CC BY
17МРНТИ: 34.15.23; 68.39.29
А.Т. ДАУГАЛИЕВА1, С Т. ДАУГАЛИЕВА2, Б.С. АРЫНГАЗИЕВ1,
ТА. ЛАВРЕНТЬЕВА1 1ТОО «Казахский научно-исследовательский институт животноводства и кормопроизводства», г. Алматы.
2ТОО «Научно-производственный центр микробиологии и вирусологии», г.
Алматы.
ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОБИОМА ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПОРОДЫ АБЕРДИН-АНГУС doi: 10.53729/MV-AS.2021.03.02
Аннотация
Целью исследования было определение таксономической структуры микробиома кишечника крупного рогатого скота породы Абердин-Ангус с помощью технологии секвенирования нового поколения. 16S метагеномный анализ, позволил определить микробный состав содержимого кишечника, минуя стадию культивирования на питательных средах. Проведена генетическая идентификация и получен таксономический профиль всех присутствующих бактерий, в том числе и некультивируемых форм.
Ключевые слова: микробиом, крупный рогатый скот, Абердин-Ангус, секвенирование нового поколения.
Изучение микроорганизмов на молекулярном уровне открыло перед учеными новые возможности изучения микрофлоры органов и тканей животного. На смену устаревшему термину «микрофлора» приходит более широкое понятие под названием «микробиом». Микробиом представляет собой сообщество бактерий, которое каждый организм имеет внутри и снаружи своего тела. Для каждого индивида он является уникальным и содержит в десятки раз больше клеток и генов, чем собственных генов организма. Микробиом регулирует многие жизненно важные процессы организма. Его изучение необходимо для детального понимания процессов, происходящих между микроорганизмами, населяющими определенный орган, и их взаимосвязью с клетками организма.
Традиционно микробная популяция изучалась посредством техники культивирования, проведения физиологических и биохимических тестов. Данные методы трудоемки, занимают много времени, требуют предварительных знаний о микроорганизмах для их выделения из сообщества, не так точны, как идентификация генотипическими методами и кроме того, не позволяют полностью идентифицировать все микроорганизмы из-за присутствия так называемых «некультивируемых форм».
Всестороннее изучение состава микробиома отдельных органов и тканей организмов стало возможно с появлением NGS-секвенирования нового поколения (Next Generation Sequencing). Исследование по этой методике проводится без стадии культивирования, то есть, из образца напрямую выделяется вся геномная ДНК, которая и подвергается секвенированию. В отличие от классического секвенирования по Сенгеру NGS-платформы позволяют прочитывать миллионы небольших фрагментов ДНК параллельно с двух сторон, в результате чего получается огромное количество данных. За один запуск секвенаторов нового поколения можно определить от нескольких десятков тысяч до нескольких миллиардов нуклеотидов в зависимости от поставленных задач.
К сожалению, использование данной технологии на животных еще недостаточно распространено из-за стоимости анализа и недоступности технологии. Несмотря на это, в последние годы в мировой науке активно изучается микробиом продуктивных животных. Жвачные животные, включая крупный и мелкий рогатый скот, составляют важный источник пищевых продуктов для человека. Они являются хозяевами сложного кишечного микробиома (включающего бактерии, археи, простейшие и грибы), который в свою очередь, обеспечивает выработку различных ферментов, необходимых для расщепления растительных волокон на летучие жирные кислоты и микробный сырой белок. Состав микробного сообщества, участвующий в микробном метаболизме рубца, представляет большой интерес для кормления животных [1].
Желудочно-кишечный тракт жвачных имеет широкий диапазон микроорганизмов, что затрудняет воспроизведение условий для их оптимального роста. Большая часть микробов не культивируется in vitro и не может быть выращена на лабораторных питательных средах. Выращивание анаэробов довольно сложно из-за необходимости исключения кислорода, медленного роста микробов и сложности других требований к росту [2,3,4].
Материалы и методы
Образцы фекалий отбирали из прямой кишки от трех голов крупного рогатого скота Абердин-Ангусской породы седьмого поколения Алматинской области. Пробы немедленно замораживали в сухом льду и хранили при -80 °C в морозильной камере до выделения ДНК.
Микробную ДНК из фекалий экстрагировали с помощью набора для кала QIAamp DNA (Qiagen, Валенсия, Калифорния). Затем измеряли концентрацию ДНК с помощью флуориметра Qubit® 2.0 [5]. Гипервариабельные области V3-V4 гена 16S rRNA амплифицировали с помощью ПЦР из 20 нг тотальной очищенной ДНК адаптивными олигонуклеотидами Illumina, совместимыми с платформой. Последовательности праймеров были следующими: 341/357F, CCTACGGGNGGCWGCAG и 805/785R: GACTACHVGGGTATCTAATCC [6]. Концентрацию и размер ДНК определяли с использованием BioAnalyzer 2100 (Agilent, Пало-Альто, Калифорния). Ампликоны очищали набором Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter Genomics, Данверс, Массачусетс). Библиотеки готовили в несколько этапов: получение ПЦР-продукта с универсальными праймерами, оценка его качества и количества, очистка, присоединение индексов Illumina в ПЦР шаге, очистка, оценка качества и количества продукта с индексами, нормализация, объединение, денатурация библиотек. Пул библиотек секвенировали в секвенаторе Illumina MiSeq с помощью набора реагентов Illumina MiSeq, согласно протоколу производителя. Вторичный анализ или обработка данных была проведена с помощью программного обеспечения MiSeq Reporter software (MSR). Таксономическая идентификация микроорганизмов проводилась путем анализа V3 и V4 регионов 16S rRNA гена бактерий в Международной базе данных Greengenes database (http://greengenes.lbl.gov/).
Результаты и обсуждение
Идентификация присутствующих в пробе бактерий проводилась по следующим таксономическим уровням: царство, филум, класс, порядок, семейство, род и вид.
Рисунок 1 - Сравнение относительной численности (% от общего количества) основных бактериальных типов, обнаруженных в микробиоме кишечника крупного
рогатого скота
Как показано на рисунке 1, большинство оперативно таксономических единиц (ОТи) в фекалиях скота породы Абердин-Ангус были отнесены к типам: Firmicutes (55%), Proteobacteria (16,8%), Actinobacteria (9,1%), Bacteroidetes и Euryarchaeota (5,1%), Verrucomicrobia (1,6%), Cyanobacteria (0,4%), Synergistetes (0,3%). Были взяты средние результаты по всем животным. К типу Firmicutes, оносились следующие семейства: Clostridiaceae (19,7%), Lachnospiraceae (7.1%), VeШonellaceae (0.5%), Ruminococcaceae (3.4%), Peptostreptococcaceae (2.1%), и Turicibacteraceae (0,4%). Среди типа Bacteroidetes присутствовало семейство Bacteroidaceae (0,9%).
