ИССЛЕДОВАНИЕ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В СИСТЕМЕ РИФАБУТИН - ГИДРОКСИПРОПИЛ-β-ЦИКЛОДЕКСТРИН МЕТОДОМ АФФИННОГО КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 543.545.2

А. В. Аншакова*, Ю. В. Ермоленко*, М. Я. Каменцев***, В. Ю. Конюхов*, О. О. Максименко**, С. Э. Гельперина**

* Российский химико-технологический университетим. Д.И. Менделеева, Москва, Россия, 125047 г. Москва, Миусская пл., д.9

** Общество с ограниченной ответственностью «НПК «Наносистема», Москва, Россия, 115446, Москва, Коломенский проезд, д. 13 А

***Санкт-Петербургский Государственный Университет, Институт химии, Санкт-Петербург, Россия, 198504, Санкт-Петербург, Университетский пр., д. 26

e-mail: [email protected]

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В СИСТЕМЕ РИФАБУТИН - ГИДРОКСИПРОПИЛ-Р-ЦИКЛОДЕКСТРИН МЕТОДОМ АФФИННОГО КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Методом аффинного капиллярного электрофореза (КЭФ) изучено влияние кислотности среды на ионное состояние и эффективную подвижность молекулы рифабутина (РБ). Установлено, что при рН 4,7 ведущего электролита эффективная электрофоретическая подвижность РБ является функцией от концентрации 2-гидроксипропил-Р-циклодекстрина (ГП-Р-ЦД). Константа устойчивости межмолекулярного взаимодействия РБ - (ГП-Р-ЦД) при рН 4,7 (ацетатный буферный раствор с общей молярной концентрацией 0,05 М) составила 60,5 (lg^1:1=1,78).

Ключевые слова: рифабутин; гидроксипропил-Р-циклодекстрин; межмолекулярное взаимодействие; аффинный капиллярный электрофорез.

Метод аффинного КЭФ широко используют для изучения комплексообразования, а обработка полученных данных об изменении эффективной электрофоретической подвижности (цэфф) молекулы исследуемого вещества в присутствии избытка лиганда позволяет вычислить константы устойчивости комплексов [1]. В представляемой работе метод аффинного КЭФ использовали для оценки устойчивости межмолекулярного ассоциата противотуберкулезного антибиотика рифабутина (РБ) и макроциклического олигосахарида 2-гидроксипропил-Р-циклодекстрина (ГП-Р-ЦД).

Циклодекстрины (ЦД) применяют в технологии (в частности, в фармацевтике) для повышения растворимости в воде малорастворимых веществ, а также для повышения их химической стабильности. Торообразная форма и строение молекулы (гидрофобная внутренняя полость и гидрофильная поверхность) обуславливают способность ЦД к образованию «комплексов включения». Поскольку соединения группы ЦД отличаются количеством а-(1,4)-связанных глюкопиранозных звеньев, различны и параметры молекулы - внешний и внутренний диаметры тора. Таким образом, для каждой молекулы - «гостя» можно подобрать свою, подходящую по размеру молекулу ЦД - «хозяина». Для фармацевтической технологии особый интерес представляет ГП-Р-ЦД, который, благодаря его высокой растворимости в воде (500 мг/см3) и низкой токсичности (у крыс ЬБбо достигает 10 и >2 г/кг при внутривенном и пероральном приеме, соответственно) часто применяют в качестве вспомогательного вещества. Использование ГП-Р-ЦД для солюбилизации РБ привело к 3-кратному повышению концентрации этого малорастворимого антибиотика в растворе (сэ=0,2 мг/см3 [2]) и увеличило его эффективность в отношении

экспериментальной туберкулезной инфекции [3]. С помощью методов молекулярной спектроскопии было установлено, что повышение растворимости РБ достигалось за счет образования водорастворимых ассоциатов РБ - (ГП-Р-ЦД), а не традиционных для ЦД «комплексов включения» [4]. Цель данной работы - исследование межмолекулярного взаимодействия в системе РБ - (ГП-Р-ЦД) с помощью метода аффинного КЭФ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. В работе использовали субстанцию РБ производства Luohe Nanjiecun Pharmaceutical Group Pharmacy Co., LTD (Китай). ГП-Р-ЦД был приобретен в Sigma-Aldrich (Германия).

