CC BY
48
ФИЗИОЛОГИЯ, БИОФИЗИКА, БИОХИМИЯ
УДК 612. 111+612.118+612.43+618. 4
А. Л. Торопов, А. Д. Ноздрачев, В. И. Циркин
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ
ЭНДОГЕННОГО СЕНСИБИЛИЗАТОРА р-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ (ЭСБАР)
и его аналогов введение
Ранее [1-4] была установлена способность 100-, 500- и 1000-кратных разведений сыворотки крови человека повышать эффективность активации в-адренорецепторов (АР) миоцитов матки крысы, трахеи коровы, коронарной артерии свиньи, а также миокарда лягушки и крысы. Это объяснялось наличием в крови эндогенного сенсибилизатора в-АР (ЭСБАР). Подобную в-адреносенсибилизирующую активность проявляют гистидин, триптофан, тирозин, милдронат и предуктал [2, 3, 5, 6]. Эти вещества были названы аналогами ЭСБАР и стали использоваться для изучения механизма действия и физиологической роли ЭСБАР. В частности, в опытах с миометрием крысы было показано [2], что ЭСБАР и его аналоги проявляют в-адреносенсибилизирующую активность на фоне спонтанной сократительной активности (СА) и на фоне СА, вызванной гиперкалиевым раствором Кребса (ГРК). Показано, что сыворотка крови, т. е. ЭСБАР, и аналоги ЭСБАР восстанавливают эффективность активации в-АР миоцитов матки, трахеи и сосудов, сниженную озоном [2], или в-АР кардиомиоцитов лягушки и крысы, сниженную лизофосфатидилхолином (ЛФХ), который является естественным метаболитом клеток [3]. Эти данные позволили предположить, что механизм действия ЭСБАР и его аналогов связан с их способностью восстанавливать конформационную структуру белков, участвующих в передаче сигнала от рецептора в клетку, в том числе а-субъединицы О-белка, а ЭСБАР и его аналоги предложено рассматривать как шапе-роны [3]. Таким образом, для понимания механизма действия ЭСБАР и его аналогов интерес могут представлять данные о способности этих факторов восстанавливать эффективность активации в-АР, сниженную различными воздействиями [2]. Однако до настоящего времени эти данные либо отсутствуют, либо они единичны — это касается, например способности ЭСБАР и его аналогов влиять на процессы десенситизации [2,
© А. Л. Торопов, А. Д. Ноздрачев, В. И. Циркин, 2011
7]. Не исследовался и вопрос о способности аналогов ЭСБАР проявлять свой эффект на фоне сыворотки крови, в том числе при наличии в ней ЭСБАР. Вместе с тем изучение всех вышеперечисленных вопросов, помимо теоретического значения, имеет и практическую направленность, так как уже в первых исследованиях был поставлен вопрос о возможности применения экзогенных аналогов ЭСБАР в клинике, например для лечения угрозы преждевременных родов или бронхиальной астмы. Поэтому, исходя из представления о важной роли ЭСБАР как регулятора эффективности взаимодействия катехоламинов с в-АР и необходимости более глубокого изучения механизма действия ЭСБАР и его аналогов, в работе была поставлена цель продолжить изучение этих механизмов в опытах с изолированным миометрием крысы. Для этого в 40 сериях опытов, проведенных на 457 продольных полосках рога матки небеременных крыс (п=144) исследовали: 1) способность сыворотки крови (как источника ЭСБАР) и его аналогов противодействовать влиянию в-адреноблокаторов на ингибирующий эффект адреналина (серии 1-15); 2) способность аналогов ЭСБАР проявлять в-адреносенсибилизирующую активность в присутствии 100-кратного разведения сыворотки крови как источника ЭСБАР (серии 16-20); 3) способность гистидина противодействовать десенситизации, развивающейся при многократных кратковременных (по 10 мин) воздействиях адреналина (серия 21); 4) способность гистидина модулировать сократительные эффекты адреналина и ацетилхолина на фоне ЛФХ и куриного яичного желтка как источника ЛФХ (серии 22-30); 5) способность гистидина модулировать влияние адреналина на сократительную реакцию миоцитов в ответ на замену раствора Кребса дистиллированной водой (серии 31-40).
материал и методы исследований
Полоски рога матки длиной 5-8 мм и шириной 2-3 мм получали от крыс, находящихся в фазе метаэструса или диэструса. Ее определяли по картине влагалищного мазка [8]. Забой крыс осуществляли по «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР от 12.08.77). Регистрацию СА полосок проводили на многоканальном «Миоцитографе» по методике [1] при 38°С, постоянной скорости перфузии раствора Кребса со скоростью 0,7 мл/мин, пассивной аэрации рабочей камеры и исходной нагрузке полосок, равной 500 мг (4,9 мН). «Миоцитограф» включал самопишущие приборы Н-3020, механотроны 6МХ1Б, измеритель-регулятор температуры ТРМ1А «Овен» и шприцевые дозаторы (российского производства). Во всех сериях началу опытов предшествовал 30-минутный период адаптации полосок, т. е. перфузия раствором Кребса до установления стабильной спонтанной СА. Результаты тестирований полосок оценивали по механограммам. Суммарную СА выражали в мН/10 мин или в процентах к исходному фону, а величину КС1-контрактуры — в миллиньютонах или в процентах к исходной величине.
В качестве источника ЭСБАР использовали 100-кратное разведение сыворотки венозной крови 35 небеременных женщин. Ее забор проводили на станции переливания крови. Сыворотку получали путем центрифугирования крови при 1000 об/мин в течение 20 мин и исследовали в течение 3-6 ч от момента ее забора. В качестве аналогов ЭС-БАР использовали гистидин (Япония), тирозин, триптофан (Бельгия), милдронат (Латвия) и предуктал (Польша). В работе применяли адреноблокаторы — обзидан, метопро-лолол (Германия), атенолол (Россия), ницерголин (Украина), а также лизофосфатидил-
холин (Украина), адреналина гидрохлорид (Россия) и ацетилхолина хлорид (Бельгия). Раствор Кребса (рН 7,4) содержал (мМ): №С1 — 136, КС1 — 4,7, СаС12 — 2,52, MgC12 — 1,2, КН2РО4 — 0,6, №НС03 — 4,7, С6Н12О6 — 11. ГРК дополнительно содержал 60 мМ КС1.
Результаты исследования подвергнуты статистической обработке; различия оценивали по критерию Стьюдента и считали их достоверными при р<0,05 [9].
результаты исследования
1. Способность сыворотки крови и аналогов ЭСБАР противодействовать влиянию в-адреноблокаторов на ингибирующий эффект адреналина (серии 1-15). С учетом того, что в-АР относятся к метаботропным рецепторам, все 15 серий опытов проводили на фоне тонуса, повышенного ГРК. Это позволило минимизировать изменения СА, неизбежно происходящие при длительной работе с изолированным миометрием крысы. При замене раствора Кребса на ГРК тоническая активность (КС1-контрактура) развивалась относительно быстро (рис. 1, 2). Она была устойчива на протяжении всего периода воздействия ГРК и многократно воспроизводилась. Адреналин (10-8-10-6 г/мл)
Рис. 1. Механограммы продольных полосок рога матки небеременных крыс, демонстрирующие в-адреноблокирующую способность обзидана (10-9, 10-8 г/мл; Обз 9, 8; панель а) и отсутствие у метопролола (10-9-10-6 г/мл; Мет 9-Мет 6; панель б) в-адреноблокирующего эффекта
Горизонтальные линии под механограммами отражают воздействия соответствующих веществ, в том числе адреналина (10-7 г/мл; Ад 7). Калибровка — 10 мН, 10 мин.
