CC BY
21
ОФТАЛЬМОЛОГИЯ
Исследование количественного содержания молекулярного аденозинтрифосфата и гуанозинтрифосфата с целью обоснования
V | V
механизма действия трофическом
I WW
модифицированном лазерной циклокоагуляции
А.Е.Егоров, Е.В.Андрианова, Д.В.Кац
Российский государственный медицинский университет им. Н.И.Пирогова, кафедра офтальмологии лечебного
факультета, Москва
(зав. кафедрой - проф. А.Е.Егоров)
Цель - изучение в эксперименте процессов ограниченной и управляемой воспалительной реакции после модифицированной лазерной циклокоагуляции, количественного содержания аденозинтрифосфата, гуанозинтрифосфата в сетчатке и зрительном нерве как маркеров процессов фототрансдукции и изменения уровня энергетических процессов. На 36 глазах 36 кроликов породы «серая шиншилла» по стандартной методике проводили трофическую модифицированную лазерную циклокоагуляцию. Контролем служили 36 парных глаз кроликов без проведения МЛЦК. Проводились биохимические исследования. Сроки наблюдения составили 1час, 3 часа, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 48 ч. Были получены количественные результаты динамики содержания АТФ, ГТФ при трофической МЛЦК и в контрольной группе. В опыте наблюдается увеличение количества АТФ и ГТФ (в нмоль) по сравнению с контролем. Получено подтверждение эффективности МЛЦК в плане активизации обменных процессов в глазу.
Ключевые слова: лазерная циклокоагуляция, ограниченная и управляемая воспалительная реакция, аденозинтрифос-фат, гуанозинтрифосфат, обменные процессы в глазу
The research on the quantity of molecular adenosine triphosphate and guanosine triphosphate to validate the mechanism of action of trophic modified laser cyclocoagulation
A.E.Egorov, E.V.Andrianova, D.V.Katz
N.I.Pirogov Russian State Medical University, Department of Ophthalmology of Medical Faculty, Moscow (Head of the Department - Prof. A.E.Egorov)
The purpose of the investigation was to estimate in the experiment the process of limited and controled inflammatory reactions after modified laser cyclocoagulation, quantity of adenosine triphosphate and guanosine triphosphate in the retina and optic nerve as a marker of photo transduction processes and level alteration of energetic causes. The modified laser cyclocoagulation was performed in 36 gray Shinshilla rabbits (36 eyes).The trophical laser cyclocoagulation was made by a standard methodic. 36 pair eyes without the modified laser cyclocoagulation was a control group. The study results were accessed by biochemical research at 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 48 hours after the treatment. Quantitative results were obtained on the dynamics of ATP and GTP content in the trophic MLCC and in the control group. The results of the biochemical research proved the advancement of the level of the the quantity of molecular adenosine triphosphate and guanosine triphosphate in the experimental group compared with the control group. On biochemical level it confirmed the effectiveness of modified laser cyclocoagulation, as a method of eye's metabolic processes' activation.
Key words: laser cyclocoagulation, limited and controlled inflammatory reaction, adenosine triphosphate, guanosine triphosphate, eye's metabolic processes
Для корреспонденции:
Андрианова Екатерина Владимировна, аспирант кафедры офтальмологии Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 111539, Москва, ул.Вешняковская, 23 Телефон: (495) 375-2229 E-mail: andrianova@mc-svetoch.ru
Статья поступила 07.05.2009 г., принята к печати 31.03.2010 г.
