CC BY
51
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579.2/577.2
ИССЛЕДОВАНИЕ КАЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА ЭПИФИТНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ НЕКОТОРЫХ КУЛЬТУРНЫХ И СОРНЫХ РАСТЕНИЙ ТАМБОВСКОЙ И МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТЕЙ
1 2
С.И. Приходько, О.В. Селицкая, к.б.н.
1ФГБУ ВНИИ карантина растений
2
2РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, e-mail: [email protected]
Эпифитная микробиота растений многочисленна и разнообразна. Состав микроорганизмов, развивающихся на поверхности растений различается в зависимости от вида растения, климата, погодных условий, местообитания. Нами были изолированы штаммы некоторых эпифитных микроорганизмов растений, взятых в Тамбовской и Московской областях. Определена нуклеотидная последовательность гена 16SрРНК выделенных бактерий с использованием универсальных бактериальных праймеров.
Ключевые слова: почвенные и ризосферные микроорганизмы, растения, качественный состав.
RESEARCH OF QUALITATIVE CONTENT OF EPIPHYTIC MICROORGANISMS OF CULTIVATED AND WEED PLANTS IN TAMBOV AND MOSCOW REGIONS S.I. Prikhodko, O.V. Selitskaya
Russian Timiryazev State Agrarian University, e-mail: [email protected]
Epiphytic microorganisms of plants are very varied. Composition of microorganisms on the surface of plants varies depending on the plant species, climate, weather, habitat. We have isolated several strains of plants epiphytic microorganisms from samples taken in the Tambov and Moscow regions. Nucleotide sequences of the 16S rRNA gene isolated bacteria were defined by using universal bacterial primers.
Keywords: soil and rhizosphere microorganisms, plants, qualitative content.
До последнего времени исследования микроорганизмов, ассоциированных с растениями были связаны с почвенными и ризосферными микроорганизмами. Значительно меньше внимания уделялось микроорганизмам филлосферы, т.к. считалось, что состав микроорганизмов на поверхности надземных частей растений однообразен. В последствии было выяснено, что филлосфера растений колонизирована большим числом микроорганизмов [1]. Некоторые из этих микроорганизмов не могут размножаться после их попадания на растения. Но многие сапрофитные и патогенные микроорганизмы, способны расти на здоровых листьях, где их популяция достигает больших размеров. А в состав таких сообществ могут входить не только бактерии различных физиологических групп, но также дрожжи и плесневые грибы. Некоторые способны образовывать лишь поверхностные популяции, а другие могут заселять не только поверхность листьев, но и проникать внутрь тканей растений [2]. Эпифитные бактерии были определены как микроорганизмы, которые способны к жизни (т.е. размножению) на поверхности растений. Термин «эпифитные», таким образом характеризует виды бактерий, которые приспособлены к развитию, в первую очередь, на поверхности листьев.
Эпифитные микроорганизмы, заселяющие живую надземную растительную массу, приспособлены к влиянию солнечной радиации, колебаниям температуры, влажности воздуха и воздействию прижизненных выде-
лений растений. Эпифитные микроорганизмы отнесены экологами к важнейшим компонентам биогеоценозов и выделяются в особую функциональную группу консор-тов-симбиотрофов [3].