Рис. 2. Механограмма продольной полоски рога матки небеременной крысы, демонстрирующая в-адреносенсибилизирующую активность тирозина (10-4 г/мл; Тир 4), 100-кратного разведения сыворотки крови (Сыв 100), в том числе при их совместном воздействии, на фоне КС1-контрактуры
Горизонтальные линии означают момент воздействия веществ, включая адреналин (10-8 г/мл; Ад 8). Калибровка — 10 мН, 10 мин.
вызывал дозозависимое и обратимое снижение КС1-контрактуры. Так, в сериях 1-3 опыты проводились по схеме: РК -> ГРК -> ГРК + АД (соответственно в концентрации 10-8, 10-7 или 10-6 г/мл) -> РК, где адреналин дозозависимо и обратимо снижал контрактуру соответственно до 71,8 ± 4,7, 56,7 ± 6,3 и 52,1 ± 5,5% от ее исходной величины. Поэтому в последующих сериях опытов, проводимых на фоне КС1-контрактуры, адреналин использовали в концентрациях 10-8 или 10-7 г/мл, вызывающих выраженный, но не максимальный ингибирующий эффект. Это позволяло наблюдать в-адреномодули-рующее действие сыворотки крови и аналогов ЭСБАР.
При исследовании влияния адреноблокаторов (атенолола, метопролола и обзидана, 10-9-10-6 г/мл) на ингибирующий эффект адреналина в сериях 4-6, которые проводили по схеме: РК -> ГРК -> ГРК + АД, 10-7 г/мл -> ГРК + АД-7 + блокатор (его концентрация возрастала ступенчато с 10-9 до 10-6 г/мл) -> РК, установлено (см. рис. 1; табл. 1), что селективные в1-адреноблокаторы атенолол и метопролол не влияют на ингибирующий эффект адреналина, а неселективный в-адреноблокатор обзидан (10-9-10-6 г/мл) дозозависимо снижает его. Частичную блокаду эффекта адреналина обзидан вызывал в концентрации 10-9 г/мл, а полную блокаду — в концентрации 10-7 г/мл (см. табл. 1; 2). В целом результаты опытов серий 4-6 указывают на то, что релаксирующий эффект адреналина реализуется за счет активации лишь в2-АР, которые, как известно [2], доминируют в миоцитах продольного слоя рога матки небеременных крыс. Поэтому в сериях 7-15, в которых оценивали способность ЭСБАР и его аналогов противодействовать в-адреноблокатору, использовали обзидан.
Исследование влияния 100-кратного разведения сыворотки крови небеременных женщин (как источника ЭСБАР) на в-адреноблокирующее действие обзидана (серия 7, п=10) проводили по схеме: РК -> ГРК -> ГРК + Ад-7 -> ГРК + Ад-7 + Сыв -> РК -> ГРК -> ГРК + Ад-7 -> ГРК + Ад-7 + обзидан (10-9 г/мл, Обз-9) -> те же воздействия + Сыв -> РК -> ГРК + Ад-7 + Обз-8 + Сыв -> ГРК + Ад-7 + Обз-7 + Сыв -> ГРК + Ад-7 + Обз-6 + Сыв -> РК. Установлено, что исходно, как и в опытах других исследователей [2], сыворотка крови не влияла на тоническую активность полосок, но проявляла в-адреносенсибили-зирующую активность, т. е. усиливала ингибирующее действие адреналина. Так, если первоначально адреналин снижал КС1-контрактуру до 82,7 ± 6,8% от исходного уровня, то на фоне сыворотки крови (1:100) он снижал ее до 35,6 ± 5,5%, т. е. проявлял достоверно (р<0,05) более выраженное ингибирующее влияние, чем при первом тестировании. В этих условиях обзидан в концентрациях 10-9 г/мл не влиял на ингибирующий эффект адреналина, а в концентрациях 10-8, 10-7 и 10-6 г/мл дозозависимо снижал его: КС1-контрактура восстанавливалась соответственно до 57,4 ± 4,7, 68,6 ± 9,4 и 87,2 ± 9,0% от исходного уровня. Таким образом, на фоне сыворотки крови концентрации обзи-дана, частично или полностью блокирующие эффект адреналина, составили соответственно 10-8 и 10-6 г/мл, что в 10 раз превышает исходные значения (см. табл. 2). Это означает, что сыворотка крови противодействует влиянию в-адреноблокатора на ингибирующий эффект адреналина. Скорее всего, это связано с наличием в ней ЭСБАР. Об этом свидетельствуют и результаты опытов с аналогами ЭСБАР (серии 8-15). Их проводили по измененной схеме (табл. 3): РК -> ГРК -> ГРК + Ад 7 -> ГРК + Ад 7 + аналог ЭСБАР (в одной из концентраций) -> эти же компоненты + обзидан в возрастающих концентрациях от 10-9 до 10-6 г/мл. Результаты экспериментов показали, что подобно сыворотке крови исходно аналоги ЭСБАР проявляют в-адреносенсибилизирующую активность на фоне КС1-контрактуры, а при наличии в среде обзидана они снижают
его способность блокировать ингибирующее действие адреналина (см. табл. 2 и 3), о чем свидетельствует 10- и 1000-кратный рост пороговых концентраций обзидана, частично или полностью снимающие ингибирующий эффект адреналина. Так, в серии 11 адреналин (10-7 г/мл) первоначально снижал КС1-контрактуру до 89,9% от ее исходного уровня, на фоне триптофана (10-4 г/мл) — до 65,3%, а на фоне триптофана и обзидана в концентрациях 10-9, 10-8, 10-7 и 10-6 г/мл — соответственно до 72,3, 81,5, 85,5 и 88,6% (см. табл. 3). Эти данные показывают, что триптофан повышает пороговые концентрации обзидана, частично или полностью блокирующие эффект адреналина соответственно в 10 и в 100 раз.
Таблица 1. Величина тонуса (М ± т), вызванного гиперкалиевым (60 мМ КС1) раствором Кребса, у продольных полосок рога матки небеременных крыс на различных этапах эксперимента с адреналином (10-7 г/мл; Ад) и блокаторами — атенололом, метопрололом и обзиданом (10-9-10-6 г/мл)
Единицы измерения тонуса Этапы эксперимента
1-й 2-й 3-й 4-й 5-й 6-й
КС1 КС1 + Ад КС1 + Ад + блокатор, 10-9 КС1 + Ад + блокатор, 10-8 КС1 + Ад + блокатор, 10-7 КС1 + Ад + блокатор, 10-6
Серия 4-я — атенолол (п=10)
мН 13,9 ± 0,7 8,5 ± 0,7 1 8,7 ± 0,8 1 9,4 ± 0,7 1 9,8 ± 0,8 1 9,8 ± 0,7 1
% 100 60,8 ± 4,6 1 63,7 ± 4,4 1 67,3 ± 3,8 1 70,4 ± 4,2 1 71,2 ± 5,3 1
Серия 5-я — метопролол (п=12)
мН 12,5 ± 1,1 7,0 ± 0,9 1 7,1 ± 0,9 1 8,0 ± 1,0 1 8,3 ± 1,0 1 8,6 ± 1,0 1
% 100 55,2 ± 4,8 1 55,4 ± 4,6 1 63,0 ± 5,8 1 65,3 ± 4,8 1 68,5 ± 5,9 1
Серия 6-я — обзидан (п=10)
мН 13,4 ± 1,4 7,2 ± 0,9 1 9,6 ± 1,3 1 10,9 ± 1,5 2 13,0 ± 1,5 2,3 12,8 ± 1,6 2,3
% 100 54,1 ± 4,5 1 70,5 ± 4,7 1Д 79,8 ± 5,3 1Д 96,8 ± 1,9 234 100,4 ± 1,7 2,3,4
Примечание. 14 — различие с соответствующим этапом достоверно (р<0,05).