Рисунок 2 - Микробный профиль бактериального сообщества кишечника на уровне
семейства
Из рисунка 2 видно, что на уровне бактериальных семейств у коров породы Абердин-Ангус превалировали семейства Enterobacteriaceae (6,7%), Planococcaceae (5,9%), Moraxellaceae (4,1%), Methanobacteriaceae (3,3%), Coriobacteriaceae (2,5%), Corynebacteriaceae (1,8%), Porphyromonadaceae и Erysipelotrichaceae (1%), Peptococcaceae (0.5%).
Рисунок 3 - Микробный профиль бактериального сообщества кишечника на уровне рода
Как показано на рисунке 3, роды: Alkaliphilus (7,0%), Clostridium (6,6%), Acinetobacter (4,1%), Solibacillus (4,2%), Blautia (3,2%), Colomator и Methanobrevibacter (3,0%), Coriobacteriaceae (2,5%), Serratia (2,3%), Ruminococcus (2,2%), Escherichia (2,6%), Butyrivibrio и Corynebacterium (1,8%), Oscillospira (1,2%), Akkermansia и Enterococcus (0,8%), Mogibacterium (0,6%), Bacillus (0,5%), Lactobacillus (0,3%) были таксонами бактерий прямой кишки.
По литературным источникам, относительная численность представителей типа Bacteroidetes (5,1%) в микробном сообществе пищеварительного тракта снижается, когда КРС скармливают большим количеством зерна, что позволяет типу Firmicutes (55,0%) и другим условно-патогенным типам, таким как Proteobacteria (16,8%), размножаться быстрее в единицу времени, что приводит к увеличению доли Firmicutes и Proteobacteria [7,9]. Однако исследования других авторов [10] были противоположными, что подтверждает наши исследования, так как животных в данном хозяйстве скармливали фуражной диетой (силос, сенаж), без добавления концентрированных кормов. Также увеличение относительной численности таксонов Firmicutes наблюдается в группе животных с повышенной эффективностью кормления [21].
Относительно Bacteroidetes известно, что данный тип является первичным деструктором сложных полисахаридов в клеточной стенке растений. Поскольку скот полагается на эти ферменты для эффективного разложения и переваривания клетчатки, увеличение количества соотношения Firmicutes к Bacteroidetes в пищеварение нежелательно [7,9]. Типы Proteobacteria и Cyanobacteria (0,4%) способствуют высоким показателям прироста массы тела животного [8]. Однако чрезмерное количество представителей типа Proteobacteria способствует воспалению кишечника [24]. В частности, Mao и др. [11] и Li и др. сообщили [12], что значительное увеличение кормления зерном увеличивало численность Proteobacteria, тогда как Khafipour и др. [13] и Plaizier и др. [14] не наблюдали
этого эффекта. Тип Euryarchaeota (5,1%) является наиболее преобладающим типом архей, которые вырабатывают метан [23].
Отряд Bacteroidales (2,5%), (тип Bacteroidetes), который включает виды, кодирующие широкий спектр способностей к разложению полисахаридов растений, а также семейство Ruminococcaceae (3,4%) (тип Firmicutes) были наиболее многочисленными таксонами у всех животных, получивших фураж [7]. Отряд Bacteroidales более многочислен в рационах с высоким содержанием фуража, и это связано с перевариванием клетчатки и биогидрогенизацией жирных кислот в рубце [25]. Семейства Bacteroidaceae (0,9%) и Peptococcaceae (0.5%) -полезные бактерии из-за их способности синтезировать витамины, помогать пищеварению, стимулировать иммунную функцию и подавлять патогенные микробы [24].
Семейства Enterobacteriaceae (6,7%) и Turicibacteraceae (0,4%), показали значительно более высокую численность в группе животных, которых кормили зерновыми культурами, тогда как представители Bacteroidaceae были значительно выше по численности в группе животных, питающейся травой. Enterobacteriaceae включает в себя, наряду со многими безвредными симбионтами, многие известные патогены, в нашем случае, род Serratia (2.3%) [15] и род Escherichia (2.6%). Виды, относящиеся к роду Escherichia, являются обитателями ЖКТ теплокровных животных, но многие из них патогенные. Известно, что Escherichia, находясь в кишечнике, тормозят кишечный транзит и двигательную активность кишки [27].
Отряд Clostridiales (37.6%), тип Firmicutes преобладал у бычков с большим ADG (привес) [8]. Семейства Clostridiaceae (19,7%) и Veillonellaceae (0,5%), а также род Clostridium (6,6%) участвуют в метаболизме желчной кислоты [8,15]. В процессе жизнедеятельности клостридии продуцируют короткоцепочечные жирные кислоты. Семейство Clostridiaceae важно для переваривания углеводов и белков. Обилие Clostridiales связано со снижением воспаления кишечника из-за повышенной экспрессии IL-10 в толстой кишке [25].
Представители семейства Ruminococcaceae (отряд Clostridiales) связаны с перевариванием клетчатки, ферментируют крахмал и превращают первичные желчные кислоты во вторичные. Наиболее многочисленное семейство в группе, питающейся травой, возможно потому, что эта группа бактерий зависит от пищевых волокон в качестве источника энергии [15, 25]. Ruminococcaceae было больше у бычков с большим ADG. Как и Lachnospiraceae (тип Firmicutes, отряд Clostridiales), повышенные уровни Ruminococcaceae указывают на более полную ферментацию и увеличение усвояемых питательных веществ, доступных животному [8].
В семействах Lachnospiraceae (7,1%) и Ruminococcaceae присутствуют ацетогены. Ацетогены могут служить поглотителем водорода и увеличиваются, если производство метана сокращается [8]. Повышенные уровни Lachnospiraceae могут указывать на более активную ферментацию в слепой кишки, что приводит к увеличению количества питательных веществ за счет абсорбируемых ЛЖК (летучих жирных кислот), доступных животному. Многие Lachnospiraceae производят бутират в результате переваривания углеводов, который является питательным веществом для кишечника. Более высокая численность Lachnospiraceae в группах животных с высоким уровнем RFI (потребление остаточного корма) может указывать на усиление метаболизма бутирата и, следовательно, на эффективность кормления [8,20]. Lachnospiraceae также ферментируют пектин [25].
