CC BY
22DOI https://doi.org/10.47612/1999-9127-2022-32-81-87 УДК 577.121:577.125.2:612.681
И. Н. Андреева1, Р. С. Шулинский1, Е. П. Михаленко1, А. В. Байда2, Н. Б. Кузнецова2,
А. В. Кильчевский1
ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОБИОМА КИШЕЧНИКА У ЛЮДЕЙ
СТАРШЕ 60 ЛЕТ
Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: [email protected] ^Государственное учреждение образования «Белорусская академия последипломного образования» Республика Беларусь, 220013, г. Минск, ул. П. Бровки, 3, корпус 3
Старение определяется сложным взаимодействием между генетическими факторами и факторами окружающей среды. Все больше данных свидетельствует о том, что микробиом кишечника оказывает влияние на многие возрастные изменения, включая дисрегуляцию иммунной системы и восприимчивость к заболеваниям. В данной работе проанализированы особенности микробиома кишечника у 23 человек старшей возрастной группы (старше 60 лет), проживающих в Беларуси. Генетический анализ биологического материала проводился методом метагеномного анализа с использованием технологии высокопроизводительного секвенирования компании Illumina. Наиболее представленные компоненты в исследованных образцах микробиома включали представителей семейств Ruminococcaceae и Verrucomicrobiaceae. Было выявлено, что с увеличением возраста человека уменьшается количество бактерий семейства Enterobacteriaceae, а также наблюдается тенденция к уменьшению количества бактерий семейства Erysipelotrichaceae.
Ключевые слова: долголетие, старение, образ жизни, микробиом кишечника, метагеномный анализ.
Введение
В настоящее время в мире число людей в возрасте 60 лет и старше, по сравнению с 1980-ми годами, удвоилось. Для Республики Беларусь коэффициент старения населения в 2018 году составил около 20%. Старение населения ставит задачи укрепления здоровья и расширения функциональных возможностей пожилых людей для увеличения периода активной жизни человека [1].
Увеличение доли пожилых людей в структуре населения экономически развитых и развивающихся стран, ставшее особенно заметным в последние десятилетия, вызывает большой интерес к изучению первичных механизмов старения и биологических факторов, определяющих продолжительность жизни [2]. Кроме того, старение человека часто сопровождается заболеваниями, такими как сердечно-сосудистые, атеросклероз, слабоумие, диабет II типа, болезнь Альцгеймера, остеопороз и рак [2, 3]. Выявление фундаментальных механизмов
старения, в том числе генетически обусловленных, является необходимой предпосылкой для продления жизни и разработки эффективных мер сохранения активного долголетия [4, 5].
Согласно современным представлениям, старение определяется сложным взаимодействием между генетическими факторами и факторами окружающей среды. Основу старения составляет постепенная дегенерация всего транскриптома клетки, то есть нарушения функций регуляторных и структурных генов, вызываемые различными экзогенными и эндогенными факторами [6, 7]. Прогрессия старения включает постепенное ослабление иммунной системы, что ведет к дисбалансу между провоспалительной и противовоспалительной активностями. Возрастные изменения провоспалительного статуса приводят к системному воспалению, что увеличивает склонность к хроническим заболеваниям, снижению когнитивных функций, нарушению обмена веществ и смертности [8-10].
На функциональное состояние организма, кроме образа жизни человека и генетических особенностей системы обмена веществ, также влияет качественный и количественный состав микробиома кишечника человека. Исследование микробиома человека, различных аспектов его формирования и функционирования привлекают все большее внимание. Во-первых, стоит отметить, что действие кишечной микробиоты может оказывать регулирующее влияние на экспрессию генов человека. Из этого можно предположить, что сходный фенотипический эффект может быть достигнут как за счет собственных генетических особенностей организма человека, так и за счет функционирования генетической системы, составляющей микробиом человека. Во-вторых, микробиом является одним из основных факторов, определяющим функционирование иммунной системы, системный ответ на воспаление [11]. Кроме того, микробиом через ось «кишечник-мозг» участвует в модуляции когнитивных функций [12]. Адекватно сформированный микробиом поддерживает здоровое состояние нашего организма и, возможно, даже продлевает жизнь [13].
Установлено, что с возрастом кишечная ми-кробиота претерпевает значительные изменения, связанные с процессами старения [14, 15]. Эти изменения во многом еще недостаточно исследованы, но установлено, что в процессе старения существенно изменяется относительная пропорция микроорганизмов. С возрастом в микробиоте человека увеличивается доля Bacteroidetes и уменьшается доля Firmicutes [16, 17]. В связи с этим значительный интерес представляет установление особенностей микробиоты кишечника человека, играющей важную роль в формировании здорового старения и активного долголетия.