Таблица 2. Концентрации обзидана, которые в опытах с продольными полосками рога матки небеременных крыс частично или полностью снимают релаксирующий эффект адреналина (10-7 г/мл) в отсутствии (контроль) и на фоне Р-адреносенсибилизатора
р-адреносенсибилизатор, г/мл Число опытов Концентрация обзидана, снимающая эффект адреналина, г/мл
частично полностью
Контроль 10 10-9 10-7
Сыворотка, 1:100 10 10-8 10-6
Гистидин, 10-5 5 10-7 10-7
Гистидин, 10-4 8 10-7 10-7
Триптофан, 10-5 5 10-6 10-6
Триптофан, 10-4 11 10-8 > 10-6
Тирозин, 10-5 5 10-8 10-8
Тирозин, 10-4 9 10-7 10-7
Милдронат, 10-6 11 10-7 10-6
Предуктал, 10-6 12 10-9 > 10-6
Таблица 3. Величина тонуса (М ± т; в мН и в % к 1-му этапу), вызванного гиперкалиевым (60 мМ КС1) раствором Кребса, у продольных полосок рога матки небеременных крыс на различных этапах эксперимента с адреналином (10-7 г/мл), аминокислотами (10-5 и 10-4 г/мл), милдронатом и предукталом (10-6 г/мл) и обзиданом (10-9-10-6 г/мл)
Единицы измерения тонуса Этапы эксперимента
1-й 2-й 3-й 4-й 5-й 6-й 7-й
КС1 КС1 + адреналин КС1 + адреналин + вещество КС1 + адреналин + вещество
обзидан, 10-9 г/мл обзидан, 10-8 г/мл обзидан, 10-7 г/мл обзидан, 10-6 г/мл
Серия 8-я — гистидин, 10 5 г/мл (п=5)
мН 12,9 ± 2,2 12,4 ± 2,2 10,3 ± 1,6 11,5 ± 1,7 12,3 ± 1,9 12,7 ± 2,1 12,4 ± 2,1
% 100 94,7 ± 1,7 1 81,6 ± 6,5 1 89,7 ± 3,3 1 95,9 ± 2,5 98,6 ± 1,1 34 96,0 ± 0,7 1
Серия 9-я — гистидин, 10 4 г/мл (п=8)
мН 15,7 ± 1,4 14,5 ± 1,3 11,7 ± 1,5 13,1 ± 1,4 14,1 ± 1,2 14,8 ± 1,3 14,7 ± 1,3
% 100 92,7 ± 1,4 1 74,6 ± 7,1 ‘,2 85,1 ± 6,3 1 91,9 ± 5,7 96,2 ± 6,4 3 96,0 ± 6,8 3
Серия 10-я — триптофан, 10-5 г/мл (п=5)
мН 15,5 ± 1,5 12,9 ± 1,6 12,1 ± 1,5 11,7 ± 1,5 12,6 ± 1,4 13,9 ± 1,3 14,7 ± 1,3
% 100 82,5 ± 2,7 1 77,2 ± 4,0 1 75,2 ± 4,7 1 81,9 ± 4,6 1 90,5 ± 4,7 95,7 ± 5,0 2,3,4
Серия 11-я — триптофан, 10-4 г/мл (п=11)
мН 15,5 ± 0,9 13,8 ± 0,7 9,9 ± 0,7 ‘,2 10,9 ± 0,5 1Д 12,4 ± 0,5 и,4 13,1 ± 0,6 и,4 13,5 ± 0,6 3,4
% 100 89,9 ± 1,8 1 65,3 ± 4,1 и 72,3 ± 4,0 ‘,2 81,5 ± 2,9 ^ 85,5 ± 2,8 ^ 88,6 ± 3,1 ^
Серия 12-я — тирозин, 10-5 г/мл (п=5)
мН 11,8 ± 1,3 11,3 ± 1,3 9,7 ± 1,3 10,3 ± 1,2 11,5 ± 1,5 11,9 ± 1,5 12,0 ± 1,5
% 100 95,5 ± 1,6 1 81,7 ± 3,8 ‘,2 87,5 ± 4,3 1 97,2 ± 2,9 3 100,3 ± 3 3,4 101,5 ± 2,5 3,4
Серия 13-я — тирозин, 10 4 г/мл (п=9)
мН 16,0 ± 1,9 14,4 ± 1,7 11,3 ± 1,9 11,3 ± 2,0 12,8 ± 1,6 14,2 ± 1,6 14,4 ± 1,5
% 100 90,1 ± 2,7 1 68,6 ± 5,9 12 69,6 ± 9,0 12 81,6 ± 5,2 1 91,0 ± 4,6 3 93,4 ± 5,4 3,4
Серия 14-я — милдронат, 10 6 г/мл (п=11)
мН 13,8 ± 1,2 7,2 ± 1,2 1 6,3 ± 1,2 1 6,6 ± 1,2 1 7,8 ± 1,4 1 12,2 ± 1,4 2,3,4,5 13,1 ± 1,4 2,3А5
Серия 15-я — предуктал, 10-6 г/мл (п=12)
мН 15,7 ± 1,7 10,9 ± 1,7 9,1 ± 1,4 1 10,8 ± 1,1 1 12,3 ± 1,1 14,9 ± 1,3 3,4 15,0 ± 2,33
% 100 65,3 ± 4,9 1 54,0 ± 4,2 1 73,7 ± 6,7 13 83,7 ± 6,2 ^ 83,0 ± 2,3 и,3 84,6 ± 5,6 ^
Примечание. 1-5 — различие с соответствующим этапом достоверно.
Как известно, классические в-адреноблокаторы оказывают свое действие за счет того, что в силу более высокого сродства к адренорецепторам, они конкурентно связываются с в-АР и тем самым препятствуют активации этих рецепторов агонистами [10]. Способность ЭСБАР и его аналогов препятствовать действию обзидана подтверждает предположение о том, что один из механизмов их действия связан с повышением сродства в-АР к агонисту. Результаты опытов серий 7-15 также дают возможность считать, что ЭСБАР при достаточно высокой его концентрации в крови, которая, как показано в работе [2], зависит от возраста, пола (у женщин — от фазы репродуктивного процесса) и наличия патологии, может существенно ослабить действие в-адреноблокаторов, используемых с лечебной целью. Подобный эффект способны вызвать и аналоги ЭСБАР, поступающие в организм с пищей (гистидин, триптофан, тирозин) или в виде лекарственных средств (милдронат, предуктал). Таким образом, результаты наших исследований впервые показывают, что клиническая эффективность адреноблокаторов может зависеть от содержания в крови ЭСБАР и его аналогов.
