CC BY
38
УДК 579.66:547.94
Н.И. Петухова1, Ю.Р. Рахматуллина1, Я.Р. Яхутова1, Л. В. Спирихин2, В.В. Зорин1
Исследование корреляции ТТХ-редуктазной активности с содержанием арахидоновой кислоты в липидах гриба
Mortierella alpina 18-1
1 Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел.: (3472) 43-19-35; Е-mail: bio@rusoil.net 2Институт органической химии Уфимского научного центра Российской академии наук 450054, Уфа, пр. Октября, 71, факс: (3472)35-52-88, е-mail: chemorg@anrb.ru
Исследована способность мицелия гриба Mortierella alpina 18-1 — продуцента арахидоновой кислоты восстанавливать 2,3,5-трифе-нилтетразолий тетрахлорид (ТТХ). Показано, что ТТХ-редуктазная активность мицелия зависит от состава среды. Степень окрашивания мицелия 2,3,5-трифенилформазаном — продуктом восстановления ТТХ — коррелирует с содержанием арахидоновой кислоты в липидах с коэффициентом регрессии 0,95.
Ключевые слова: Mortierella alpina, биосинтез, полиненасыщенные жирные кислоты, ара-хидоновая кислота, 2,3,5-трифенилтетразолий тетрахлорид.
Перспективным способом получения полиненасыщенных жирных кислот является их микробиологический синтез с помощью грибов рода Mortierella (класс Phycomycetes) 1-3. В этом аспекте эффективным продуцентом полиненасыщенных жирных кислот является штамм Mortierella alpina 18-1, образующий на жидкой глюкозо-картофельной среде до 42% липидов (от АСВ), 56% которых приходится на долю арахидоновой кислоты 4'5.
Известно, что содержание арахидоновой кислоты в липидах и биомассе значительно меняется в зависимости от состава и кислотности среды, на которой выращивается грибная культура, температуры и времени культивирования 3. Это обуславливает необходимость постоянного контроля за синтезом арахидоновой кислоты в процессе роста для получения продукта с максимальным выходом. Существующие методы исследования предполагают выделение арахидоновой кислоты из биомассы, что занимает довольно много времени и не позволяет быстро отслеживать изменение жирнокис-лотного состава в процессе культивирования.
Недавно было показано, что степень окрашивания мицелия, инкубированного с 2,3,5-трифенилтетразолием тетрахлоридом (ТТХ), восстанавливающимся дегидрогеназами живых организмов в 2,3,5-трифенилформазан красного цвета, коррелирует (степень корре-
Дата поступления 20.02.06
ляции 0,982) с содержанием арахидоновой кислоты в грибах Mortierella alpina M-27 6 В то же время ТТХ-редуктазная активность не обнаруживается у других олеогенных грибов, не способных синтезировать арахидоновую кислоту. (но образующих полиненасыщенные кислоты). Это указывает на участие специфических для синтеза арахидоновой кислоты ферментов в восстановлении ТТХ. Высказывается предположение, что таким ферментом может служить Э5-десатураза, трансформирующая дигомо-у-линоленовую кислоту в арахидо-новую кислоту 6.
Предложенный метод может оказаться весьма удобным для экспресс-контроля процесса синтеза арахидоновой кислоты in vivo. Однако требуются дополнительные исследования возможности его применения на более широком круге продуцентов, выращиваемых в различных условиях.
В настоящей работе исследована корреляция ТТХ-редуктазной активности гриба Mortierella alpina 18-1, выращенного на средах различного состава с содержанием арахи-доновой кислоты в липидах.
При исследовании в рекомендованных условиях ТТХ-редуктазной активности нативно-го мицелия гриба Mortierella alpina 18-1, выращенного на овсяной среде при 25 оС в течение 18 сут., было отмечено окрашивание мицелия на уровне 1,41 оптических единиц (при 485 нм) в течение часа. В этих условиях биомасса, инактивированная высушиванием при 60 оС в течение 5 ч или прогреванием при 100 оС в течение 10 мин, не восстанавливала ТТХ, что доказывает участие ферментов в этом процессе.
При сравнении ТТХ-редуктазной активности аналогичных 18 суточных препаратов нативной биомассы, полученных на овсяных средах, содержащих различные добавки (глицерина, сульфата магния, сульфата цинка, цитрата натрия) (при 25 оС) было обнаружено значительное варьирование значений исследуемого параметра (табл.).
Наименее окрашенные препараты экстрактов мицелия, инкубированного с ТТХ, были получены на овсяной среде без добавок.
Таблица
ТТХ-редуктазная активность гриба Mortierella alpina 18-1 при росте на различных средах. ТТХ - 0.8%; биомасса - 100 мг/мл; 0.2 М боратный буфер (рН 8.0); температура - 30 оС
Среда ТТХ-ре-дуктазная активность, % Арахидоновая кислота, % (от суммы жирных кислот)
Овсяная среда (без добавок) 100 35,7
Овсяная среда с глицерином (1%) 130 35,8
Овсяная среда с глицерином (1%) и цитратом натрия (0,5%) 168 51,6
Овсяная среда с глицерином (1%) и сульфатом цинка (0,01%) 204 63,6
Овсяная среда с глицерином (1%) и сульфатом магния (0,01%) 220 68,7
Введение в ростовую среду глицерина как дополнительного источника углерода увеличивало ТТХ-редуктазную активность гриба на 30%. На среде с глицерином и цитратом натрия, содержащихся в оптимальных для роста исследуемого гриба концентрациях, также наблюдалось увеличение ТТХ-редуктазной активности по сравнению со средой без добавок или с добавкой только одного глицерина. Наибольшую восстановительную активность проявили препараты, полученные на средах с добавками глицерина и ионов двухвалентных металлов (Zn2+, Mg2+), которые, как известно, оказывают значительное влияние на липидооб-разование у грибов Mortierella alpina 7.