Преобладание относительной численности семейств Lachnospiraceae (7,1%), Enterobacteriaceae (6,7%), Turicibacteraceae тип Firmicutes (0,4%), в отличие от Ruminococcaceae (3,4%), Porphyromonadaceae (1,0%), Bacteroidaceae (0,9%), указывает на то, что животных кормили зерновой диетой [15]. Lachnospiraceae были более многочисленными у бычков с наименьшим количеством ADG. Shabat и др. обнаружили, что у дойных коров с наименьшей эффективностью корма (большим RFI) было больше представителей Lachnospiraceae. Li и Guan обнаружили, что Lachnospiraceae были связаны с выращиванием КРС с большим RFI (менее эффективным); однако эти наблюдения противоположны наблюдениям Myer и др., которые обнаружили, что Lachnospiraceae более многочисленны среди бычков с наибольшим ADG [8, 17,18, 19].
Представителей семейства Erysipelotrichaceae (1.0%) было больше в слепой кишке бычков с наибольшим ADG и наименьшим ADFI (среднесуточное потребление корма). Erysipelotrichaceae связан с метаболизмом липидов и воспалением. Семейство Coriobacteriaceae (2.5%) тип Actinobacteria (9,1%), модулирует метаболизм липидов у животного. Coriobacteriaceae была повышена у бычков с большим ADG [8].
Широко известный род Lactobacillus (0,3%), тип Firmicutes, отряд Clostridiales является производителем молочной кислоты (лактата) из крахмала, наблюдаются его высокие уровни относительной численности у КРС зернового откорма. Молочная кислота не метаболизируется животным, она вместо этого поглощается через стенки рубца, вызывает повышение содержания молочной кислоты и снижение pH в крови, в рубце также происходит накопление ЛЖК, оказывающее пагубное влияние на микробиоту и животное. Эти резкие и внезапные изменения приводят к снижению pH в рубце и увеличению количества видов Lactobacillus. Роды Lactobacillus, Clostridium, делают желчные кислоты доступными для дальнейшей биотрансформации. Роды Lactobacillus и Ruminococcus (2,2%) были значительно выше в тощей кишке группы животных, получавшей зерно, тогда как Solibacillus (4,2%) был значительно выше в группе, получавшей травяное питание
[15, 20].
Род Butyrivibrio (1.8%) принадлежит к семейству Lachnospiraceae [8]. Butyrivibrio связан с распадом гемицеллюлозы в рубце и конечным продуктом ферментации является бутират, который является важным источником энергии для эпителиальных клеток кишечника, также как и Blautia (3.2%) [8,21]. Членыэтого рода часто идентифицировались как связанные с бычками, которых эффективно кормили [21]. Butyrivibrio разлагает пиктин, фенилаланин, тирозин и триптофан [8,26].
Род Ruminococcus - самый многочисленный род типа Firmicutes. Кормление зерном в целом ассоциируется с увеличением относительного содержания Ruminococcus и сокращения рода Acinetobacter (4,1%) [13]. Род Ruminococcus играет основную роль в разложении рубцовой целлюлозы (полисахариды) [8,22]. Ruminococcus входит в число основных наследуемых бактерий, что соответствует ключевой роли в целлюлолизе [16,21]. Род Akkermansia (0,8%) способствуют воспалению [8,24]. Род Escherichia (2,6%) продуцирует токсичные соединения путем ферментации белков [24]. Escherichia albertii (2,3%) - наиболее многочисленный вид из обнаруженных, является eae-позитивным штаммом Escherichia coli, отличающийся от обычной E.colli наличием дополнительного eae гена [29]. Доля колли бактерий существенно увеличивается при воспалительных процессах и приводит к дисбактериозу.Род Bacillus (0.5%) обладает антимикробной активностью [8].Род Methanobrevibacter (3,0%), - самый распространённый род
продуцентов метана в рубце. Общей чертой бактерий рода Blautia является утилизация водорода и диоксида углерода с продукцией ацетатов (уксусной кислоты). Caloramator - малоизученный род термофильных бактерий, принадлежащий к типу Firmicutes (3,0%) [27].Род Lysinibacillus (1,1%) -веретенообразные бактерии, выделены из различных объектов, включая сельскохозяйственные почвы и заводские сточные воды. Естественной экологической нишей бактерий рода Lysinibacillus считается почва. В процессе метаболизма могут использовать кислород, метаболизируют различные сахара и другие простые углеводы. Род Alcaliphilus (7,0%) и Clostridium участвуют в обмене веществ и усвоении питательных веществ. Представитель рода Alcaliphilus -peptidifermentans (1,9%) микроорганизм, способный к ферментации пептидов и восстановлению Fe (III) [28].
Заключение
В настоящем исследовании нами экспериментально был расшифрован состав микробиома кишечника привозных коров породы Абердин-Ангус с использованием NGS-секвенирования на приборе MiSeq Illumina.
В результате идентификации состава микробиома было установлено высокое биологическое разнообразие микробной популяции.
Особо опасных патогенов у животных не обнаружено. Однако присутствует значительная доля условно - патогенных микроорганизмов (роды Serratia, Escherichia), которые при ослаблении общего и местного иммунитета в организме могут стать причиной дисбиоза и патологического процесса. В связи с этим, необходимо обратить внимание на сдвиг в сторону полезной микрофлоры путём увеличения численности полезных микроорганизмов.
Наблюдалась высокая относительная численность типов Firmicutes (55,0%), Proteobacteria (16,8%), семейств Enterobacteriaceae (6,7%), Lachnospiraceae (7,1%), рода Ruminococcus (2,2 %) несмотря на то, что животных кормили фуражной диетой. Группа животных имеет эффективность кормления, так как на это указывает увеличенное количество типов Firmicutes, Proteobacteria, семейства Coriobacteriaceae (2.5%), рода Butyrivibrio (1.8%). Увеличение представителей типа Euryarchaeota (5,1%), рода Methanobrevibacter (3,0%) является свидетельством выработки животными метана, неблагоприятно влияющего на окружающую среду.
Литература:
1 Carberry CA, Kenny DA, Han S, McCabe MS,Waters SM. Effect of phenotypic residual feed intake and dietary forage content on the rumen microbial community of beef cattle. Appl Environ Microbiol 2012; 78:4949-58.
2 Rufener WH, Nelson W, Wolin MJ. Maintenance of the rumen microbial population in continuous culture. Appl Microbiol. 1962; 11(May).
3 Chloe Matthews, Fiona Crispie, Eva Lewis, Michael Reid, Paul W. O'Toole & Paul D. Cotter. The rumen microbiome: a crucial consideration when optimising milk and meat production and nitrogen utilisation efficiency. Gut Microbes. 2019, VOL. 10, NO. 2, 115-132.
4 Pace, N.R., D.A. Stahl, D.J. Lane, and G.J. Olsen. 1985. Analyzing natural microbial populations by rRNA sequences. ASM News 51:4-12.