2. Способность аналогов ЭСБАР проявлять в-адреносенсибилизирующую активность в присутствии 100-кратного разведения сыворотки крови как источника ЭСБАР (серии 16-20). Эксперименты по исследованию совместного действия 100-кратного разведения сыворотки крови небеременных женщин с одним из аналогов ЭСБАР проводили на фоне КС1-контрактуры по схеме: КР -> ГРК -> ГРК + Ад-8 -> ГРК + Ад-8 + Аналог -> РК -> ГРК -> ГРК + Ад-8 -> ГРК + Ад-8 + Сыв, 1:100 -> РК -> ГРК -> ГРК + Ад-8 -> ГРК + Ад-8 + Аналог + Сыв -> РК (см. рис. 2; табл. 4). В этих опытах исходно адреналин снижал КС1-контрактуру до 71,8-86,6% от ее исходного уровня. На фоне сыворотки крови (1:100) или на фоне аналога ЭСБАР — гистидина, триптофана, тирозина (все — 10-4 г/мл), милдроната и предуктала (оба — 10-6 г/мл) его ингибирующий эффект, как правило, достоверно возрастал. Это означает, что сыворотка крови и каждый из аналогов ЭСБАР проявляют в-адреносенсибилизирующую активность. При действии адреналина на фоне сыворотки крови (1:100) и аналога ЭСБАР ингибирующий эффект адреналина также был достоверно выше, чем при первом тестировании или при воздействии адреналина совместно с сывороткой крови, но не выше, чем при воздействии адреналина совместно с аналогом ЭСБАР. Так, в серии 18 исходно адреналин снижал КС1-контрактуру до 86,5% от ее первоначальной величины, а на фоне триптофана — до 69,7%, т. е. достоверно (р<0,05) больше; аналогично — до и на фоне сыворотки адреналин снижал КС1-контрактуру соответственно до 92,9 и 84,2% (р<0,05), а до и на фоне триптофана и сыворотки — соответственно до 92,3 и 74,6% (р<0,05).
В целом результаты серий 16-20 указывают на то, что сыворотка крови, независимо от наличия в ней ЭСБАР (в опытах с гистидином его содержание в сыворотке крови
Таблица 4. Величина тонуса (М ± т), вызванного гиперкалиевым (60 мМ КС1) раствором Кребса, у продольных полосок рога матки небеременных крыс на различных этапах эксперимента с адреналином (10-8 г/мл; Ад), экзогенными сенсибилизаторами (С) — аминокислотами (10-4 г/мл), милдронатом и предукталом (10-6 г/мл), а также 100-кратным разведением сыворотки крови (Сыв)
Единицы измерения Этапы эксперимента
1-й 2-й 3-й 4-й 5-й 6-й 7-й 8-й 9-й
КС1 КС1 + Ад КС1 + Ад + С КС1 КС1 + Ад КС1 + Ад + Сыв КС1 КС1 + Ад КС1 + Ад + Сыв + С
Серия № 16 — гистидин, 10 4 г/мл (п = 12)
мН 16,4±0,9 13,2±0,7 1 6,4±1,0 и 18,7±0,9 17,3±1,0 16,0± 1,2 18,5±1,2 17,1 ± 1,2 9,6±1,4 78
% 100 81,6±4,0 1 39,2±6,1 ‘,2 100 92,8±3,0 4 85,0±4,4 4 100 93,0±2,2 7 53,5±7,1 78
Серия № 17 — тирозин, 10 4 г/мл (п = 11)
мН 13,6±1,3 11,3±1,6 6,3±1,2 ‘,2 15,5±1,2 13,7± 1,3 11,0±1,2 4 14,1 ±1,7 11,7±1,7 8,8±1,3 7
% 100 78,2±7,4 1 43,9±6,7 ',2 100 86,6±4,2 4 68,3±5,1 4,5 100 79,5±5,9 7 58,7±7,3 7,8
Серия № 18 — триптофан, 10 4 г/мл (п = 9)
мН 13,9± 1,7 12,1 ± 1,5 9,8 ± 1,3 13,6±2,1 12,6± 1,9 11,5±1,8 13,5±1,9 12,4±1,7 9,8 ±1,2
% 100 86,5±2,3 1 69,7±4,0 [,2 100 92,9±0,8 4 84,2±2,4 4,5 100 92,3±0,8 7 74,6±3,3 78
Серия № 19 — милдронат, 10 6 г/мл (п = 11)
мН 10,9±1,6 8,2± 1,6 6,4±1,6 9,4±1,8 8,2±1,9 6,1±1,4 9,8 ± 1,6 8,4±1,7 6,8±1,6
% 100 71,8±4,7 1 52,4±7,0 [,2 100 80,7±5,3 4 59,0±4,5 4,5 100 80,5±4,1 7 61,9±4,9 78
Серия № 20 — предуктал, 10 5 г/мл (п = 10)
мН 10,7± 1,0 8,2±0,8 5,8±0,9 1 9,9±0,8 8,3±0,6 6,3±0,4 4,5 10,8± 1,3 9,9±1,2 6,9±0,9 7
% 100 76,4±2,3 1 53,0±5,3 1Д 100 85,1±2,4 4 64,7±2,6 4,5 100 90,9±0,8 7 64,0±2,1 7,8
Примечание. 1 8 — различие с соответствующим этапом достоверно.
оказалось невысоким), не препятствует в-адреносенсибилизирующему эффекту аналогов ЭСБАР. В то же время не удалось наблюдать взаимного потенцирования эффектов ЭСБАР и его экзогенных аналогов. Это означает, что механизм в-адреносенсибилизи-рующей активности сыворотки крови такой же, как и у аналогов ЭСБАР. Есть все основания утверждать, что аналоги ЭСБАР можно использовать для изучения механизма действия ЭСБАР. Очевидно также, что при внутривенном введении аналогов ЭСБАР, например, с целью повышения эффективности активации в-АР при лечении бронхиальной астмы или угрозы преждевременных родов, кровь не будет препятствовать проявлению их в-адреносенсибилизирующей активности.
3. Способность гистидина противодействовать десенситизации,развивающейся при многократных кратковременных (по 10мин) воздействиях адреналина (серия 21). Опыты проводили на спонтанно активных полосках миометрия, на которых, как известно [2, 5], десенситизация проявляется достаточно ярко. Их вели по схеме: РК -> Ад-7 -> РК -> Ад-7 -> РК -> Ад-7 -> Ад-7 + Гис-6 -> РК -> Ад-7 + Гис-6 -> РК -> Ад-7 + Гис-6 -> РК (и=10). Было показано (рис. 3, панель а), что в условиях перфузии раствором Кребса полоски генерируют фазные сокращения. Их суммарная СА, т. е. сумма амплитуд, составила 73,2 ± 3,4 мН/10 мин. Адреналин (10-7 г/мл) при первом тестировании обратимо угнетал ее до 15,1 ± 0,9 мН/10 мин или до 20,6% от исходной величины. Однако уже при втором тестировании адреналин оказывал более слабое угнетение спонтанной СА — с 62,0 ± 3,5 до 49,5 ± 4,1 мН/10 мин, т. е. всего лишь до 80% от исходного уровня, что говорит о выраженной десенситизации. Аналогичная ситуация повторилась при третьем тестировании — адреналин снижал суммарную СА с 53,8 ± 3,6 до 42,1 ± 2,0 мН/10 мин, т. е. до 78%. Гистидин (10-6 г/мл) сам по себе не изменял суммарную СА полосок, но
Ад 8 Гис 6
ЛФХ4 Дд з Гис 6
Ад 8 Гис 6
Ад 8 Ад 8 Гис 6 Гис 4
Рис. 3. Механограмма продольной полоски рога матки небеременной крысы, демонстрирующая способность гистидина (10-6 г/мл, Гис 6) препятствовать десенситизации, вызванной адреналином (10-7 г/мл, Ад 7) — панель а, и механограмма продольной полоски рога матки небеременных крыс, демонстрирующая способность лизофосфатидилхолина (10-4 г/мл; ЛФХ 4) оказывать в-адре-ноблокирующее действие на фоне адреналина (10-8 г/мл; Ад 8) и гистидина (10-6, 10-4 г/мл; Гис 6, 4) — панель б
Горизонтальные линии означают момент воздействия веществ. Калибровка — 10 мН, 10 мин (то же для рис. 4, 5).
