CC BY
61
УДК 663.18:665.3
А. А. Шараева (асп.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.), Н. И. Петухова (к.биол. н., доц.), Л. И. Ниятшина (студ.)
Исследование липидообразования дрожжей при росте на глицеринсодержащей среде
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
A. A. Sharaeva, V. V. Zorin, N. I. Petukhova, L. I. Niyatshina
Research of synthesis of lipids by yeasts during growth on glycerol-containing medium
Ufa State Petrolium Technical Univercity 1, Kosmonavtov Str., 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e-mail: bio@rusoil.net
Исследован жирнокислотный состав и содержание липидов в клетках 29 дрожжевых культур, выращенных на среде с глицерином (3%). Найдены две олеогенные культуры (ДизУ-63 и ДизУ-43), накапливающие 53—55 % липидов, с низким содержанием ненасыщенных жирных кислот. Показано, что в липидах этих микроорганизмов в значительных количествах присутствуют стеариновая и пальмитиновая кислоты, на долю которых приходится 68—92 % от суммы жирных кислот.
Ключевые слова: биодизель; глицерин; жирные кислоты; липиды; микроорганизмы.
Fatty acid composition and the lipid contents in the cells of 29 yeasts, growing on the glycerol-containing medium (3 %) were researched. Two oleaginous yeasts (DizV-63 and DizV-43), accumulating 53—55 % of lipids, with the low content of the unsaturated fatty acids were found. It has been shown, that stearic and palmitic acids are accumulated in the lipids of these microorganisms in significant quantities (68—93 % of the total fatty acids amount)
Key words: biodiesel; glycerol; fatty acids; lipids; microorganisms.
В настоящее время в развитых странах Европы и в Америке поиск решения глобальных проблем (энергетической, сырьевой, экологической и др.) осуществляется в области использования альтернативных возобновляемых источников энергии и сырья и, прежде всего, растительной биомассы 1. В качестве альтернативного биотоплива уже сейчас широко используется биодизель. Это создало проблему избыточного глицерина, являющегося остаточным продуктом производства биодизеля. В США и Европе ежегодно производится около 1.5 млн т глицерина 2, и прирост производства имеет положительную динамику. В России также существует заинтересованность в создании производства биодизеля, что делает актуальным разработку эффективных технологий преработки глицерина в практически важные продукты 3'4.
Одним из наиболее рациональных направлений утилизации глицеринсодержащих отходов является получение липидов с помо-
щью микроорганизмов для производства самого биодизеля. Это позволит снизить стоимость биодизеля путем возврата глицерина в производственный цикл 5 и уменьшит расход растительного сырья и площадей земельных угодий, используемых для его выращивания, пригодных также для производства продуктов питания .
В качестве продуцентов липидов наибольшее внимание заслуживают грибы и дрожжи, способные накапливать триацилглицериды близкие по составу к растительным маслам 6. Однако следует отметить, что одной из главных проблем биодизельного топлива, получаемого из растительных масел, является его низкая устойчивость к окислению в связи с высоким содержанием в нем ненасыщенных жирных кислот по сравнению с содержанием ненасыщенных соединений в углеводородном дизельным топливе 3, что делает целесообразным поиск микроорганизмов — продуцентов липидов с более низким содержанием ненасыщенных жирных кислот.
Дата поступления 06.09.11
Таблица 1
Содержание липидов в биомассе различных микроорганизмов, степень ненасыщенности (СН) жирных кислот и содержание в них С14-С18 насыщенных кислот (ЖКнасыщ)
Штамм Липиды, % (от асб) ЖКнасыщ, % (от суммы) СН Штамм Липиды, % (от асб) ЖКнасыщ, % (от суммы) СН
Гра-4 8.2 29.0 1.43 Гб-1 2.0 38.9 0.69
Гб-3 2.6 26.2 1.36 21 б 25.9 40.8 0.64
РОА-1 15.8 38.3 1.21 84-4 12.3 50.2 0.63
К9 10.7 26.3 1.2 УК13032 4.3 45.1 0.57
ПОА 3.4 16.6 1.02 Гр 4.7 55.2 0.55
Др 16.6 30.9 0.95 Аи 2м 15.5 52.1 0.55
Гра-2 11.6 30.9 0.94 Диз У62 53.0 68.9 0.57
Ф-2 4.3 30.8 0.87 84-2 12.3 65.7 0.49
28-1 3.7 38.3 0.85 Мн-2 1.0 56.2 0.45
84-1 11.9 16.6 0,82 Диз IV 2 12.7 65.6 0.38
Гб-5 6.3 30.9 0.79 Гра-1 3.8 65.8 0.3
84-3 2.9 43.1 0.77 Гб-4 4.1 74.6 0.25
НТК9 4.9 31.6 0,76 ДизV 43 55.1 93 0.042
1-2 3.1 41.9 0.73 Гб-2 6.3 95.0 0.05
Кр 2.5 44.3 0.7 - - - -
В настоящей работе осуществлен поиск продуцентов липидов из глицерина среди дрожжей, выделенных из почв и растительных материалов.
