением (модель и лечение) представлены в табл. 3.
Анализ полученных данных в этой группе свидетельствует о преобладании в спектре (в Wt %) следующих химических элементов: кислород (78,93±3,99), фосфор (7,56±0,39), натрий (4,04±0,29), сера (6,30±0,33), селен (0,62±0,07). В небольших количествах обнаружены хлор, магний, калий, кальций, железо, медь, цинк.
Сравнительный анализ спектра химических элементов клеток спирального органа улиток при экспериментальной сенсоневральной тугоухости и при тугоухости с одновременным лечением свидетельствует о достоверном увеличении после лечения весового процента кислорода — в 2,0 раза, натрия в 1,02 раза, селена — в 7,8 раз, серы в 15,4 раз, хлора в 9,5 раза, меди в 1,5 раз, а также уменьшение кальция — в 84,3 раза магния — в 1,7 раза; фосфора — в 2,64 раза;, железа в 3,5 раза, цинка — в 1,6 раз. Указанные изменения приближают полученные результаты к данным микроэлементного анализа образцов контроля.
Таким образом, электронная сканирующая микроскопия с последующим рентгеноспек-тральным элементным микроанализом позволили обнаружить в волосковых клетках спирального органа значительные сдвиги весовых процентов различных химических элементов в процессе моделирования и лечения. Эти сдвиги особенно ярко проявились в отношении кальция.
Результаты проведенного исследования свидетельствовали о значительных изменениях соотношений весовых процентов микроэлементного состава клеток спирального органа при экспериментальной тугоухости у крыс. Изучение данных рентгеноспектрального микроанализа опытных животных с сенсоневральной тугоухостью, получавших превентивное лечение, показало значительные сдвиги, направленные на восстановление элементного состава. Из представленных нами данных очевидно, что наиболее выраженные изменения претерпевает доля кальция в клетках внутреннего уха в процессе моделирования и лечения сенсоневральной тугоухости, что выделяет особую значимость этого микроэлемента в патогенезе тугоухости.
Необходимо отметить, что по результатам исследований других авторов [7] у больных с хронической сенсоневральной тугоухостью отсутствуют изменения показателей кальций-фосфорного обмена в крови и в моче, но проявления дисфункции кальций-фосфорного обмена всё же имеют место и регистрируются в виде остеопороза костей скелета, обнаруженного при остеоденситометрии, и повышения показателей костного метаболизма с увеличением показателей щелочной фосфотазы.
Приведенные материалы получены нами с помощью рентгеноспектрального микроанализа клеток внутреннего уха в эксперименте, но они находят теоретическое подтверждение в работах некоторых авторов. B. Wildemann et al. (1996) [11] считает, что одним из биохимических звеньев патогенеза СНТ является блокирование кальциевых каналов, в связи с чем для лечения СНТ, помимо антиаггрегационных препаратов, рекомендуется использовать антагонисты кальция. E.
^ 65 3?"
Российская оториноларингология № 5 (54) 2011
A. Jaffe et al. (1987) [12] указывают на то, что одним из регуляторов, проявляющимся при стрессе, наряду с тромбином и лейкотриеном, является гистамин, который стимулирует эндотелиоци-ты и, что особенно важно, увеличивают концентрацию свободного кальция в цитоплазме через инозитол-трифосфатный механизм. Увеличение концентрации кальция приводит к выделению фосфолипидов из плазматической мембраны путём активации фосфолипазы и, соответственно, повышению её проницаемости. Г. И. Фроленков и соавт. (2001) [9] обнаружили, что уровень сократительной активности наружных волосковых клеток улитки регулируется двумя кальций-зависимыми каналами передачи. Из приведенных собственных и литературных данных роль влияния кальция на различные аспекты патогенеза сенсоневральной тугоухости, включая функционирование волосковых клеток, становится очевидной. Иначе говоря, отмечена корреляция между показателями нарушения обмена кальция и нарушениями слуховой функции.