достоверно повышал способность адреналина ингибировать суммарную СА — на его фоне адреналин снижал суммарную СА с 40,5 ± 3,3 до 2,0 ± 0,3 мН/10 мин, т. е. до 5% от исходного уровня. При последующих двух тестированиях совместно с гистидином адреналин продолжал оказывать выраженный ингибирующий эффект — суммарная СА снижалась соответственно с 53,5 ± 3,3 до 4,8 ± 0,9 мН/10 мин, т. е. до 9% и с 51,7 ± 2,8 до
8,8 ± 0,8 мН/10 мин, т. е. до 17%. Таким образом, нами установлено, что гистидин даже в невысокой концентрации (10-6 г/мл) снимает развившуюся под влиянием периодических воздействий адреналина десенситизацию в-АР и препятствует ее дальнейшему развитию, т. е. продлевает действие адреналина как ингибитора СА. Наши результаты согласуются с данными Т. В. Тумановой и соавторов [7] о способности гистидина восстанавливать эффективность активации в-АР миометрия крысы, сниженную в результате 30-минутного непрерывного воздействия адреналина. Как известно, десенситиза-ция в-АР является результатом фосфорилирования в-АР под влиянием киназы в-АР и/или протеинкиназы А, которым противодействует фосфатаза [2]. Результаты наших исследований позволяют считать, что гистидин восстанавливает нативную структуру в-АР, т. е. способствует его дефосфорилированию. Не исключено, что это связано с повышением активности фосфатазы под влиянием гистидина. Вероятно, подобный механизм действия характерен для ЭСБАР и других его аналогов. Полагаем, что способность ЭСБАР и его аналогов противодействовать развитию десенситизации и пролонгировать действие катехоламинов должна найти широкое клиническое применение, так как введение пациентам в-адреномиметиков, как правило, сопровождается развитием выраженной десенситизации.
4. Способность гистидина модулировать сократительные эффекты адреналина и ацетилхолина на фоне ЛФХ и куриного яичного желтка как источника ЛФХ (серии 22-30). Опыты с адреналином были выполнены на спонтанно активных полосках миометрия (серия 22) и на полосках в условиях их КС1-контрактуры (серии 23 и 24). Серию 22 (и=10), в которой исследовали влияния ЛФХ на эффекты адреналина, проводили по схеме: РК -> АД-8 -> РК -> АД-8 + Гис-6 -> РК -> ЛФХ-4 -> ЛФХ-4 + АД-8 + Гис-6 -> РК -> АД-8 + Гис-6 -> РК -> АД-8 + Гис-4 -> РК (рис. 3, панель б). Применение гистидина на первых этапах опытов данной серии было связано с необходимостью снизить скорость десенситизации в-АР, возникающей при периодических воздействиях адреналина. В этих опытах исходно адреналин (10-8 г/мл) снижал суммарную СА с 69,3 ± 3,1 до 34,4 ±
2.4 мН/10 мин, т. е. до 50% от исходного уровня. На фоне гистидина (10-6 г/мл) он снижал ее намного сильнее — с 66,2 ± 3,2 до 10,5 ± 0,9 мН/10 мин, т. е. до 16%. Сам по себе ЛФХ (10-4 г/мл) не влиял на суммарную СА — исходно она составляла 71,3 ± 3,2 мН/10 мин, а на фоне ЛФХ — 74,8 ± 2,8 мН/10 мин или 105%. На фоне ЛФХ и гистидина адреналин первоначально сохранял способность ингибировать СА — он снижал суммарную СА с 74,8 ± 2,8 до 16,5 ± 1,5 мН/10 мин, т. е. до 22% от исходного уровня. Однако при двух последующих тестированиях, которые проводились после удаления ЛФХ, адреналин, несмотря на присутствие гистидина (10-6 г/мл), снижал суммарную СА на значительно меньшую величину — с 89,5 ± 3,7 до 44,2 ± 3,5 мН, т. е. до 49%, и с 88,5 ± 4,6 до 44,9 ±
2.4 мН, т. е. до 51%. Повышение в среде концентрации гистидина до 10-4 г/мл лишь в части опытов приводило к росту ингибирующего эффекта адреналина (рис. 3, панель б), хотя в среднем и в этих условиях адреналин снижал суммарную СА в меньшей степени — с 98,2 ± 6,5 до 46,1 ± 10,1 мН/10 мин, т. е. до 47%. Все это говорит о том, что ЛФХ проявляет в-адреноблокирующий эффект, но с большим латентным периодом. Этот
эффект ЛФХ сохраняется 20-40 мин. Гистидин восстанавливает способность адреналина ингибировать спонтанную СА, но для этого он должен быть использован в высоких концентрациях и его эффект наблюдается не в 100% опытов.
Наши результаты частично подтверждают данные Ю. А. Пенкиной и соавторов [3], согласно которым ЛФХ (10-5 г/мл) блокирует в-АР кардиомиоцитов лягушки и крысы, а гистидин (10-4 г/мл) снимает эту блокаду. По мнению этих авторов, в-адреноблокирую-щий эффект ЛФХ обусловлен изменением конформации О-белка и других посредников передачи сигнала, а гистидин восстанавливает их нативную конформацию и тем самым восстанавливает эффективность передачи сигнала от рецептора внутрь клетки. Ранее было показано [11, 12], что ЛФХ может снижать эффективность активации М-холино-рецепторов (М-ХР). Н. В. Проказовой и соавторами [11] это объяснялось способностью ЛФХ активировать протеинкиназу С, в результате чего происходит фосфорилирование М-ХР. Мы полагаем, что в основе в-адреноблокирующего действия ЛФХ лежат оба указанных механизма, т. е. фосфорилирование в-АР под влиянием активированной ЛФХ протеинкиназы А и изменение конформации О-белка и других посредников, а гистидин дефосфорилирует в-АР (активируя фосфатазу) и восстанавливает конформации участников передачи сигнала; тем самым он восстанавливает эффективность активации в-АР.