Влияние кислотности среды и концентрации ГП-Р-ЦД на эффективную электрофоретическую подвижность РБ устанавливали с помощью системы КЭФ «Капель 105М» («Люмэкс», Россия), оборудованной спектрофотометрическим

детектором, кварцевым капилляром (внутренний диаметр 75 мм, эффективная длина 50 см, общая длина 60 см), с программным обеспечением «Эльфоран». Термостатирование капилляра проводили при +20°С; напряжение на капилляре +20 кВ; длина волны детектирования 214 нм; ввод пробы гидродинамический (30 мБар), 5 секунд. Перед вводом пробы капилляр промывали в течение 5 минут последовательно водой и ведущим электролитом. Концентрация РБ в пробе - 26,8 мкМ; концентрация ГП-Р-ЦД в растворе ведущего электролита - 0-70 мкМ. В качестве ведущего электролита использовали буферные растворы с общей молярной концентрацией 0,05 М: фосфатный (рН 2,34; 5,7; 6,2; 6,9; 7,4; 8,0), ацетатный (рН 4 и 4,7), тетраборатный (рН 9,18), карбонатный (рН 10,2). Раствор электролита дегазировали центрифугированием (132000 об/мин, 15°С, 5 мин).

В качестве нейтральной метки электроосмотического потока (ЭОП) использовали 0,1%-ый водный раствор ДМСО. По полученным результатам строили изотерму связывания в координатах: Цэфф = /(¿(ГП-Р-ЦД)), где: Цэфф - эффективная электрофоретическая подвижность РБ, и рассчитывали условную константу ассоциации Касс (РБ-(ГП-Р-ЦД)):

К - [Ь] = (1)

где, ц - экспериментально полученное значение электрофоретической подвижности (ц = %сЦо + х№ (с учетом мольной доли связанного (%с) и свободного (хг) РБ)); К - константа равновесия, [Ь] -концентрация лиганда, ц и ц-электрофоретические подвижности свободного и связанного РБ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Молекула РБ имеет несколько констант кислотной диссоциации (рКа), соответствующих ионизации различных групп, и в зависимости от кислотности среды в растворе преобладает одна из ионных форм молекулы РБ [5]. Информация о ионных состояниях частицы РБ в зависимости от кислотности среды, полученная методом зонного КЭФ (Рис. 1), соответствует известным из литературы данным о константах кислотности РБ. В кислой и нейтральной областях (до рН 8) время миграции РБ меньше времени миграции ЭОП, следовательно, при этих условиях РБ существует в растворе в виде катиона. При рН 8 пики РБ и нейтральной метки ЭОП совпадают, что говорит о нейтральном заряде частицы РБ в среде ведущего электролита. В щелочной же области метка ЭОП опережает пик РБ,

что свидетельствует об отрицательном заряде РБ в этих условиях. На Рис. 1 (Б) представлена графическая рН-зависимость эффективной электрофоретической подвижности РБ Цэфф(РБ). В кислой среде Цэфф(РБ) остается постоянной и не изменяется до рН=4. В данной области рН РБ существует в виде дикатиона (рКа азота имидазольной группы - 4,0-5,0 [5]). При дальнейшем повышении рН (диапазон рН от 4 до 8) происходит депротонирование азота имидазольной группы. Это приводит к уменьшению положительного заряда катиона РБ, что выражается в уменьшении цэфф катиона. При рН=8 Цэфф(РБ) совпадает со скоростью ЭОП: в этой области происходит отщепление протона от гидроксильной группы в остатке нафталина (рКа=6,5-7,5) и образуется цвиттер-ион РБ. Далее, до рН=11, на частице РБ появляется и увеличивается отрицательный заряд. В этой области рН происходит депротонирование азота пиперидиновой группы молекулы РБ (рКа=9,7-11). Данные, полученные с помощью метода КЭФ, согласуются также с данными о зависимости растворимости РБ от рН, полученными спектрофотометрически [4]. Область существования дикатиона РБ (с относительно высокой Цэфф) соответствует максимуму растворимости РБ. С увеличением рН растворимость РБ понижается и становится минимальной в нейтральной среде. Небольшое увеличение растворимости РБ при рН>8 связано с образованием депротонированной формы молекулы РБ.

А

Б

Рис. 1. Влияние рН на эффективную подвижность РБ:А—смещение времени миграции РБ на электрофореграммах (1 -маркер ЭОП, 2 - РБ); Б—рН-зависимость эффективной подвижности РБ

Устойчивость межмолекулярного ассоциата РБ -(ГП-Р-ЦД) изучали методом аффинного КЭФ, добавляя ГП-Р-ЦД в состав ведущего буфера. На Рис. 2 представлены изотермы связывания, построенные для системы РБ - (ГП-Р-ЦД) в условиях рН 4,7, 7,4 и 9,18.Наибольшая зависимость Цэфф(РБ) от концентрации ГП-Р-ЦД зафиксирована в кислой области, когда РБ представляет собой катион. Следовательно, межмолекулярное взаимодействие между РБ и ГП-Р-ЦД максимально в кислой среде. Следует отметить, что пересечение прямолинейных участков кривой (1) приблизительно соответствует

стехиометрическому соотношению РБ:(ГП^-ЦД) = 1:1. Дальнейшее увеличение концентрации rn-ß-ЦД (>35 мкМ) в ведущем электролите (рН 4,7) практически не оказывало влияния на Цэфф(РБ). Условная константа равновесия, рассчитанная для процесса взаимодействия между РБ и (rn-ß-ЦД) при рН 4,7, равна 60,5 (lg^i i=1,78). В щелочной среде (рН 9,18) добавление rn-ß-ЦД к раствору ведущего электролита значительно слабее влияет на Цэфф(РБ) и практически не оказывает не нее влияния в нейтральной среде (рН 7,4).