По итогам серии проведенных экспериментов по моделированию гентамициновой сенсоневральной тугоухости у животных: изучение микроэлементного состава клеток спирального органа улиток белых крыс с использованием сканирующей электронной микроскопии позволило выявить повышение доли кальция в клетках спирального органа декапитированных глухих крыс по сравнению с контролем (здоровые животные) и нормализацию его после лечения. Эти данные показывают значимость нарушения метаболизма кальция при тугоухости. Выводы
У экспериментальных животных (белых крыс) с воспроизведённой гентамициновой сенсоневральной тугоухостью имеются изменения микроэлементного состава клеток спирального органа с выраженным нарушением метаболизма кальция, что подтверждается данными сканирующей электронной микроскопии со спектральным микроанализом улиток.
Нарушение микроэлементного состава и кальциевого метаболизма в спиральном органе может играть определённую роль в развитии сенсоневральной тугоухости, что необходимо учитывать при проведении диагностических мероприятий и поисках средств оптимальной терапии, направленных на нормализацию обмена кальция и регулирование апоптоза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Винников Я. А. Кортиев орган: гистофизиология и гистохимия / Я. А. Винников, Л. К. Титова. - М., Л.: Изд-во АН СССР, 1961. - 260 с.
2. Водно-электролитный и кислотно-основной баланс (краткое руководство) / Горн М. М. и др. Пер. с англ. СПб: Невский диалект. — Бином, 2000. 320 с.
3. Золотова Т. В. Дифференцированный подход к лечению сенсоневральной тугоухости: автореф. дис. ... докт. мед. наук. М., 2004. 41 с.
4. Золотова Т. В., Панченко С. Н. Экспериментальная сенсоневральная тугоухость ототоксического генеза у животных: апоптический путь гибели клеток спирального органа // Вестн. оторинолар. - 2010. — № 4. - С. 2932.
5. Зенков Н. К., Ланкин В. З., Менщикова Е. Б. Окислительный стресс. Биохимические и патофизиологические аспекты. М.: Медицина, 2001. 343 с.
6. Ланкин З. В., Тихадзе А. К., Беленков Ю. Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях: пособие для врачей. М.: Медицина, 2001. 78 с.
7. Райская-Качесова О. Н. Значение кальциевого обмена в патогенезе хронической тугоухости: автореф. дис. ... канд. мед. наук. СПб., 2003. 24 с.
8. Рожинская Л.Я. Системный остеопороз. М.: Издатель Мокеев, 2000. 196 с.
9. Уровень подвижности наружных волосковых клеток улитки регулируется двумя Са2+-зависимыми каналами передачи / Г. И. Фроленков [и др.] // IV Международный симпозиум "Современные проблемы физиологии и патологии слуха" (Суздаль, 19-21 июня 2001 г.). — М., 2001. — С. 189-191.
10. Ханамирян Р. М. Патогенез и профилактика медикаментозного ототоксикоза: автореф. дис. ... канд. мед. наук. СПб, 1985. 24 с.
11. Wildemann B. Susac's syndrome: improvement with combined antiplatelet and calcium antagonist therapy / B. Wildemann [et al.] // Stroke. — 1996. — Vol. 27, N 1. — P 149-151.
12. Jaffe, E. A. Correlation between thrombin - inducend prostacyclin production and inositol triphosphate and cysosolic free calcium levels cultured human endothelial cells / E. A. Jaffe [et al.] // J. Biol. Chem. - 1987. - Vol. 262, № 18. - P. 8557-65.
Золотова Татьяна Викторовна - доктор мед. наук, профессор ЛОР кафедры Ростовского ГМУ. Адрес: 344010, г. Ростов-на-Дону, пр.Ворошиловский, 105. Моб. тел. +7-928-104-91-01, E-mail: cehhin@aaanet.ru; Дубинская Н. В. -врач-оториноларинголог детского ЛОР отделения МЛПУЗ ГБ № 1 им.Н. А. Семашко. 344000, г. Ростов-на-Дону, пр. Ворошиловский, 105. Моб. тел. +7-903-402-58-26, E-mail: santa98@list.ru