С учетом важности данных о способности ЛФХ как естественного компонента клетки снижать эффективность передачи сигнала от в-АР внутрь клетки, мы считали возможным получить дополнительное доказательство этому в опытах, в которых в качестве источника ЛФХ использовали куриный яичный желток (ЯЖ) в разведении 1:100 (серия 23) и 1:50 (серия 24). Ранее было показано, что ЯЖ в разведении 1:500, 1:100 и 1:50 за счет наличия в нем ЛФХ блокирует М-ХР гладких мышц трахеи коровы [13] и желудка крысы [12]. Кроме того, в этих опытах мы поставили задачу проверить способность ЛФХ (в составе ЯЖ) блокировать в-АР в условиях деполяризации. Поэтому опыты в сериях 23 и 24 вели по схеме: РК -> ГРК -> ГРК + АД-7 -> РК -> ГРК -> ГРК + ЯЖ -> ГРК + ЯЖ + АД-7 -> КР -> ГРК -> ГРК + АД-7 -> РК -> ГРК -> ГРК + ЯЖ -> ГРК + ЯЖ + АД-7 -> ГРК + ЯЖ + АД-7 + Гис-5 -> РК. Было установлено, что ЯЖ в разведении 1:100 (серия 23, п=5) не влиял на ингибирующее действие адреналина, а в разведении 1:50 (серия 24, п=9) проявлял в-адреноблокирующую активность. В частности, в серии 24 адреналин (10-7 г/мл) при первом тестировании снижал КС1-контрактуру до 70,2 ± 6,3% от исходного уровня, а ЯЖ не влиял на нее (на фоне ЯЖ ее амплитуда составила 113,3 ± 7,9% от исходного уровня). На фоне ЯЖ адреналин снижал контрактуру лишь до 85,9 ± 4,1% от ее исходной величины (р2-1>0,05), что в определенной степени ниже, чем при первом тестировании. При третьем тестировании, т. е. на фоне ЯЖ и гистидина (10-5 г/мл) адреналин снижал КС1-контрактуру до 60,2 ± 5,4% (р3-2<0,05). Это говорит о том, что гистидин достоверно повысил ингибирующий эффект адреналина, сниженный ЯЖ.
Таким образом, результаты опытов серии 24 подтверждают вывод о том, что ЛФХ (в том числе в составе ЯЖ), снижает эффективность активации в-АР, а гистидин восстанавливает ее. Мы не исключаем, что подобно гистидину, такой же эффект будут оказывать триптофан, тирозин, предуктал и милдронат, а также ЭСБАР.
Исследование способности гистидина модулировать эффекты ацетилхолина в условиях воздействия ЛФХ и ЯЖ (серии 25-30) выполнено на спонтанно активных полосках миометрия. Эти опыты были проведены с целью оценки специфичности действия ЛФХ и гистидина. Для этого оценивали влияние ЛФХ на эффективность активации
М-ХР миометрия крысы и способность гистидина модулировать подобное влияние. Серию 25, в которой изучали эффект ЛФХ в концентрации 10-6 г/мл, вели по схеме: РК -> АХ-6 -> РК -> ЛФХ -> ЛФХ + АХ-6 -> РК -> АХ-6 -> РК. По такой же схеме вели опыты с ЛФХ в концентрациях 10-5 и 10-4 г/мл (серии 26, 27) и с ЯЖ в разведениях 1:100 (серия 28) и 1:50 (серии 29). Во всех этих сериях АХ вызывал типичный обратимый стимулирующий эффект, а ЛФХ и ЯЖ, как и в сериях 22-24, сами по себе не влияли на суммарную СА полосок (рис. 4). В этих опытах ЛФХ (10-6-10-4 г/мл) и ЯЖ в разведении 1:100 не оказывали достоверного влияния на стимулирующий эффект АХ (рис. 4, а), а ЯЖ в разведении 1:50 снижал этот эффект в момент воздействия (серия 29), т. е. проявлял М-холинобло-кирующую активность. Так, в серии 29 (и=9) при первом тестировании АХ (10-6 г/мл) повышал суммарную СА до 105,1 ± 13,9 мН/10 мин, а при втором тестировании, т. е. на фоне ЯЖ повышал ее лишь до 78,7 ± 5,1 мН/10 мин, что составляет 81,7 ± 7,1% от величины, наблюдаемой при первом тестировании АХ (р2-1<0,05). Это говорит о достоверном снижении стимулирующего эффекта АХ. После удаления ЯЖ способность АХ оказывать стимулирующий эффект восстанавливалась — при третьем тестировании он повышал суммарную СА до 97,0 ± 11,9 мН/10 мин, или до 100,3 ± 8,2%, т. е. так же, как и при первом тестировании.
АХ 6 ЯЖ 50 АХ 6
АХ 6
Рис. 4. Механограммы продольных полосок рога матки небеременных крыс, демонстрирующие влияние лизофосфатидилхолина (10-4 г/мл; ЛФХ 4) на эффект ацетилхолина (10-6 г/мл; АХ 6) — панель а, и М-холиноблокирую-щую способность куриного яичного желтка (1:50; ЯЖ 50) — панель б
В серии 30 (и=10) было исследовано влияние гистидина (10-4 г/мл) на М-холиноблоки-рующее действие ЯЖ в разведении 1:50. Опыты проводили по аналогичной схеме, но с добавлением этапа с гистидином, т. е. РК -> АХ-6 -> РК -> ЯЖ -> ЯЖ + АХ-6 -> РК -> АХ-6 -> РК -> АХ + Г ис-4 -> РК. В этой серии ЯЖ снижал стимулирующий эффект АХ не в момент воздействия ЯЖ, как отмечено в серии 29, а после удаления ЯЖ. При этом гистидин не восстанавливал способность АХ повышать СА миометрия. Действительно, при первом тестировании АХ (10-6 г/мл) повышал суммарную СА до 184,1 ± 35,7 мН/10 мин, на фоне
ЯЖ — до 155,7 ± 21,9 мН/10 мин, что составляет 90,7 ± 10,7% от первого тестирования АХ (р2-1>0,05), а при третьем тестировании, т. е. после удаления ЯЖ он повышал суммарную СА до 132,8 ± 31,1 мН/10 мин, или до 71,4 ± 9,5% (р3-2<0,05), что достоверно слабее. При четвертом тестировании, проводимом совместно с гистидином (10-4 г/мл), АХ повышал суммарную СА лишь до 135,0 ± 22,2 мН/10 мин или до 82,2 ± 19,6% (р4-1,2,3>0,1) от первого тестирования ацетилхолином.
В целом результаты серий 28-30 указывают на то, что ЛФХ, содержащийся в яичном желтке, снижает эффективность передачи сигнала от М-ХР внутрь клетки, но намного слабее, чем в отношении передачи сигнала от в-АР, т. е. М-холиноблокирующее влияние ЛФХ и ЯЖ слабее, чем их в-адреноблокирующее. Это означает, что способность ЛФХ снижать эффективность передачи сигнала от рецепторов, ассоциированных с О-бел-ком, зависит от вида рецепторов. Мы также не исключаем, что эта способность зависит и от вида клеток, так как согласно данным литературы, ЛФХ блокирует М-ХР миоцитов желудка крысы [12] и М-ХР кардиомиоцитов сердца лягушки [11] и крысы [14].