Выбор рационального гипотензивного медикаментозного лечения глаукомы является одной из сложных и важных проблем офтальмологии. В современной литературе и клинической практике большое внимание уделяется коррекции метаболических нарушений сетчатки и зрительного нерва у пациентов с глаукомной оптической нейропати-
ей [1, 2]. Ишемия и гипоксия сетчатки и головки зрительного нерва являются одними из важнейших факторов в развитии необратимых изменений в заднем отрезке глаза при глаукоме. Особенно чувствительны к гипоксии ткани с высоким уровнем энергетического метаболизма. В глазу к таким тканям относятся сетчатка, зрительный нерв и в меньшей степени сосудистая оболочка [3-5]. Патофизиологические процессы, вызванные ишемией, при различных заболеваниях могут существенно различаться, но во всех случаях решающую роль играет гипоксия и ее последствия [6, 7]. Последствием гипоксии является ухудшение тканевого дыхания, замедление процессов фототрансдукции (процесс превращения световой энергии в нервный импульс [8, 9]), дефицит в клетках молекулярного аденозинтрифосфата (АТФ) и гуанозинтрифосфата (ГТФ). В процессах фототрансдукции принимают участие разнообразные белковые молекулы, которые находятся в условиях динамического взаимодействия. АТФ - аденозинтрифосфорная кислота, универсальный аккумулятор энергии во всех растительных и животных клетках, принимает участие в процессах фото-трансдукции, занимает ключевую позицию в энергетическом обмене клетки и служит источником энергии для всех биологических процессов в организме. ГТФ - гуанозинтрифос-фат, гуаниловый нуклеотид, принимает участие в трансмембранной передаче разнообразных сигналов, участвует в зрительном каскаде посредством процессов фототрансдукции. В настоящее время достаточно подробно изучены процессы, протекающие в сетчатке при световосприятии [10-17].
Список средств и методик, применяемых для лечения гипоксии, непрерывно расширяется. Однако достаточно полную проверку их эффективности при внутриглазной гипоксии прошли только немногие из них.
Выраженное влияние на метаболические процессы в заднем отрезке глаза оказывает модифицированная лазерная циклокоагуляция (МЛЦК). Она является одним из методов аутобиотерапии, при которой в ответ на дозированное повреждающее воздействие происходит запуск каскада биохимических реакций, приводящих к выработке организмом собственных биологически активных веществ. Биологически активные вещества благотворно влияют на сосудистый тонус, уровень метаболизма, повышение и усиление передачи зрительного сигнала посредством процессов фототрансдукции, основные биохимические зрительные реакции [18-21].
Эффект операции МЛЦК заключается в повышении зрительных функций у больных с глаукомной оптической нейро-патией. Максимальное улучшение состояния полей и остроты зрения наступает через 7 дней после воздействия и остается стабильным в течение 6 мес наблюдения. Данная лазерная методика широко используется в клинической практике, однако процессы, приводящие к этому, недостаточно изучены на биохимическом уровне.
Цель исследования - изучение в эксперименте процессов ограниченной и управляемой воспалительной реакции после трофической модифицированной лазерной циклокоагуля-ции, количественного содержания молекулярного АТФ и ГТФ в сетчатке и зрительном нерве как маркеров процессов фототрансдукции и изменения уровня энергетических процессов.
Материалы и методы
Работа проведена на 36 половозрелых кроликах породы «серая шиншилла» обоего пола, массой 2,5-3,0 кг. Проведение работы было одобрено Этическим комитетом РГМУ им. Н.И.Пирогова (протокол №75 от 24 декабря 2007 г.). Перед операцией всем кроликам проводили премедикацию: в конъюнктивальную полость закапывали глазные капли оксибупрокаин 0,4% по 1-2 капли трехкратно с интервалом 5-7 мин.
Техника трофической МЛЦК. С помощью контактного лазерного зонда с умеренным вдавлением склеры в 3-5 мм от лимба на 6 часах в шахматном порядке в 3 ряда наносятся 8 лазерных коагулятов. Режим работы лазера: мощность составляет от 0,4 до 0,5 Вт, экспозиция - 3,0 с [22].
Операция проводилась на левых глазах кроликов. Правые глаза служили контролем. Выведение кроликов из опыта производилось через 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 36, 48 ч после воздействия. Глазные яблоки удаляли с участком зрительного нерва. Энуклеированные глаза замораживали путем погружения в жидкий азот.