Цель данного исследования — изучить особенности микробиома кишечника у людей старшей возрастной группы, проживающих в Беларуси.
Материалы и методы исследования
Проведено обследование 23 человек (16 женщин и 7 мужчин), поступивших в отделения Республиканского клинического госпиталя инвалидов Великой Отечественной войны имени П. М. Машерова. У всех участников ис-
следования получено письменное информированное согласие на проведение исследования. Возраст пациентов был в диапазоне от 74 до 93 лет (средний возраст — 81 ± 0,2).
Известно, что на состав микробиома оказывают влияние факторы окружающей среды и диета. Поэтому было проведено обследование добровольцев, чтобы сформировать однородную группу исследования. Обследование включало изучение клинико-фенотипических показателей с оценкой антропометрических, клинико-функциональных данных, а также анализа некоторых средовых факторов (место проживания, состав семьи, наследственность, хобби, вредные привычки, социальное взаимодействие) и оценку пищевого статуса добровольцев.
У участников исследования отбирали в стерильные контейнеры стул. Отобранные образцы замораживали при температуре минус 20 °С, хранили и транспортировали образцы при данной температуре.
Для выделения микробной ДНК из образцов стула использовали набор innuPREP Stool DNA Kit (Anflytik Jena) по протоколу производителя.
После выделения тотальной ДНК и подготовки библиотек для секвенирования было выполнено секвенирование вариабельных участков V3-V4 гена 16S рРНК с использованием набора MiSeq Reagent Kit v3 (600 циклов) и прибора MiSeq Illumina (США) согласно рекомендациям производителя. На первом этапе для анализа полученных данных и их визуализации использовали программу 16S Metagenomics (Version 1.1.0), представляемую фирмой Illumina в составе пакета BaseSpace (https://basespace.illumina.com).
Оценку качества прочтений и тримминг некачественных оснований проводили в программах FastQC и Trimmomatic соответственно. Анализ регионов V3-V4 проводили в программе qiime2 в соответствии со следующими этапами:
1) Импорт данных в типе «SampleData[Pair edEndSequencesWithQuality]» в метаданные;
2) Удаление шумов из прочтений с использованием утилиты dada2;
3) Классификация прочтения с использованием утилиты classify-sklearn и использованием предварительно обученного байесов-
ского классификатора методами машинного обучения;
4) Расчет и нормализация метрик альфа-и бета-разнообразия, понижение размерности с использованием векторов Шеннона.
При анализе данных учитывались основные параметры пациентов, также загруженные как файл с метаданными в tsv формате. Финальная версия пайплайна размещена по ссыл-
ке https://github.com/IGC-bioinf/metagenome_ scripts/blob/main/qiime2.sh.
Результаты и обсуждение
Количество прочтений в образцах библиотек составляло от 56 365 до 849 731 (табл. 1). После процедуры очистки шумов и классификации прочтений было процессировано от 32 522 до 582 484 прочтений.
Таблица 1
Характеристика исследованных образов микробиома пациентов с наиболее часто
встречающимися семействами
Шифр образца Возраст Число прочтений % прочтений, семейство Ruminococcaceae % прочтений, семейство Verrucomicrobiaceae
563_S9 74 525 719 26,03 48,38
20_S8 76 46 116 10,48 0,39
21_S9 77 49 491 24,64 24,91
22_S10 77 25 180 46,53 26,29
560_S11 77 304 894 52,35 6,61
561_S6 77 375 934 31,44 0,9
564_S10 77 543 014 22,51 61,83
568_S15 77 207 094 33,34 13,21
15_S3 78 36 507 16,84 0,0
556_S7 78 261 675 59,63 0,07
559_S14 78 334 893 46,12 0,03
17_S5 79 39 290 46,09 0,18
558_S13 79 227 356 32,55 32,39
18_S6 81 37 935 50,06 3,37
2_S17 82 295 285 40,62 0,05
562_S8 82 398 923 57,48 0,17
19_S7 83 69 325 26,11 0,0
3_S18 83 250 627 46,22 15,79
557_S12 86 356 297 13,09 58,07
16_S4 87 41 176 28,54 2,3
1_S16 89 280 259 37,68 32,59
5_S20 90 359 184 29,08 1,25
4_S19 93 151 390 35,84 17,03
Наиболее представленные компоненты в исследованных образцах микробиома включали представителей семейств Яиттососсасвав и Уеггисот1сгоЫасеае (табл. 1). В некоторых образцах к представителям одного семейства (Яиттососсасеае, Уеггисот^гоЫасеае) отно-
силось более 50 процентов детектированных прочтений (рис. 1а, б). При иерархической кластеризации образцов был выделен кластер, включающий образцы, которые имели доминирующие виды бактерий рода Akkermansia (от 5,89 до 52,86%).