5. Способность гистидина модулировать влияние адреналина на сократительную реакцию миоцитов в ответ на замену раствора Кребса дистиллированной водой (серии 31-40). Известно, что миоциты матки крысы содержат аквапорины, в том числе AQ1, AQ2, AQ3, AQ4, AQ5, AQ8 и AQ9 [15-17]. При этом показано, что на процессы встраивания аквапоринов из цитоплазмы в поверхностную мембрану может влиять не только антидиуретический гормон, но и другие гормоны и медиаторы, в том числе ацетилхолин [18] и адреналин [18, 19]. Постановка эксперимента данного раздела работы (серии 31-40) базировалась на рабочей гипотезе, согласно которой замещение обычного раствора Кребса дистиллированной водой (ДВ) должно сопровождаться входом воды в миоциты через аквапорины. Вошедшая в миоциты вода, вследствие нарушения работы митохондрий, должна заблокировать работу Са2+-насосов клетки и тем самым временно повысить тонус миоцитов. Этому может также способствовать вход в миоциты ионов Са2+ из внеклеточных пространств и феномен «защелки», характерный, как известно [20], для гладких мышц. Очевидно, что если адреналин каким-либо образом влияет на состояние аквапоринов, активируя в-АР, то он должен изменить скорость нарастания тонуса, вызванного заменой раствора Кребса на ДВ. Очевидно также, что по мере вхождения воды в миоциты внутриклеточная концентрация ионов Са и других ионов должна снижаться и все это будет приводить к падению тонуса. Гистидин, в силу присущей ему ЭСБАР-активности, должен усилить эффект адреналина.
Результаты опытов серий 31, 35, 38-й, которые проводили на спонтанно активных полосках по схеме РК -> ДВ, показали, что замена раствора Кребса на ДВ сопровождается торможением генерации фазных сокращений и развитием тонуса, для которого характерно постепенное снижение (рис. 5; табл. 5).
В серии 32, проведенной по схеме: РК -> ДВ + АД-6, было показано (рис. 5, б; см. табл. 5), что при замене раствора Кребса на воду, содержащую адреналин (10-6 г/мл), полоски миометрия изменяли свою СА по такому же типу, как и в серии 31, но абсолютная и удельная скорости нарастания максимального напряжения в этом случае были достоверно (р<0,05) ниже, чем в серии 31 (1,0 против 3,6 мН/мин и 0,03 против
0,09 мН/мин/мг сырой массы). Это означает, что адреналин снижает скорость перехода воды в миоциты. Одним из объяснений этого явления может быть предположение, что адреналин способствует возвращению аквапоринов из поверхностной мембраны мио-цита в цитоплазму или тормозит встраивание аквапоринов в эту мембрану. Конечно,
Рис. 5. Механограммы продольных полосок рога матки небеременных крыс, демонстрирующие изменение их напряжения при замене раствора Кребса (Кр) на дистиллированную воду (ДВ), в том числе совместно с адреналином (10-7 г/мл; Ад-7) или адреналином (10-7 г/мл) и гистидином (10-4 г/мл; Гис 4)
Таблица 5. Параметры (М ± т), характеризующие изменение напряжения продольных полосок рога матки небеременных крыс при воздействии дистиллированной воды (ДВ), в том числе совместно с адреналином (10-7 и 106 г/мл; Ад 7, Ад 6), обзиданом (106 г/мл; Обз 6), ницерголином (106 г/мл; Ниц 6)
и гистидином (10-4 г/мл; Гис 4)
Параметры Серии
31 32 33 34 35 36 37
ДВ ДВ + Ад 6 ДВ + Ад 6 + Обз 6 ДВ + Ад 6 + Ниц 6 ДВ ДВ + Ад 7 ДВ + Ад 7 + Гис 4
Число полосок 9 10 13 8 10 10 10
Максимальное напряжение (Ршах), мН 11,7 ± 1,2 10,5 ± 1,8 9,6 ± 1,2 9,6 ± 1,0 13,8 ± 1,2 14,4 ± 1,2 14,0 ± 0,7
Время достижения Ртах, мин 3,4 ± 0,4 10,8 ± 1,1 31 4,4 ± 0,6 32 11,9 ± 2,5 31, 33 5,6 ± 1,0 7,8 ± 1,2 12,7 ± 1,6 35, 36
Скорость нарастания Ртах, мН/мин 3,6 ± 0,3 1,0 ± 0,2 31, 2,3 ± 0,2 31, 32 1,0 ± 0,2 31, 33 3,0 ± 0,4 2,5 ± 0,5 1,5 ± 0,3 36
Удельная скорость нарастания Ршах, мН/мин / мг массы 0,09 ± 0,02 0,03 ± 0,006 31, 0,07 ± 0,01 32 0,03 ± 0,005 31, 33 0,07 ± 0,01 0,07 ± 0,01 0,04 ± 0,01 35, 36
Примечание. 31-36 — различие с соответствующим этапом достоверно.
не исключается и иное объяснение этого феномена, например, активация адреналином энергообразования в митохондриях, подвергаемых гипоосмотическому стрессу.
В серии 33 опыты, проводимые по схеме: РК -> ДВ + Ад-6 + Обз-6, показали, что при замене раствора Кребса на воду, содержащую адреналин (10-6 г/мл) и обзидан (10-6 г/мл), полоски миометрия изменяли свою СА по такому же типу, как и в сериях 31, 35, 38, при этом скорость нарастания максимального напряжения в этом случае была такой же, как в серии 31. Следовательно, обзидан блокировал эффект адреналина. В аналогичной серии 34, проведенной по схеме РК -> ДВ + Ад 6 + НИЦ-6, было показано, что в этом случае
адреналин (10-6 г/мл), несмотря на наличие ницерголина (10-6 г/мл), продолжал оказывать тормозное влияние на развитие тонуса, как и в серии 32. Все это позволяет утверждать, что способность адреналина снижать скорость развития напряжения, вызванного заменой раствора Кребса на ДВ, реализуется за счет активации в-АР, причем, главным образом в2-АР, число которых, как известно [5], доминирует в миоцитах матки крысы.
На основании результатов опытов серий 31-34 была поставлена задача — оценить возможность гистидина повысить эффективность активации в-АР адреналином, следствием которого является замедление скорости развития напряжения в условиях водной нагрузки. С этой целью мы провели синхронно три серии опытов. Серию 35 вели по схеме РК -> ДВ; серию 36 — по схеме: РК -> ДВ + АД-7, а серию 37 по схеме РК -> ДВ+ АД-7 + гистидин, 10-4 гм/мл. Было установлено, что замена раствора Кребса на ДВ повышает напряжение миометрия (серия 36), при этом адреналин в концентрации 10-7 г/мл не вызывал достоверного снижения скорости развития напряжения (см. табл. 5), однако в присутствии гистидина (10-4 г/мл) адреналин в этой же концентрации (серия 37) вызывал достоверное снижение абсолютной и удельной скорости развития напряжения (см. рис. 5, в; табл. 5). Косвенно, эти данные означают, что гистидин повышает эффективность активации в-АР под влиянием адреналина, в результате которой замедляется процесс перехода воды внутрь миоцита. Таким образом, нами установлено, что гистидин как экзогенный сенсибилизатор в-АР может проявлять свое действие не только в опытах с интактным миометрием, но и в условиях воздействия на миометрий ДВ.