ВЫВОДЫ. Установленная методом аффинного КЭФ зависимость ц,эфф(РБ) от кислотности ведущего электролита согласуется с литературными данными о распределении ионных форм РБ в зависимости от рН: молекула РБ нейтральна при рН 8, увеличение и уменьшение ц,эфф(РБ) в кислой и щелочной области связано с образованием катионной и анионной форм молекулы РБ, соответственно Наибольшее межмолекулярное взаимодействие между РБ и ГП-Р-ЦД зарегистрировано в кислой области рН. Условная константа равновесия для реакции взаимодействия РБ и ГП-р-ЦД составила 60,5 (рН 4,7).

эффективную подвижность РБ (▲ - рН 4,7; • - рН 7,4; ■ -рН 9,18)

Аншакова Анастасия Владимировна аспирант кафедры физической химии РХТУ им. Д. И. Менделеева, м.н.с. ООО «НПК «Наносистема», Россия, Москва

Ермоленко Юлия Валерьевна, к.х.н., доцент кафедры аналитической химии РХТУ им. Д.И. Менделеева

Каменцев Михаил Ярославович к.х.н., доцент кафедры аналитической химии, Институт химии СПбГУ Россия, Санкт-Петербург

Конюхов Валерий Юрьевич профессор, д.х.н., заведующий кафедры физической химии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва

Максименко Ольга Олеговна к.х.н., гл.н.с. ООО «НПК «Наносистема», Россия, Москва

Гельперина Светлана Эммануиловна д.х.н., директор по науке ООО «НПК «Наносистема», Россия, Москва

Литература

1. Colton I.J. Affinity capillary electrophoresis: A physical-organic tool for studying interaction in biomolecular recognition / Colton I.J., Carbeck J.D., Rao J. // Electrophoresis.- 1998. -№ 19. - P. 367-368.

2. European Pharmacopoeia 6th edition - Nordlingen (Germany), 2007.

3. Гельперина С.Э., Максименко О.О., Ванчугова Л.В., Бабий В.Е., Игнатьев А.В./ Патент ЕАПО (заявка №201001640/28).

4. Аншакова А.В. Молекулярные взаимодействия в растворах рифабутин - 2-гидроксипропил-Р-циклодекстрин - вода по данным растворимости (1) / Аншакова А.В., Ермоленко Ю.В., Конюхов В.Ю., Польшаков В.И., Максименко О.О., Гельпеина С.Э. // Журнал физической химии. - 2015. -№5. - C. 241-245.

5. Vostrikov V. V. Distribution coefficient of rifabutin in liposome / water system as measured by different methods / Vostrikov V. V., Selishcheva A. A., Sorokoumova G. M. // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. -2008. - Vol. 68. -№ 2. -P. 400-405.

Anshakova Anastasia*'**, Ermolenko Yulia*, KamentsevMikhaif**, Konjukhov Valeriyi*, Мaksimenko Olga**, Gelperina Svetlana**

* D.I. Mendeleev University of Chemical Technology ofRussia, Moscow, Russia

** Nanosystem LTD, Moscow, Russia

*** Saint Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia

e-mail: [email protected]

INVESTIGATION OF RIFABUTIN - HYDROXYPROPYL-p-CYCLODEXTRIN INTERMOLECULAR INTERACTIONBY AFFINITY CAPILLARY ELECTROPHORESIS

Abstract

Influence of pH on ionic state of rifabutin (RB), its electrophoretic mobility, and interaction with hydroxypropyl-P-cyclodextrin (HP-P-CD) in the aqueous media was evaluated using affinity capillary electrophoresis. It was shown that this interaction was most effective at the acidic condition. Moreover, in the acidic medium the electrophoretic mobility of RB was shown to be a function of HP-P-CD concentration. The apparent stability constant of the intermolecular interaction in the RB - (HP-P-CD) system at pH 4.7 (0.05 M acetate buffer) was K:1=60,5 (lgK:1=1,78).

Keywords: rifabutin; hydroxypropyl-P-cyclodextrin; intermolecular interaction; affinity capillary electrophoresis.

с (ГП-р-ЦД), мМ Рис. 2. Влияние концентрации ГП-р-ЦД на