Рис. 1 а. Процентное содержание прочтений бактерий различных семейств в образцах библиотек
Рис. 1 б. Процентное содержание прочтений бактерий различных семейств в среднем по библиотекам
При понижении размерности с использованием несходства Брея-Кертиса была выделена тенденция кластеризации образцов людей в возрасте старше 82 лет, а также была отмечена высокая степень расхождения среди остальных образцов (рис. 2а). Полученные
результаты свидетельствуют о более однородном составе микробиома у людей старше 80 лет. При использовании аналогичного анализа кластеризации образцов в соответствии с индексом массы тела выявлено не было (рис. 2б).
Далее был проведен анализ процентно-
Рис. 2. Кластеризация образцов с покраской по возрасту (а), и по индексу массы тела пациента (б) Более темный тон точки указывает на более высокое значение возраста/индекса массы тела
го соотношения разнообразия микробио-ма для каждого пациента (рис. 3). Было выявлено, что с увеличением возраста пациента уменьшается количество бактерий семейства ЕМегоЬа^епасеае, а также наблю-
дается тенденция к уменьшению количества бактерий семейства Erysipelotrichaceae. Процентное соотношение встречаемости в исследованных образцах представителей семейства Ямттососсасеае не отличалось у пациентов
Р £ С № 1 > П I
Рис. 3. Процентное соотношение бактерий в микробиоме пациентов. Подписи на оси ординат в формате
«возраст; индекс массы тела»
разного возраста. Однако можно отметить, что наблюдается повышенное содержание бактерий семейства Bifidobacteriaceae в метагено-ме наиболее пожилой пациентки.
В нашем исследовании показано, что у людей старше 80 лет состав микробиома более однороден, чем у людей младше 80 лет. Кроме того, необходимо подчеркнуть наличие кластера образцов, которые имели доминирующие виды бактерий рода Akkermansia (от 5,89 до 52,86%). Схожие результаты были также получены и другими исследователями. Результаты многочисленных исследований показывают, что представленность таксонов (Verrucomicrobia, Akkermansia, Christensenellaceae), для которых доказана ассоциация со здоровьем, повышена у пожилых людей [20-22]. Akkermansia был наиболее часто упоминаемым родом в рассмотренных исследованиях [22, 23]. Akkermansia muciniphila является одним из немногих известных видов филума Verrucomicrobia, и этот вид известен своей способностью разлагать муцин и способствовать целостности кишечника за счет снижения уровня токсичности, связанного с диетой с высоким содержанием жиров [24, 25]. Эти данные свидетельствуют о том, что Verrucomicrobia и Akkermansia могут способствовать гомеостазу кишечника и здоровому старению.
Заключение
Таким образом, наиболее стабильные компоненты в исследованных образцах микробио-ма людей старшей возрастной группы включали представителей семейств Ruminococcaceae и Verrucomicrobiaceae. Было выявлено, что с увеличением возраста участников исследования уменьшается количество бактерий семейства Enterobacteriaceae, а также наблюдается тенденция к уменьшению количества бактерий семейства Erysipelotrichaceae. Дальнейшие исследования будут продолжены в направлении изучения взаимодействия генома самого человека и микробиома его желудочно-кишечного тракта для выявления маркеров, ассоциированных со старением и продолжительностью жизни.
Список использованных источников
1. Национальный статистический комитет
Республики Беларусь, [Электронный ресурс].
- 2018. - Режим доступа: http://www.belstat. gov.by/ofitsialnaya-statistika/solialnaya-sfera/ demografiya_2/. - Дата доступа: 12.01.2019.
2. Vaupel, J. W. Biodemography of human ageing / J. W. Vaupel // Nature. - 2010. - Vol. 464. -P. 536-542.
3. The critical need to promote research of aging and agingrelated diseases to improve health and longevity of the elderly population / K. Jin [et. al.] // Aging Disease. - 2015. - Vol. 6. - P. 1-5.
4. International Society on Aging and Disease (ISOAD) [Электронный ресурс]. - 2018.
- Режим доступа: http://isoad.org/. - Дата доступа: 09.03.2022.
5. Геномика старения и предиктивная медицина / В. С. Баранов, О. С. Глотов, Е. В. Баранова // Успехи геронтологии. - 2010. - Т. 23. № 3. - С. 329-338.
6. Баранов В. С., Баранова E. В. Генетические аспекты старения // Успехи геронтол. -2007. - Т. 20, № 2. - С. 26-34.
7. The transcriptional profile of aging in the human kidney / E. Graham [et.al.] // PLos Biology.
- 2004. - Vol. 2, № 12. - P. 1-23.