В сериях 38-40 было обнаружено, что адреналин в еще более низкой концентрации (10-8 г/мл) не снижает скорость развития напряжения, а гистидин (10-4 г/мл) в этих условиях не проявляет в-адреносенсибилизирующую активность. Действительно, этот показатель при действии ДВ (серия 38), ДВ и адреналина (серия 39) и ДВ, совместно с адреналином и гистидином (серия 40) составил соответственно 2,0 ± 0,3; 2,5 ± 0,4 и
2,8 ± 0,4 мН/мин (р38-39>40>0,1). Эти данные указывают на то, что способность адреналина уменьшать переход воды внутрь миоцита зависит от его концентрации в среде, а гистидин в этих условиях оказывает в-адреносенсибилизирующий эффект, но при использовании адреналина в концентрации, близкой к пороговой.
Таким образом, нами впервые установлено, что адреналин, активируя в2-АР, снижает скорость перехода воды из внеклеточной среды внутрь миоцитов (возможно, за счет торможения переноса аквапоринов из цитозоля в поверхностную мембрану мио-цитов), а гистидин (как аналог ЭСБАР) повышает эффективность активации в2-АР в этих условиях, т. е. он проявляет в-адреносенсибилизирующую активность независимо от конечного результата этой активации.
Заключение
1. Сыворотка крови человека в разведении 1:100 повышает эффективность активации в-АР миометрия крысы в условиях тонуса, повышенного гиперкалиевым (60 мМ) раствором Кребса, что доказывает наличие в крови ЭСБАР. Подобное действие проявляют его аналоги, в том числе гистидин, триптофан, тирозин, милдронат и предуктал.
2. Сыворотка крови не препятствует проявлению в-адреносенсибилизирующей активности аналогов ЭСБАР и не усиливает эту активность, что говорит об идентичности механизма действия ЭСБАР и его аналогов.
3. Сыворотка крови человека (как источник ЭСБАР) и аналоги ЭСБАР восстанавливают эффективность активации в2-АР, сниженную в2-адреноблокатором обзиданом (т. е. они являются антиадреноблокаторами).
4. Гистидин как аналог ЭСБАР восстанавливает эффективность активации в2-АР, сниженную десенситизацией этих рецепторов или воздействием лизофосфатидилхо-лина (ЛФХ).
5. Рост эффективности активации в-АР под влиянием ЭСБАР и их аналогов объясняется их способностью повышать сродство в-АР к агонисту, а также восстанавливать конформационное состояние в-АР (в том числе за счет усиления их дефосфорилиро-вания) и других участников передачи сигнала внутрь клетки, нарушенное в процессе естественного функционирования клетки или под влиянием повреждающих воздействий типа ЛФХ.
6. Перспективно применение аналогов ЭСБАР (как внеклеточных и внутриклеточных шаперонов) в клинической практике, особенно при состояниях, развивающихся вследствие дефицита активации в2-АР, например, при бронхиальной астме, а также при преждевременных родах или их угрозе.
* * *
Авторы выражают признательность за помощь в работе Н. В. Проказовой — кандидату химических наук, ведущему научному сотруднику, зав. отделом биохимии липидов Института экспериментальной кардиологии РКНПК (Москва).
Литература
1. Циркин В. И., Дворянский С. А., Ноздрачев А. Д. и др. Адреномодулирующие эффекты крови, ликвора, мочи, слюны и околоплодных вод человека // ДАН. 1997. Т. 352, № 1. С. 124-126.
2. Сизова Е. Н., Циркин В. И. Физиологическая характеристика эндогенных модуляторов в-адрено- и М-холинореактивности. Киров: ВСЭИ, 2006. 183 с.
3. Пенкина Ю. А., Ноздрачев А. Д., Циркин В. И. Влияние сыворотки крови человека, гистидина, триптофана, тирозина, милдроната и лизофосфатидилхолина на инотропный эффект адреналина в опытах с миокардом лягушки и крысы // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2008. Вып. 1. С. 55-68.
4. Циркин В. И., Кононова Т. Н., Сизова Е. Н. и др. Изменение в-адрено- и М-холиномодули-рующей активности сыворотки крови и мочи при бронхиальной астме // Физиология человека. 2008. Т. 34, № 3. С. 137-140.
5. Циркин В. И., Дворянский С. А. Сократительная деятельность матки (механизмы регуляции). Киров, 1997. 270 с.
6. Ноздрачев А. Д., Туманова Т. В., Дворянский С. А., Циркин В. И. и др. Активность ряда аминокислот как возможных сенсибилизаторов в-адренорецепторов гладкой мышцы // ДАН. 1998. Т. 363, № 1. С. 133-136.
7. Туманова Т. В., Сизова Е. Н., Циркин В. И. Способность Ь-гистидина снижать десенситиза-цию миометрия к адреналину // Бюл. экспер. биол. и медицины. 2004. Т. 138, №10. С. 364-367.
8. Киршенблат Я. Д. Практикум по эндокринологии. М.: Высшая школа, 1969. 256 с.
9. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 459 с.
10. Кукес В. Г., Сычев Д. А., Андреев Д. А. Клиническая фармакология в-адреноблокаторов // Рус. мед. журн. 2005. Т. 13, № 14. С. 932-938.
11. Проказова Н. В., Звездина Н. Д., Суслова И. В. и др. Влияние лизофосфатидилхолина на чувствительность сердца к ацетилхолину и параметры связывания хинуклидинилбензилата с мембранами миокарда // Рос. физиол. журн. 1998. Т. 84, № 10. С. 969-978.
12. Куншин А. А., Циркин В. И., Проказова Н. В. Влияние лизофосфатидилхолина, фосфати-дилхолина и куриного яичного желтка на сократительные эффекты ацетилхолина в опытах с гладкими мышцами желудка крысы // Бюл. экспер. биол. и медицины. 2007. Т. 143, № 6. С. 4-7.
13. Кононова Т. Н. Роль эндогенных в-адрено- и М-холиномодуляторов в регуляции деятельности систем организма человека: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Киров, 2004. 20 с.
14. Коротаева К. Н. Влияние лизофосфатидилхолина на эффективность активации М-холи-норецепторов изолированного миокарда крысы // Материалы I Всерос. науч. конф. «Молодежь и наука на сервере». Сыктывкар, 2008. Т. II. С. 226-228.
15. Jablonski E., McConnell п., Hughes F. Huet-Hudson Y. Estrogen regulation of aquaporins in the mouse uterus: potential roles in uterine water movement // J. Biol. Reprod. 2003. Vol. 69, N 5. Р. 14811487.
16. Richard C., Gao J., Brown п., Reese J. Aquaporin water channel genes are differentially expressed and regulated by ovarian steroids during the periimplantation period in the mouse // J. Endocrinology. 2003. Vol. 144, N 4. Р. 1533-1541.
17. Lindsay L., Murphy C. Redistribution of aquaporins 1 and 5 in the rat uterus is dependent on progesterone: a study with light and electron microscopy // J. Reproduction. 2006. Vol. 131, N 2. Р. 369378.
18. Inoue п., Iida H., Yuan Z., Ishikawa Y. et. al. Age-related decreases in the response of aquaporin-5 to acetylcholine in rat parotid glands // J. Dent. Res. 2003 Vol. 82, N 6. Р. 476-480.
19. Yasui H., Kubota M., iguchi k. et. al. Membrane trafficking of aquaporin 3 induced by epinephrine // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. Vol. 373, N 4. Р.613-617.
20. Циркин В. И., Трухина С. И. Физиологические основы психической деятельности и поведения человека. М.: Медицинская книга, 2001. 524 с.
Статья поступила в редакцию 14 октября 2010 г.