5 Li RW, Li W, Sun J, Yu P, Baldwin RL, Urban JF. The effect of helminth infection on the microbial composition and structure of the caprine abomasal microbiome. Scientific reports. 2016;6(1): 1-10.
6 KlindworthA, PruesseE, SchweerT, PepliesJ, QuastC, etal.Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies Nucleic Acids Res. 2013; Jan; 41(1): el. [PMCfreearticle] [PubMed].
7 E. Khafipour, S. Li, H.M. Tun, H. Derakhshani, S. Moossavi, J.C. Plaizier. Effects of grain feeding on microbiota in the digestive tract of cattle. Animal Frontiers, 2016; 6(2): 13-19.
8 Harvey C. Freetly,1 Aaron Dickey, Amanda K. Lindholm-Perry, Richard M. Thallman, John W. Keele, Andrew P. Foote, James E. Wells. Digestive tract microbiota of beef cattle that differed in feed efficiency. Journal of Animal Science, 2020; 98(2): 1-16.
9 Orin C. Shanks, Catherine A. Kelty, Shawn Archibeque, Michael Jenkins, Ryan J. Newton, Sandra L. McLellan, Susan M. Huse, Mitchell L. Sogin. Community Structures of Fecal Bacteria in Cattle from Different Animal Feeding Operations. Appl Environ Microbiol, 2011; 77(9):2992-300.
10 Fernando, S.C., H.T. Purvis, II, F.Z. Najar, L.O. Sukharnikov, C.R. Krehbiel, T.G. Nagaraja, B.A. Roe, and U. Desilva. 2010. Rumen microbial population dynamics during adaptation to a high-grain diet. Appl. Environ. Microbiol. 76(22):7482-7490. doi: 10.1128/AEM.00388-10.
11 Mao, S., R. Zhang, D. Wang, and W. Zhu. 2013. Impact of subacute ruminal acidosis (SARA) adaptation on rumen microbiota in dairy cattle using pyrosequencing. Anaerobe 24:1219. doi:10.1016/j.anaerobe.2013.08.003.
12 Li, R.W., E.E. Connor, C. Li, R.L. Baldwin Vi, and M.E. Sparks. 2012. Characterization of the rumen microbiota of pre-ruminant calves using metagenomic tools. Environ. Microbiol. 14(1): 129-139. doi: 10.1111/j.1462-2920.2011.02543.x.
13 Khafipour, E., S. Li, J.C. Plaizier, and D.O. Krause. 2009b. Rumen microbiome composition determined using two nutritional models of subacute ruminal acidosis. Appl. Environ. Microbiol. 75(22):7115-7124. doi:10.1128/AEM.00739-09.
14 Plaizier, J.C., S. Li, H.M. Tun, D.O. Krause and Ehsan Khafipour. 2016. Effects of experimentally induced subacute ruminal acidosis (SARA) on the rumen and hindgut microbiome in dairy cows. Front. Microbiol.
15 Jianan Liu, Fang Liu, Wentao Cai, Cunling Jia, Ying Bai, Yanghua He, Weiyun Zhu, Robert W. Li Diet-induced Changes in Bacterial Communities in the Jejunum and Their Associations with Bile Acids in Angus Beef Cattle. Animal Microbiome. 2020; 33(2):26.
16 R. John Wallace1, Goor Sasson, Philip C. Garnsworthy, Ilma Tapio. A heritable subset of the core rumen microbiome dictates dairy cow productivity and emissions. Science Advances. 2019; 5(7). DOI: 10.1126/sciadv.aav8391.
17 Shabat, S. K., G. Sasson, A. Doron-Faigenboim, T. Durman, S. Yaacoby, M. E. Berg Miller, B. A. White, N. Shterzer, and I. Mizrahi. 2016. Specific microbiome-dependent mechanisms underlie the energy harvest efficiency of ruminants. ISME J. 10:2958-2972. doi: 10.1038/ismej.2016.62.
18 Li, F., and L. L. Guan. 2017. Metatranscriptomic profiling reveals linkages between the active rumen microbiome and feed efficiency in beef cattle. Appl. Environ. Microbiol. 83:e00061-17. doi: 10.1128/AEM.00061-17.
19 Myer, P. R., T. P. Smith, J. E. Wells, L. A. Kuehn, and H. C. Freetly. 2015a. Rumen microbiome from steers differing in feed efficiency. Plos One 10:e0129174. doi:10.1371/journal.pone.0129174.
20 Chloe Matthews, Fiona Crispie, Eva Lewis, Michael Reid, Paul W. O'Toole, and Paul D. Cotter. The rumen microbiome: a crucial consideration when optimising milk and meat production and nitrogen utilisation efficiency.Gut Microbes. 2019; 10(2): 115-132.
21 Phillip R. Myera. Bovine Genome-Microbiome Interactions: Metagenomic Frontier for the Selection of Efficient Productivity in Cattle Systems. American society for microbiology. 2019; 4 (3): e00103-19.
22 SimonDeusch, BrunoTilocca, Amelia Camarinha-Silva, Jana Seifert. News in livestock research — use of Omics-technologies to study the microbiota in the gastrointestinal tract of farm animals. Computational and Structural Biotechnology Journal. 2015; 13: 55-63.
23 Minseok Kim, Tansol Park, and Zhongtang Yu. Metagenomic investigation of gastrointestinal microbiome in cattle. Asian-Australas J Anim Sci. 2017; 30: 11:1515-1528.
24 Guoxing Zhang, Yachun Wang, Hanpeng Luo, Wenqing Qiu, Hailiang Zhang, Lirong Hu, Yajing Wang, Ganghui Dong and Gang Guo. The Association Between Inflammaging and Age-Related Changes in the Ruminal and Fecal Microbiota Among Lactating Holstein Cows. Front. Microbiol., 09 August 2019 | https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.01803.
25 Bach A., López-García A., González-Recio O., Elcoso G., Fábregas F., Chaucheyras Durand F., Castex M. Changes in the rumen and colon microbiota and effects of live yeast dietary supplementation during the transition from the dry period to lactation of dairy cows. Journal of Dairy Science, 2019; 102(7):6180-6198.
26 William J. Kelly, Sinead C. Leahy, Janine Kamke, Priya Soni, Satoshi Koike, Roderick Mackie, Rekha Seshadri, Gregory M. Cook, Sergio E. Morales, Chris Greening & Graeme T. Attwood. Occurrence and expression of genes encoding methyl-compound production in rumen bacteria. Animal Microbiome, 2019; 1: 15.
27 Лычкова А.Э. Взаимодействие электромоторной активности гладких мышц и микрофлоры кишечника. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2012. 11; 84-90.