8. Chronic inflammation in ageing, cardiovascular disease, and frailty / L. Ferrucci // Nat. Rev. Cardiol. - 2018. - Vol. 15. - P. 505-522.
9. Gorelick, P. B. Role of inflammation in cognitive impairment: Results of observational epidemiological studies and clinical trials / P. B. Gore-lick // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2010. - Vol. 1207.
- P. 155-162.
10. Аверина, О. В., Даниленко, В. Н. Микро-биота кишечника человека: роль в становлении и функционировании нервной системы // Микробиология. - 2017. - Т. 86, № 1. - С. 5-24.
11. Honda, K. The Microbiome in Infectious Disease and Inflammation / K. Honda, D.R. Litt-man // Annu. Rev. Immunol. - 2012. - Vol. 30. -P. 759-795.
12. Cryan, J. F. Mind-altering microorganisms: The impact of the gut microbiota on brain and behavior / J. F. Cryan, T. G. Dinan // Nat. Rev. Neu-rosci. - 2012. - Vol. 13. - P. 701-712.
13. Zapata, H. J. The Microbiota and Microbiome in Aging: Potential Implications in Health and Age-Related Diseases / H. J. Zapata, V. J. Quagliarello // J. Am. Geriatr. Soc. - 2015.
- Vol. 63. - P. 776-781.
14. Human gut microbiome viewed across age
and geography / T.Yatsunenko [et.al] // Nature. -2012. - Vol. 486. - P. 222-227.
15. Gut microbiota changes in the extreme decades of human life: A focus on centenarians / A. Santoro [et.al.] // Cell. Mol. Life Sci. - 2018. - Vol. 75. - P. 129-148.
16. Gut microbiota composition correlates with diet and health in the elderly / M. J. Claesson [et. al.] // Nature. - 2012. - Vol. 488. - P. 178-184.
17. The Gut Microbiome, Aging, and Longevity: A Systematic Review / V. D. Badal [et.al.] // Nutrients. - 2020. - Vol. 12, № 12. - P. 3 759.
18. Electronic resource. - Mode of access: https://basespace.illumina.com. - Date of access: 10.03.2022.
19. Electronic resource. - Mode of access: https://github.com/IGC-bioinf/metagenome_ scripts/blob/main/qiime2.sh. - Date of access: 10.03.2022.
20. Walters, W. A. Meta-analyses of human gut microbes associated with obesity and IBD / W. A. Walters, Z. Xu, R. Knight // FEBS Lett. - 2014.
- Vol. 588. - P. 4223-4233.
21. Age-related changes in gut microbiota composition from newborn to centenarian: A cross-sectional study / T.Odamaki [et.al.] // BMC Microbiol. - 2016. - Vol. 16. - P. 90.
22. Gut microbiota and extreme longevity / E. Biagi [et.al.] // Curr. Biol. -2016. - Vol. 26. -P. 1480-1485.
23. Gastro-intestinal and oral microbiome signatures associated with healthy aging / H. Sin-gh[et.al.] // GeroScience. - 2019. - Vol. 41. -P. 907-921.
24. Cross-talk between Akkermansia mucin-iphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity / A. Everard [et.al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2013. - Vol. 110. - P. 9 0669 071.
25. Function of Akkermansia muciniphila in Obesity: Interactions With Lipid Metabolism, Immune Response and Gut Systems / Y. Xu [et.al.] // Front. Microbiol. - 2020. - Vol. 11.
I. N. Andreeva1, R. S. Shulinski1, A. P. Mikhalenka1, A. V. Bajda2, N. B. Kuzniatsova2,
A. V. Kilchevsky1
STUDYING THE GUT MICROBIOME IN PEOPLE OVER 60
:State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, Republic of Belarus 2Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education 3/3 P. Brovka St., 220013 Minsk, Republic of Belarus e-mail: [email protected]
Aging is determined by the complex interaction between genetic and environmental factors. A growing body of evidence suggests that the gut microbiome determines many age-related changes, including immune system dysregulation and disease susceptibility. This paper analyzes the characteristics of the gut microbiome in 23 people of an elderly group living in Belarus. The genetic analysis of biological material was carried out by metagenomic analysis using the high-throughput sequencing technology from Illumina. The most demonstrated components in the studied microbiome samples included Ruminococcaceae and Verrucomicrobiaceae representatives. In the study group, it was found that with aging, the number of bacteria of the Enterobacteriaceae family decreases in a patient, and there is also a tendency to a decrease in the number of bacteria of the Erysipelotrichaceae family.
Keywords: longevity, aging, lifespan, gut microbiome, metagenomic analysis.
Дата поступления в редакцию: 11 марта 2022 г.