Содержание АТФ и ГТФ в биологических образцах определяли с помощью колоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии методом внутреннего стандарта. К раствору образца добавляется определенное количество стандартного раствора (в данном случае 2'-дезоксиаденозина) и смесь подвергается хроматографическому разделению на колонке ЫИговогЬ С-18 в ион-парном режиме. Оптическая плотность элюата (вещество, которое выходит из колонки) определяется проточным УФ-детектором и анализируется количественно по программе Амперстед для количественного анализа хроматограмм. Соотношение количества АТФ и ГТФ со стандартом (2'-дезоксиаденозином) дает возможность определить их содержание в анализируемой пробе.
Замороженная в жидком азоте ткань (энуклеированный глаз) взвешивается и механически измельчается в фарфоровой ступке пестиком до порошкообразного состояния. Измельченный образец экстрагируется буфером А в составе: 10 мМ Трис-НС1, 0,5 мМ ЕДТА, рН = 7,6 при +4°С, объем буфера 14 мл. Суспензия переносится в пластиковый флакон, и 1 мл суспензии осветляется центрифугированием при 14 000 об/мин в течение 5 мин. Остальной экстракт замораживается и хранится при -70°С. После центрифугирования осадок отбрасывается, а в 100 мкл супернатанта добавляется 100 мкл охлажденного этилового спирта. Смесь перемешивается и после формирования осадка центрифугируется при 14 000 об/мин в течение 10 мин. Осадок отбрасывается, а супернатант упаривается досуха на вакуумном концентраторе. Осадок растворяют в 20 мкл воды, к раствору добавляют 2 мкл 1 мМ раствора 2'-дезоксиаденозина и анализируют на хроматографе фирмы «ОИэоп». Хроматографическая колонка размером 4x150 мм, сорбент - ЫИгоэогЬ С-18, 7 мкм. Раствор А - 50 мМ ТЭАБ, раствор В - 70% этанол. Градиентная элюция происходит со скоростью 0,5 мл/мин по программе: 0-5 мин - 100% А, 5-10 мин - 10% В, 10-30 мин - 20% В, 30-35 мин - 100% В, 35-40 мин - 100% В, 40-45 мин -0% В, 45-60 мин - 0% В. Детекция оптической плотности элюата осуществляется при длине волны 260 нм, количе-
А.Е.Егоров и др. / Вестник РГМУ, 2010, №3, с. 66-69
Л Id
3
I т 1 > - Ь > ' ? 1» М Г1 ц 14 >4 1« IЧ ■■ 1
Рис. 1. Хроматограмма количественного анализа образцов на содержание АТФ и ГТФ. На оси абсцисс отмечено время элю-ции веществ (время удерживания) в минутах. На оси ординат отмечается количество вещества в элюате, определяемое проточным УФ-детектором.
ственный обсчет хроматограмм - по программе Амперстед. Содержание АТФ и ГТФ приведено в нмоль (10-9 моль) на образец, что соответствует 1/280 части всего гомогенизированного органа. Содержание АТФ и ГТФ в органе пересчитано в нмоль/мг ткани, исходя из результатов анализа высокоэффективной жидкостной хроматографии и веса ткани (рис. 1).
Удерживание вещества определено по стандарту экспериментальным путем: время удерживания ГТФ, АТФ и с1Ас1е равно соответственно 14,1 мин (пик №5), 14,8 мин (пик №6) и 18,7 мин (пик №8). с1Ас1е (2'-дезоксиаденозин) - внешний стандарт, который добавлялся во все пробы в количестве 1 нмоль перед хроматографией. Точность определения времени удерживания вещества составляет ±0,1 мин. Площадь пика анализируемого вещества на хроматограмме пропорциональна количеству вещества в анализируемом образце. Остальные пики - это примеси.
Результаты исследования и их обсуждение
При проведении серии биохимических исследований были получены результаты динамики содержания АТФ и
2,5 г
л
0 -1-1-1-1-1-1-1-1-
1 3 6 9 12 18 24 36 48
Время, час
■ Трофическая МЛЦК —О— Контроль Рис. 2. Динамика содержания АТФ при трофической МЛЦК.
1 3 6 9 12 18 24 36 48
Время, час
■ Трофическая МЛЦК —О— Контроль Рис. 3. Динамика содержания ГТФ при трофической МЛЦК.