28 Zhilina T.N., Zavarzina D.G., Kolganova T.V., Lysenko A.M. and Tourova T.P. Alkaliphilus peptidofermentans sp. nov., a New Alkaliphilic Bacterial Soda Lake Isolate Capable of Peptide Fermentation and Fe(III) Reduction // Microbiology, 2009, Vol. 78, No. 4, pp. 445454.
29 Ooka T., Seto K., Kawano K., Kobayashi H., Etoh Y., Ichihara S., Hayashi T. Clinical Significance of Escherichia Albertii. Emerging Infectious Diseases. 2012. 18(3); 488-492.
Работа профинансирована и выполнена в рамках грантового проекта Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан ИРН AP09259133 «Исследование микробиома желудочно-кишечного тракта крупного рогатого скота с целью уменьшения выбросов парниковых газов».
А.Т. ДЭУГАЛИЕВА 1, С.Т ДЭУГАЛИЕВА2, Б.С.АРЬЩЕАЗИЕВ1,
ТА. ЛАВРЕНТЬЕВА1
7«^азак мал шаруашылыгы жэне жемшеп eндiрiсi гылыми зерттеу институты» ЖШС, Алматы
«Микробиология жэне вирусология гылыми eндiрiстiк орталыгы» ЖШС, Алматы
Т^щ
Жануарлардьщ микробиомасын жэне оныц кызметш терещрек тYсiну iрi кара малга жем берудщ тшмдшгш арттырудыц жаца стратегияларын табуга кемектеседь Осыган байланысты бiздiц зерттеуiмiздiц максаты Абердин Ангус сиырларыныц iшек микробиомыныц таксономиялы; к¥рылымын аныктау болды. Жаца буын тобектеу технологиясын колдана отырып, 16S метагеномиялы; талдау жYргiзiлдi, б^л iшек К¥рамындагы микробты; к¥рамын аныктауга мYмкiндiк бердь 16S метагеномикасы Kоректiк орталарда еару кезещн айналып eтiп, сынамада бар бактерияларды аныктау жэне салыстыру Yшiн колданылады.
ТYЙiндi сездер: микробиом, iрi кара мал, абердин ангусы, келес буын тiзбегi.
IRSTI: 34.15.23, 68.39.29
A.T. DAUGALIYEVA 1, S.T. DAUGALIYEVA 2, B.S. ARYNGAZIYEV1,
LAVRENTIEVA T.A.
1LLP «Kazakh Research Institute for Livestock and Fodder Production», Almaty LLP "Research and Production Center for Microbiology and Virology", Almaty
RESEARCH OF THE MICROBIOM OF THE GASTROINTESTINAL TRACT OF THE ABERDIN-ANGUS BREED CATTLE doi: 10.53729/MV-AS.2021.03.02
Summary
The aim of the study was to determine the taxonomic structure of the intestinal microbiome of Aberdeen Angus cattle using a new generation sequencing technology. 16S metagenomic analysis made it possible to determine the microbial composition of the intestinal contents bypassing the stage of cultivation on nutrient media. Genetic identification was carried out and a taxonomic profile of all bacteria present, including non-cultivated forms, was obtained.
Key words: microbiome, cattle, Aberdeen Angus, next generation sequencing.
The study of microorganisms at the molecular level has opened up new opportunities for scientists to study the microflora of animal organs and tissues. The outdated term "microflora" is being replaced by a broader concept called "microbiome". The microbiome is a community of bacteria that every organism has on the inside and outside of its body. For each individual, it is unique and contains tens of times more cells and genes than the body's own genes. The microbiome regulates many of the body's vital processes. Its study is necessary for a detailed understanding of the processes occurring between microorganisms inhabiting a particular organ and their relationship with the cells of the body.
Traditionally, the microbial population has been studied through cultivation techniques, physiological and biochemical tests. These methods are laborious, time-consuming, require prior knowledge about the microorganisms of interest to isolate them from the community, and are also not as accurate as identification by genotypic methods and, moreover, do not allow the complete identification of all microorganisms due to the presence of so-called "uncultivated forms".
A comprehensive study of the microbiome composition of individual organs and tissues of organisms became possible with the advent of Next Generation Sequencing (NGS). A study using this technique is carried out without a stage of cultivation, that is, all genomic DNA is directly isolated from the sample, which is subjected to sequencing. Unlike classical Sanger sequencing, NGS platforms allow millions of small DNA fragments to be read in parallel from two sides, resulting in a huge amount of data. For one launch of the new generation sequencers, it is possible to determine from several tens of thousands to several billion nucleotides, depending on the tasks.
Unfortunately, the use of this technology on animals is not yet widespread due to the cost of analysis and the unavailability of the technology. However, in recent years, the world science has been actively studying the microbiome of productive animals. Ruminants, including cattle and small ruminants, constitute an important source of food for humans. These animals are hosts of a complex gut microbiome (including bacteria, archaea, protozoa and fungi), which in turn provides the various enzymes needed to break down plant fibers into volatile fatty acids and microbial crude protein. The composition of the microbial community involved in the microbial metabolism of the rumen is of great
interest for animal feeding [1]. The gastrointestinal tract of ruminants contains a wide range of microorganisms, which makes it difficult to reproduce the conditions for their optimal growth. Most of the microbes are not cultured in vitro and cannot be grown on laboratory culture media. The cultivation of anaerobes is quite difficult due to the need to exclude oxygen, the slow growth of microbes, and the complexity of other growth requirements [2,3,4].
Materials and methods
Fecal samples were taken from the rectum from three heads of cattle of the Aberdeen-Angus breed of the seventh generation of the Almaty region. Samples were immediately frozen on dry ice and stored at -80 °C in a freezer until DNA extraction.
Microbial DNA from feces was extracted using a QIAamp DNA feces kit (Qiagen, Valencia, CA). Then, the DNA concentration was measured using a Qubit® 2.0 fluorometer [5]. The V3-V4 hypervariable regions of the 16S rRNA gene were amplified by PCR from 20 ng of total purified DNA with adaptive Illumina oligonucleotides compatible with the platform. The primer sequences were as follows: 341/357F and 805/785R: GACTACHVGGGTATCTAATCC [6]. DNA concentration and size were determined using a BioAnalyzer 2100 (Agilent, Palo Alto, CA). Amplicons were purified with the Agencourt AMPure XP kit (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA). Libraries were prepared in several stages: obtaining a PCR product with universal primers, evaluating its quality and quantity, purification, attaching Illumina indices in the PCR step, purification, evaluating the quality and quantity of the product with indices, normalization, pooling, and denaturation of libraries. The library pool was sequenced in an Illumina MiSeq sequencer using the Illumina MiSeq reagent kit according to the manufacturer's protocol. Secondary analysis or data processing was performed using MiSeq Reporter software (MSR). Taxonomic identification of microorganisms was carried out by analyzing the V3 and V4 regions of the 16S rRNA gene of bacteria in the International Greengenes database (http://greengenes.lbl.gov/).