С целью выявления корреляции между ТТХ-редуктазной активностью и содержанием арахидоновой кислоты в липидах были получены препараты метиловых эфиров жирных кислот и исследован их состав методом хрома-томасс-спектрометрии.
При исследовании состава липидных фракций было обнаружено, что наибольший уровень арахидоновой кислоты наблюдается в препаратах, полученных из мицелия с более высокой ТТХ-редуктазной активностью (табл.).
Анализ влияния ТТХ-редуктазной активности полученных препаратов на содержание в их липидной (жирнокислотной) фракции ара-хидоновой кислоты позволило выявить линейную корреляционную зависимосить этих пара-
метров с высоким значением коэффициента корреляции (г2 = 0.95) (рис.).
0 20 40 60 80 100
Арахидоновая кислота, % (от суммы жирных кислот)
Рис. Зависимость ТТХ-редуктазной активности мицелия Mortierella alpina 18-1 от содержания арахи-доновой кислоты в липидах. Условия реакции: ТТХ — 0.8%; биомасса — 100 мг/мл; 0.2 М боратный буфер (рН 8.0); температура — 30 оС
Интересно отметить, что линейная функция, описывающая эту зависимость, практически проходит через начало координат и свидетельствует об отсутствии синтеза арахидоно-вой кислоты при отсутствии в мицелии ТТХ-редуктазной активности, обусловленной, в соответствии с данными 6, Э5-десатуразой.
Полученные данные показывают принципиальную возможность использования данной зависимости для экспресс-контроля in vivo за содержанием арахидоновой кислоты в липи-дах гриба Mortierella alpina 18-1 (по крайней мере при культивировании на рассмотренных средах) по степени окрашивания мицелия, инкубированного с ТТХ. Однако требуется дополнительное исследование зависимости ТТХ-редуктазной активности от содержания арахидоновой кислоты в липидах при использовании биомассы различного возраста, поскольку нельзя исключать, что уровень фермента, ответственного за восстановление ТТХ, может меняться в клетках в процессе развития грибного мицелия.
Экспериментальная часть
Объектом исследования служил гриб Mortierella alpina 18-1 из коллекции микроорганизмов кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ.
Для выращивания биомассы гриба использовалась в качестве основной овсяная среда (овсяные хлопья — 50 г/л, агар-агар — 18 г/л). В зависимости от условий экспери-
мента в овсяную среду вносили добавки цитрата натрия (0,5%), глицерина (1%), сульфата цинка (0,01%) или сульфата магния (0,01%).
Для засева чашек Петри использовали суспензию спор и фрагментов мицелия (2,5 мл на 5 г питательной среды), полученную смывом культуры стерильной водопроводной водой, со скошенной в пробирках среды Чапека (2—3-106 фрагментов мицелия и спор/см3). Выращивание производили в стерильных условиях, в термостате при температуре 25 °С.
ТТХ-редуктазную активность мицелия оценивали по степени окрашивания мицелия в процессе инкубации с 2,3,5-трифенилтеттразо-лием тетрахлоридом (ТТХ) в течение 1 ч. Биомассу (0,1 г) помещали в 1 мл 0,8% раствора ТТХ в 0,2 М боратном буфере (рН 8,0) и инкубировали в темноте 1 ч при 30 оС. Мицелий дважды промывали дистиллированной водой, разрушали и трижды экстрагировали 2,3,5-трифенилформазан этилацетатом (по 2 мл) при комнатной температуре. Степень окрашивания измеряли при длине волны 485 нм.
Выделение жирных кислот проводили согласно 8. Идентификацию метиловых эфиров жирных кислот осуществляли на хроматомасс-спектрометре «НР-5896» с масс-селективным детектором НР-5972А, стеклянной капиллярной колонкой длинной 50 м, 5% фенилметил-
силикона на НР-5. Масс-спектр метилового эфира арахидоновой кислоты, m/z: 55(49), 67(79), 79(100), 91(67), 105(30), 119(18), 133(12), 150(13), 161(3), 175(4), 203(3), 247(3), 318M+(1). Относительное количество жирных кислот в пробе определяли по отношению к внутреннему стандарту.
Литература
1. Eroshin V.K., Dedyukhina E.G. // World J. Microbiol. Biotechnol.- 2002.- V. 18.- P. 165.
2. Higashiyama K., Fujikawa S., Park E., Shimizu S. // Biotechnol. Bioprocess. Eng.- 2002.- V. 7.- P.252.
3. Wynn J.P., Hamid A.A., Midgley M., Ratledge C. // Wold J. Microbiol. Biotechnol.- 1998.-V. 14.- P.145.
4. Давлетбаев И.М., Петухова Н.И., Зорин B.B. / / Баш. хим. ж.- 2000.- Т.7, №1.- С. 40.
5. Wynn J.P., Hamid A.A., Li Y., Ratledge C. // Microbiology.- 2001.- V. 147.- P. 2857.
6. Zhu M., Yu L.J., Liu Z., Xu H.B. // Lett. Appl. Microbiol.- 2004.- V. 39.- P. 332-335.
7. Bajipai P.K., Bajipai P. Ward O.P. // J. Indust. Microbiol.- 1991.- V. 8.- P.179.
8. А.с. 968072. СССР, МКИ С 12 Q 100. / Султа-нович Ю. А., Нечаев А. П., Барсукова И. А. Способ количественного определения жирно-кислотного состава липидов микроорганизмов. -//Б.И.- 1982.- №39.- С. 223.