ГТФ при трофической МЛЦК и динамики содержания АТФ и ГТФ в контрольной группе. Был проведен анализ полученных данных.
Содержание АТФ при трофической МЛЦК повышается сразу с третьего часа после лазерной процедуры -с 0,83 нмоль до 1,48 нмоль и плавно продолжает расти в течение двух суток до отметки 2,11 нмоль, далее наблюдается процесс стабилизации содержания ATP в образце (рис. 2).
При трофической МЛЦК можем наблюдать активное повышение количественного содержания ГТФ с третьего часа после воздействия с 0,24 до 0,44 нмоль, затем наблюдается плавный рост содержания ГТФ до 36 часа от воздействия и стабилизация процесса (рис. 3).
В контрольной группе содержание АТФ стабильно, в пределах 0,68-0,83 нмоль, ГТФ - в пределах 0,19-0,27 нмоль.
Выводы
1. Повышение количественного содержания АТФ и ГТФ в опытной группе по сравнению с контролем подтверждает трофический механизм действия МЛЦК на биохимическом уровне.
2. Результаты исследования позволяют продолжить изучение биохимических процессов, происходящих в глазу после трофической модифицированной лазерной циклокоагуляции и перейти к дальнейшему изучению собственных биологически активных веществ, благотворно влияющих на уровень метаболизма.
Литература
1. Нестеров А.П. Глаукома. - М.: МИА, 2008. - 357 с.
2. Morgan J.E. Optic nerve head structure in glaucoma: astrocytes as mediators of axonal damage // Eye. - 2000.- V.14. - Р.437-444.
3. Егоров Е.А., Курмангалиева М.М., Федотовских Г.В. Морфологическое исследование сетчатки глаз больных глаукомой // Клин. офтальмол .2004. - №2 .- С.54-56.
4. Алексеев В.Н., Мартынова Е.Б., Садков В.И., Самусенко И.А. Роль апоптоза и метаболизма мюллеровских клеток при экспериментальной глаукоме // Клин. офтальмол. - 2005.- №2. - С. 52-55.
5. Бурсов И.В. Патофизиология и биохимия глаза. - М.,1986.
L
6. Бунин А.Я. Метаболические факторы патогенеза первичной открытоуголь-ной глаукомы. Глаукома на рубеже тысячелетий. Материалы Всероссийской науч.-практ. конференции. - М., 1999. - С. 9-12.
7. Курышева Н.И. Глаукомная оптическая нейропатия. - М., 2006.
8. Липкин В.М., Обухов А.Н. Передача и усиление зрительного сигнала // Биол. мембраны. - 1999. - Т.16. - №2. - С.135-158.
9. Филиппов П.П. Как внешние сигналы передаются внутрь клетки // Соросовский образоват. журн. - 1998. - № 3. - С. 28-34.
10. Островский М.А. Молекулярные механизмы повреждающего действия света на структуры глаза и системы защиты от такого повреждения. - В кн.: Клиническая физиология зрения / Под ред. А.М.Шамшиновой. - М.: Научно-медицинская фирма МБН, 2002. - C.38-69.
11. Каламкаров Г.Р., Лунгина О.Г. цГМФ-регулируемая проводимость on-биполярных клеток не активируется реагентами, модифицирующими сульфгидрильные группы // Сенсорные системы. - 2001.- Т.15. - №4. -С.275-287.
12. Agapova O.A., Ricard C.S., Salvador-Silva M. et at. Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human optic nerve head astrocytes // Glia. - 2001. - V. 33. - С.205-216.
13. Мазуш Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. В 2-х т. - М., 1993.
14. Мусил Я. Основы биохимии патологических процессов. - М.: Медицина, 1985. - С.432.
15. Кашинцева Л.Т., Крыжановский Г.Н., Липовецкая Е.М., Копп О.П. Адренергические и кальциевые механизмы развития глаукомного процесса и перспективы патогенетического лечения больных открытоугольной глаукомой // Офтальмол. журн. - 1995. - № 3. - С. 133-137.