Results and discussion
The bacteria present in the sample were identified according to the following taxonomic levels: kingdom, phylum, class, order, family, genus, and species.
Figure 1 - Comparison of the relative abundance (% of the total) of the main bacterial types found in the intestinal microbiome of cattle
As shown in Figure 1, most of the OTUs in the faeces of Aberdeen Angus cattle were categorized as Firmicutes (55%), Proteobacteria (16.8%), Actinobacteria (9.1%), Bacteroidetes and Euryarchaeota ( 5.1%), Verrucomicrobia (1.6%), Cyanobacteria (0.4%), Synergistetes (0.3%). The average results for all animals were taken. The following families belonged to the type Firmicutes: Clostridiaceae (19.7%), Lachnospiraceae (7.1%), Veillonellaceae (0.5%), Ruminococcaceae (3.4%), Peptostreptococcaceae (2.1%), and Turicibacteraceae (0.4%). The Bacteroidetes type included the Bacteroidaceae family (0.9%).
Figure 2 - Microbial profile of the intestinal bacterial community at the family level
As shown in Figure 2, the families Enterobacteriaceae (6.7%), Planococcaceae (5.9%), Moraxellaceae (4.1%), Methanobacteriaceae (3.3%) prevailed at the level of bacterial families in Aberdeen Angus cows. Coriobacteriaceae (2.5%), Corynebacteriaceae (1.8%), Porphyromonadaceae and Erysipelotrichaceae (1%), Peptococcaceae (0.5%).
Figure 3 - Microbial profile of the intestinal bacterial community at the genus level
As shown in Figure 3, the genera Alkaliphilus (7.0%), Clostridium (6.6%), Acinetobacter (4.1%), Solibacillus (4.2%), Blautia (3.2%), Colomator and Methanobrevibacter (3.0%), Coriobacteriaceae (2.5%), Serratia (2.3%), Ruminococcus (2.2%), Escherichia (2.6%), Butyrivibrio and Corynebacterium (1.8%), Oscillospira (1.2%), Akkermansia and Enterococcus (0.8%), Mogibacterium (0.6%), Bacillus (0.5%), Lactobacillus (0.3%) were taxa of rectal bacteria.
According to literature sources, the relative number of representatives of the Bacteroidetes type (5.1%) in the microbial community of the digestive tract decreases when cattle are fed a large amount of grain, which allows the type Firmicutes (55.0%) and other opportunistic types such as Proteobacteria (16,8%), multiply faster per unit time, which leads to an increase in the proportion of Firmicutes and Proteobacteria [7,9]. However, the studies of other authors [10] were opposite, which confirms our studies, since the animals in this farm were fed with a fodder diet (silage, haylage), without the addition of concentrated feed. Also, an increase in the relative abundance of Firmicutes taxa is observed in the group of animals with increased feeding efficiency [21].
Bacteroidetes are known to be the primary destructor of complex polysaccharides in the plant cell wall. Because livestock rely on these enzymes to efficiently break down and digest fiber, increasing the ratio of Firmicutes to Bacteroidetes in digestion is undesirable [7,9]. The types Proteobacteria and Cyanobacteria (0.4%) contribute to high rates of weight gain in the animal [8]. However, excessive amounts of the Proteobacteria type contribute to intestinal inflammation [24]. In particular, Mao et al. [11] and Li et al. [12] reported that a significant increase in grain feeding increased the abundance of Proteobacteria, whereas Khafipour et al. [13] and Plaizier et al. [14] did not observe this effect. ... The Euryarchaeota type (5.1%) is the most predominant type of archaea that produce methane [23].
The order Bacteroidales (2.5%), (type Bacteroidetes), which includes species encoding a wide range of plant polysaccharide degradation abilities, and the Ruminococcaceae family (3.4%) (type Firmicutes) were the most numerous taxa in all
fodder animals [7]. The order Bacteroidales is more abundant in diets high in forage, and this is associated with the digestion of fiber and the biohydrogenation of fatty acids in the rumen [25]. The families Bacteroidaceae (0.9%) and Peptococcaceae (0.5%) are beneficial bacteria due to their ability to synthesize vitamins, aid digestion, stimulate immune function, and suppress pathogenic microbes [24].
Families Enterobacteriaceae (6.7%), Turicibacteraceae (0.4%) showed significantly higher numbers in the grain-fed group, while Bacteroidaceae were significantly higher in numbers in the grass-fed group. Enterobacteriaceae includes, along with many harmless symbionts, many known pathogens, in our case Serratia (2.3%) [15] and the genus Escherichia (2.6%). Species belonging to the genus Escherichia are inhabitants of the gastrointestinal tract of warm-blooded animals, but many of them are pathogenic. It is known that Escherichia, being in the intestine, inhibits intestinal transit and intestinal motor activity [27].
Order Clostridiales (37.6%), type Firmicutes prevailed in gobies with a large ADG (weight gain) [8]. The families Clostridiaceae (19.7%) and Veillonellaceae (0.5%), as well as the genus Clostridium (6.6%), are involved in the metabolism of bile acid [8,15]. In the process of vital activity, clostridia produce short-chain fatty acids. The Clostridiaceae family is important for the digestion of carbohydrates and proteins. The abundance of Clostridiales is associated with a decrease in intestinal inflammation due to increased IL-10 expression in the colon [25].
Members of the Ruminococcaceae family (order Clostridiales) are associated with the digestion of fiber, ferment starch and convert primary bile acids into secondary ones. The most numerous family in the grass-eating group, perhaps because this group of bacteria depends on dietary fiber for energy [15, 25]. Ruminococcaceae were higher in gobies with high ADG. Like Lachnospiraceae (type Firmicutes, order Clostridiales), increased levels of Ruminococcaceae indicate more complete fermentation and an increase in assimilable nutrients available to the animal [8].
The families Lachnospiraceae (7.1%) and Ruminococcaceae contain acetogens. Acetogens can serve as a hydrogen scavenger and increase if methane production is reduced [8]. Elevated levels of Lachnospiraceae may indicate more active fermentation in the cecum, resulting in increased nutrient availability from the absorbed VFA (volatile fatty acids) available to the animal. Many Lachnospiraceae produce butyrate through the digestion of carbohydrates, which is a nutrient for the intestines. A higher abundance of Lachnospiraceae in groups of animals with high RFI (residual feed intake) may indicate an increase in butyrate metabolism and, therefore, feeding efficiency [8,20]. Lachnospiraceae also ferment pectin [25].