В результате исследования жирнокислот-ного состава липидов 29 дрожжевых культур было обнаружено, что содержание в них С14-С18 насыщенных жирных кислот достигает более 50 % (табл. 1). При этом у большинства микроорганизмов степень ненасыщенности (СН) жирных кислот в липидах характеризуется более низкой величиной, чем СН жирных кислот растительных масел (сои — 1.54*, рапса II типа — 1.34*, ятрофы — 1.05*), использующихся для производства биодизеля.
Однако большинство из микроорганизмов в исследуемых условиях накапливает мало ли-пидов в клетках (табл. 1), уровень которых не превышает 20% (от абсолютно сухой биомассы). Вместе с тем были обнаружены две перспективные олеогенные культуры (Диз У-43 и Диз У-62), содержание липидов в которых достигает 53—55 %, что соответствует уровню триацилглицеридов в клетках лучших известных продуцентов (СтурЬососст сытьаЬыз -58%, СтурЬососсыз а1Ыёы$ - 65%, ЯНойоЬогыЫ дЫЫтэ - 72%) 7'8.
При этом следует отметить, что в составе липидов дрожжей Диз У-43 и Диз У-62 в значительных количествах содержатся стеариновая и пальмитиновая кислоты, на долю которых приходится до 68—93 % от суммы жирных кислот (рис. 1).
Рис. 1. Жирнокислотный состав липидов олеоген-ных дрожжевых культур Диз У-43 и Диз У-62
Это выгодно отличает найденные продуценты от известных олеогенных микроорганизмов, способных расти на глицеринсодержа-щих средах, в липидах которых может содержаться много ненасыщенных жирных кислот (39—45 % олеиновой, 15—18 % линолевой) 7-10, и позволяет рассматривать дрожжевые культуры Диз У-43 и Диз У-62 как перспективные для использования в производстве биодизеля.
Экспериментальная часть
Микроорганизмы выращивали методом поверхностного культивирования при температуре 30 0С в чашках Петри в течение 7 сут на плотной питательной среде (рН 7), содержащей глицерин — 3%, дрожжевой экстракт — 0.3%, КН2Р04 - 0.1%, Ка2НР04-12Н20 -0.1%, (КН4)2Б04 - 0.1%, агар - 1.7%.
* рассчитаны по составу растительных масел, представленному в работе
Полученную биомассу промывали дистиллированной водой и высушивали при 60 °С (в вакууме) в течение 8—12 ч до постоянного веса. Липиды выделяли трехкратной экстракцией сухой биомассы гексаном (1:20). Содержание липидов в сухой биомассе определяли гравиметрически после удаления растворителя.
Для определения состава жирных кислот получали их метиловые эфиры по известной методике 11. Идентификацию метиловых эфи-ров жирных кислот проводили на хроматомасс-спектрометре ОСМ5-ОР20105 БНШАОги (электронная ионизация при 70 эВ). Количественный анализ состава полученных препаратов метиловых эфиров жирных кислот осуществляли на хроматографе Хроматэк Кристалл с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке 60 м х 0.32 мм ГО Бо^е1-Wax х 0.5мт. Режим анализа: температура термостата колонки — 250 оС, температура детектора — 320 оС, температура испарителя — 320 оС, скорость газа-носителя (азот) — 27.5 мл/мин.
СН жирных кислот в липидах рассчитывали как сумму произведений относительного содержания моно-, ди- или триеновых жирных
кислот на число содержащихся в них двойных
" 12 связей .
Литература
1. Дебабов В. Г. // Биотехнология.— 2008.— №1.- C.3.
2. Плетнев М. Ю. // Биотехнология.- 2009.-№1.- C.3.
3. Феофилова Е. П., Сергеева Я. Э., Ивашечкин А. А. // Прикл. биохим. микробиол.- 2010.- Т.46, №4.- С.405.
4. Зорин В. В., Петухова Н. И., Шахмаев Р. Н. // Российский хим. ж. ЖВХО им. Д. И. Менделеева.- 2011.- Т. 55, №1.- С.77.
5. Papanikolaou S., Aggelis G. // Lipid Technol.-2009.- V.21.- P.83.
6. Subramaniam R., Dufreche S., Zappi M., Bajpai R. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.- 2010.-V. 37.- P.1271.
7. Beopoulos A., Nicaud J-M., Gaillardin C. // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2011.- V.90.-P. 1193.
8. Ageitos J. M., Vallejo J. A., Veiga-Crespo P., Villa T. G. // Appl. Microbiol. Biotechnol.-2011.- V.90.- P.1219.
9. Saenge C., Cheirsilp B., Suksaroge T. T., Bourtoom T. // Process Biochemistry.- 2011.-V.46.- P.210.
10. Liang Y., Cui Y., Trushenski J., Blackburn J. W. // Bioresource Technology.- 2010.- V.101.-P.7581.
11. Петухова Н. И., Рахматуллина Ю. Р., Пантелеева С. Н., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.-2007.- Т.14, №1.- C.141.
12. Amaretti A., Raimondi S., Sala M., Roncaglia L., De Lucia M., Leonardi A., Rossi M. // Microbial. Cell Factories.- 2010.- V.9.- P.73.