16. Северин Е.С. Элементы патологической физиологии и биохимии. - М., 1997.
17. Morrison J., Johnson E., Cepurna W. Understanding mechanisms of pressure-induced optic nerve damage // Progress in Retina and Eye Research. - 2005. -V.24. - P. 217-240.
18. Егоров А.Е., Егоров Е.А., Нестеров А.П., Свирин А.В. Ограниченное и контролируемое воспаление как метод лечения ишемических и гипоксических заболеваний заднего сегмента глаза // Клин. офтальмол. - 2002. - №1. - С.3-6.
19. Нестеров А.П. Глаукомная оптическая нейропатия // Вестн. офтальмол. -1999. - Т.115. - № 4. -С. 3-6.
20. Нестеров А.П., Егоров Е.А., Егоров А.Е., Кац Д.В., Алябьева Ж.Ю., Касимов Э.М. Влияние транссклеральной лазерной циклокоагуляции на внутриглазное давление и зрительные функции у больных глаукомой с низким давлением // Клин. офтальмол. - 2001. - № 2. - С. 56.
21. Johnson E.C., Deppmeier L.M., Wentzien S.K. et al. Chronology of optic nerve head and retinal responses to elevated intraocular pressure // Invest. Ophthalmol. Vis Sci. - 2000. - V.41. - Р. 431-442.
22. Кац Д.В. Модифицированная диодная транссклеральная лазерная циклокоа-гуляция в лечении первичной открытоугольной глаукомы: Автореф. дис. к.м.н. - М., 2003. - 32 с.
Информация об авторах:
Егоров Алексей Евгеньевич, доктор медицинских наук,
профессор кафедры офтальмологии Российского государственного
медицинского университета им. Н.И.Пирогова
Адрес: 111539, Москва, ул. Вешняковская, 23
Телефон: (495) 375-2229
E-mail: alexeye@mail.ru
Кац Дмитрий Васильевич, кандидат медицинских наук, доцент кафедры офтальмологии Российского государственного медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 111539, Москва, ул. Вешняковская, 23 Телефон: (495) 375-2229 E-mail: katzd@mail.ru
ИЗ жизни УНИВЕРСИТЕТА
Учебники и монографии
Никифоров А.С., Гусева М.Р. Нейроофтальмология: руководство. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 624 с.
В первой части книги («Введение в нейроофтальмологию») основное внимание уделяется морфологии и физиологии глаза и его вспомогательного аппарата, мозговым структурам, проводящим зрительные импульсы от сетчатой оболочки глаз до зрительной коры и других корковых зон, осуществляющих анализ и синтез зрительных импульсов. Вторая часть посвящена главным образом нейроофтальмологической семиотике. В третьей части приведены краткие сведения о некоторых заболеваниях, травматических и токсических поражениях, в клиническую картину которых входят признаки нейроофтальмологической патологии. В четвертой части описаны некоторые методы современной фармакотерапии в офтальмологии. В конце книги приводится список рекомендуемой дополнительной русскоязычной литературы по вопросам нейроофтальмоло-гии. Издание предназначено для врачей неврологов и офтальмологов. Изложенные в нем сведения по нейроофтальмологии помогут повысить эффективность диагностической работы врачей и других клинических профессий. Руководство может быть рекомендовано для студентов медицинских вузов.
Нестеров А.П. Глаукома. - М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2008. - 360 с.
Данное, второе, издание книги значительно переработано с учетом современных представлений о патогенезе, диагностике и лечении глаукомы. В книге рассмотрены вопросы механизма формирования внутриглазного давления, закономерности, определяющие гидродинамику и гидростатику глаза. Описаны клиническая картина, диагностика и дифференциальная диагностика различных форм глаукомы (врожденной, первичной и вторичной). Подробно освещены вопросы патогенеза, особенно первичной глаукомы, включая и особенности глаукоматозного поражения зрительного нерва. Представлены современные методы лечения и разобраны показания к ним с учетом их оптимизации. Книга предназначена для врачей-офтальмологов.