The prevalence of the relative abundance of families Lachnospiraceae (7.1%), Enterobacteriaceae (6.7%), Turicibacteraceae type Firmicutes (0.4%), in contrast to Ruminococcaceae (3.4%), Porphyromonadaceae (1.0%), Bacteroidaceae (0.9%) indicates that the animals were fed a grain-based diet [15]. Lachnospiraceae were more abundant in gobies, with the least amount of ADG. Shabat et al. Found that dairy cows with the lowest feed efficiency (highest RFI) had more Lachnospiraceae. Li and Guan found that Lachnospiraceae were associated with raising cattle with higher RFI (less efficient); however, these observations are in contrast to those of Myer et al., who found that Lachnospiraceae were more abundant among gobies with the highest ADG [8, 17, 18, 19].
The family Erysipelotrichaceae (1.0%) was larger in the caecum of gobies with the highest ADG and the lowest ADFI (mean daily feed intake). Erysipelotrichaceae is associated with lipid metabolism and inflammation. Family Coriobacteriaceae (2.5%),
type Actinobacteria (9.1%), modulates lipid metabolism in an animal. Coriobacteriaceae was elevated in gobies with high ADG [8].
The genus Ruminococcus is the most numerous genus of the Firmicutes type. Grain feeding is generally associated with an increase in the relative abundance of Ruminococcus and a reduction in the genus Acinetobacter (4.1%) [13]. The genus Ruminococcus plays a major role in the degradation of rumen cellulose (polysaccharides) [8,22]. Ruminococcus is one of the main inherited bacteria, which corresponds to a key role in cellulolysis [16,21]. The genus Akkermansia (0.8%) promotes inflammation [8.24]. The genus Escherichia (2.6%) produces toxic compounds by fermenting proteins [24]. Escherichia albertii (2.3%), the most abundant species found, is an eae-positive strain of Escherichia coli, which differs from ordinary E. colli by the presence of an additional eae gene [29]. The proportion of collie bacteria increases significantly in inflammatory processes and leads to dysbiosis. The genus Bacillus (0.5%) has antimicrobial activity [8]. The genus Methanobrevibacter (3.0%) is the most common genus of methane producers in the rumen. A common feature of bacteria of the genus Blautia is the utilization of hydrogen and carbon dioxide with the production of acetates (acetic acid). Caloramator is a poorly studied genus of thermophilic bacteria belonging to the type Firmicutes (3.0%) [27]. The genus Lysinibacillus (1.1%) is a spindle-shaped bacteria isolated from various objects, including agricultural soils and factory wastewater. The natural ecological niche of bacteria of the genus Lysinibacillus is considered to be soil. In the process of metabolism, they can use oxygen, metabolize various sugars and other simple carbohydrates. The genus Alcaliphilus (7.0%) and Clostridium are involved in metabolism and assimilation of nutrients. A representative of the genus Alcaliphilus is peptidifermentans (1.9%), a microorganism capable of fermenting peptides and reducing Fe (III) [28].
The well-known genus Lactobacillus (0.3%) type Firmicutes, order Clostridiales, is a producer of lactic acid (lactate) from starch and its relative abundance is high in grain-fed cattle. Lactic acid is not metabolized by animals, it is instead absorbed through the rumen walls, causing an increase in lactic acid and a decrease in blood pH, and VFA accumulates in the rumen, which has a detrimental effect on the microbiota and the animal. These abrupt and sudden changes result in a decrease in rumen pH and an increase in the number of Lactobacillus species. The genera Lactobacillus, Clostridium, makes bile acids available for further biotransformation. The genera Lactobacillus and Ruminococcus (2.2%) were significantly higher in the jejunum of the grain-fed group, while Solibacillus (4.2%) was significantly higher in the herbal-fed group [15, 20].
The genus Butyrivibrio (1.8%) belongs to the Lachnospiraceae family [8]. Butyrivibrio is associated with the breakdown of hemicellulose in the rumen and the end product of fermentation is butyrate, which is an important energy source for intestinal epithelial cells, as is Blautia (3.2%) [8,21]. Members of this genus have often been identified as associated with gobies, which effectively fed [21]. Butyrivibrio degrades pictin, phenylalanine, tyrosine and tryptophan [8,26].
Conclusion
In this study, we experimentally deciphered the composition of the intestinal microbiome of imported Aberdeen Angus cows using NGS sequencing on the MiSeq Illumina device.
As a result of identifying the composition of the microbiome, a high biological diversity of the microbial population was established.
Particularly dangerous pathogens in animals have not been found. However, there is a significant proportion of opportunistic microorganisms (genera Serratia,
Escherichia), which, with a weakening of general and local immunity in the body, can cause dysbiosis and a pathological process. In this regard, it is necessary to pay attention to the shift towards beneficial microflora by increasing the number of beneficial microorganisms.
There was a high relative abundance of types Firmicutes (55.0%), Proteobacteria (16.8%), families Enterobacteriaceae (6.7%), Lachnospiraceae (7.1%), genus Ruminococcus (2.2%), despite the fact that the animals were fed a forage diet. The group of animals has feeding efficiency, as indicated by the increased number of types of Firmicutes, Proteobacteria, the family Coriobacteriaceae (2.5%), and the genus Butyrivibrio (1.8%). The increase in the type Euryarchaeota (5.1%), the genus Methanobrevibacter (3.0%) is evidence of the production of methane by animals, which adversely affects the environment.
References:
1 Carberry CA, Kenny DA, Han S, McCabe MS,Waters SM. Effect of phenotypic residual feed intake and dietary forage content on the rumen microbial community of beef cattle. Appl Environ Microbiol 2012; 78:4949-58.
2 Rufener WH, Nelson W, Wolin MJ. Maintenance of the rumen microbial population in continuous culture. Appl Microbiol. 1962; 11(May).
3 Chloe Matthews, Fiona Crispie, Eva Lewis, Michael Reid, Paul W. O'Toole & Paul D. Cotter. The rumen microbiome: a crucial consideration when optimising milk and meat production and nitrogen utilisation efficiency. Gut Microbes. 2019, VOL. 10, NO. 2, 115-132.
4 Pace, N.R., D.A. Stahl, D.J. Lane, and G.J. Olsen. 1985. Analyzing natural microbial populations by rRNA sequences. ASM News 51:4-12.
5 Li RW, Li W, Sun J, Yu P, Baldwin RL, Urban JF. The effect of helminth infection on the microbial composition and structure of the caprine abomasal microbiome. Scientific reports. 2016;6(1): 1-10.
6 Klindworth A, Pruesse E, Schweer T, Peplies J, Quast C, et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies Nucleic Acids Res. 2013; Jan; 41(1): e1. [PMCfreearticle] [PubMed].
7 Khafipour E.S. Li, Tun H.M., Derakhshani H., Moossavi S., Plaizier J.C.. Effects of grain feeding on microbiota in the digestive tract of cattle. Animal Frontiers, 2016; 6(2): 13-19.
8 Harvey C. Freetly,1 Aaron Dickey, Amanda K. Lindholm-Perry, Richard M. Thallman, John W. Keele, Andrew P. Foote, James E. Wells. Digestive tract microbiota of beef cattle that differed in feed efficiency. Journal of Animal Science, 2020; 98(2): 1-16.
9 Orin C. Shanks, Catherine A. Kelty, Shawn Archibeque, Michael Jenkins, Ryan J. Newton, Sandra L. McLellan, Susan M. Huse, Mitchell L. Sogin. Community Structures of Fecal Bacteria in Cattle from Different Animal Feeding Operations. Appl. Environ. Microbiol, 2011; 77(9):2992-300.
10 Fernando, S.C., Purvis H.T., Najar F.Z., Sukharnikov L.O., Krehbiel C.R., Nagaraja T.G., Roe B.A., and Desilva U. Rumen microbial population dynamics during adaptation to a high-grain diet. Appl. Environ. Microbiol. 2010.76(22):7482-7490. doi:10.1128/AEM.00388-10.
11 Mao, S., R. Zhang, D. Wang, and W. Zhu. 2013. Impact of subacute ruminal acidosis (SARA) adaptation on rumen microbiota in dairy cattle using pyrosequencing. Anaerobe 24:1219. doi:10.1016/j.anaerobe.2013.08.003.
12 Li, R.W., EE. Connor, C. Li, R.L. Baldwin Vi, and M.E. Sparks. 2012. Characterization of the rumen microbiota of pre-ruminant calves using metagenomic tools. Environ. Microbiol. 14(1):129-139. doi:10.1111/j.1462-2920.2011.02543.x.
13 Khafipour, E., S. Li, J.C. Plaizier, and D.O. Krause. 2009b. Rumen microbiome composition determined using two nutritional models of subacute ruminal acidosis. Appl. Environ. Microbiol. 75(22):7115-7124. doi:10.1128/AEM.00739-09.
14 Plaizier, J.C., S. Li, H.M. Tun, D.O. Krause and Ehsan Khafipour. 2016. Effects of experimentally induced subacute ruminal acidosis (SARA) on the rumen and hindgut microbiome in dairy cows. Front. Microbiol.
15 Jianan Liu, Fang Liu, Wentao Cai, Cunling Jia, Ying Bai, Yanghua He, Weiyun Zhu, Robert W. Li Diet-induced Changes in Bacterial Communities in the Jejunum and Their Associations with Bile Acids in Angus Beef Cattle. Animal Microbiome. 2020; 33(2):26.
16 John Wallace R., Goor Sasson, Philip C. Garnsworthy, Ilma Tapio. A heritable subset of the core rumen microbiome dictates dairy cow productivity and emissions. Science Advances. 2019; 5(7). DOI: 10.1126/sciadv.aav8391.
17 Shabat, S. K., G. Sasson, A. Doron-Faigenboim, T. Durman, S. Yaacoby, M. E. Berg Miller, B. A. White, N. Shterzer, and I. Mizrahi. 2016. Specific microbiome-dependent mechanisms underlie the energy harvest efficiency of ruminants. ISME J. 10:2958-2972. doi: 10.1038/ismej.2016.62.
18 Li, F., and L. L. Guan. 2017. Metatranscriptomic profiling reveals linkages between the active rumen microbiome and feed efficiency in beef cattle. Appl. Environ. Microbiol. 83:e00061-17. doi: 10.1128/AEM.00061-17.
19 Myer, P. R., T. P. Smith, J. E. Wells, L. A. Kuehn, and H. C. Freetly. 2015a. Rumen microbiome from steers differing in feed efficiency. Plos One 10:e0129174. doi:10.1371/journal.pone.0129174.
20 Chloe Matthews, Fiona Crispie, Eva Lewis, Michael Reid, Paul W. O'Toole, and Paul D. Cotter. The rumen microbiome: a crucial consideration when optimising milk and meat production and nitrogen utilisation efficiency.Gut Microbes. 2019; 10(2): 115-132.
21 Phillip R. Myera. Bovine Genome-Microbiome Interactions: Metagenomic Frontier for the Selection of Efficient Productivity in Cattle Systems. American society for microbiology. 2019; 4 (3): e00103-19.
22 SimonDeusch, BrunoTilocca, Amélia Camarinha-Silva, Jana Seifert. News in livestock research — use of Omics-technologies to study the microbiota in the gastrointestinal tract of farm animals. Computational and Structural Biotechnology Journal. 2015; 13: 55-63.
23 Minseok Kim, Tansol Park, and Zhongtang Yu. Metagenomic investigation of gastrointestinal microbiome in cattle. Asian-Australas J Anim Sci. 2017; 30: 11:1515-1528.
24 Guoxing Zhang, Yachun Wang, Hanpeng Luo, Wenqing Qiu, Hailiang Zhang, Lirong Hu, Yajing Wang, Ganghui Dong and Gang Guo. The Association Between Inflammaging and Age-Related Changes in the Ruminal and Fecal Microbiota Among Lactating Holstein Cows. Front. Microbiol., 09 August 2019 | https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.01803.
25 Bach A., López-García A., González-Recio O., Elcoso G., Fábregas F., Chaucheyras Durand F., Castex M. Changes in the rumen and colon microbiota and effects of live yeast dietary supplementation during the transition from the dry period to lactation of dairy cows. Journal of Dairy Science, 2019; 102(7):6180-6198.
26 William J. Kelly, Sinead C. Leahy, Janine Kamke, Priya Soni, Satoshi Koike, Roderick Mackie, Rekha Seshadri, Gregory M. Cook, Sergio E. Morales, Chris Greening & Graeme T. Attwood. Occurrence and expression of genes encoding methyl-compound production in rumen bacteria. Animal Microbiome, 2019; 1: 15.
27 Лычкова А.Э. Взаимодействие электромоторной активности гладких мышц и микрофлоры кишечника. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2012. 11; 84-90.
28 Zhilina T.N., Zavarzina D.G., Kolganova T.V., Lysenko A.M. and Tourova T.P. Alkaliphilus peptidofermentans sp. nov., a New Alkaliphilic Bacterial Soda Lake Isolate Capable of Peptide Fermentation and Fe(III) Reduction // Microbiology, 2009, Vol. 78, No. 4, pp. 445454.
29 Ooka T., Seto K., Kawano K., Kobayashi H., Etoh Y., Ichihara S., Hayashi T. Clinical Significance of Escherichia albertii. Emerging Infectious Diseases. 2012. 18(3); 488-492.