Бактерии ассоциированные с листьями растения, или филлобактерии используют ряд путей при заселении филлоплана. Этапы заселения поверхности листа заключаются в модификации листа как среды обитания, агрегации, ингрессии и эгрессии. Эпифиты способны изменять окружающую их среду, чтобы более интенсивно заселять эту экологическую нишу. Например, локально увеличивая концентрацию питательных веществ, либо производя внеклеточные полисахариды. Это локальное изменение среды обитания может происходить на поверхности листьев, а также внутри листа и может усиливаться за счет формирования бактериальных агрегатов. Наличие бактериальных агрегатов на листьях и обнаружение такого поведения бактерий на растениях, изменяющегося в плотностью зависимый способ существования, указывает на потенциально важное значение кооперативных взаимодействий между филлобактериями. Такие кооперативные взаимодействия могут происходить как среди гомогенных, так и гетерогенных популяций, влияя, таким образом, на развитие микробных общин. Популяции внешней и внутренней части листа, вероятно, связаны и образуют континуум за счет процессов ингрес-сии и эгрессии. Бактерии являются наиболее распространенными обитателями поверхности листьев. Некоторые
популяции могут быть представлены примерно 39 родами, которые в свою очередь могут включать до 78 видов, а число клеток может достигать в среднем от 106 до 107 клеток/см2 (до 108 клеток/г) листа [4, 5].
Разнообразнейшая коллекция бактерий, обитающая на листьях, часто включает небольшое количество видов, способных значительно влиять на растение, в основном за счет экзогенных продуктов метаболизма, таких как биологически активные вещества и фитогормоны [4].
Интерес к микробиологии филлосферы обусловлен необходимостью исследования поведения фитопатогенов, изучению которых уделяется больше внимания, чем остальным членам данного сообщества микроорганизмов. Поэтому гораздо меньше сведений о представителях или свойствах многочисленных непатогенных микробов, которые населяют филлосферу. Такие колонисты способны усилить иммунную реакцию растений по отношению к болезнетворным микроорганизмам, снижая численность населения вредных микробов, а некоторых из них можно использовать в качестве биологического контроля. Детальное изучение экологии патогена и их возможных антагонистов привело к появлению нехимических средств борьбы с болезнями, тем самым уменьшая необходимость частого применения антибиотиков [5].
Настоящая работа посвящена изучению микробных сообществ эпифитных бактерий Тамбовского и Московского регионов, которые играют важную роль не только, как теоретическая база в изучении местообитаний бактерий, особенностей их приспособительных механизмов, различий качественного состава популяций, населяющих культурные и дикие растения, но и имеют практическую значимость - поиск новых биологических средств борьбы с болезнями растений.
Исследования проводили летом и осенью 2012 г. Объектами изучения эпифитных микроорганизмов были следующие виды растений: 1. Капуста (листья) цветная (Brassica oleracea var. botrytis) и белокочанная раннеспелого и позднеспелого сортов (Brassica oleracea); 2. Кукуруза (Zea mays) -вегетативная масса; 3. Укроп (Anethum graveolens); 4. Салат (Lactuca sativa); 5. Люцерна (Medicago sativa); 6. Клевер красный (Trifolium rubens); 7. Осот полевой (Sónchus arvénsis).
Образцы растений отбирали в июне-июле 2012 г. в Тамбовской и Московской областях. Регионы были выбраны в связи с различными агроклиматическими условиями произрастания объектов исследований. Образцы культурных и сорных растений отбирали с одного участка. Растения не обрабатывали средствами химической защиты.
Под объекты исследований не вносили удобрения.
Методика выделения бактерий с поверхности растений основана на получении экстракта в фосфатно-солевом буфере. Листья растений помещали в 30 мл PBS буфера и шейкировали в шейкере-инкубаторе в течение 90 мин. при 200 об/мин. Затем буфер отфильтровывали и центрифугировали в течение 10 мин. при 8000 об/мин. Супернатант удалили, а к осадку добавили 1 мл свежего PBS. Далее полученный экстракт можно использовать для посева на питательную среду, либо для диагностических целей.
Так как нужно было оценить биологическое разнообразие бактерий мы провели прямой высев суспензии на универсальную плотную питательную среду YDC, а также на среду «капустный агар», рекомендуемую для культивирования растительных ассоциатов [6, 7]. Температура культивирования составляла 27°С. Полученные колонии были выделены в чистую культуру, хранящуюся при температуре -80°С в 15% растворе глицерина.
Учет микроорганизмов проводили на пятые сутки культивирования путем подсчета колоний и определения КОЕ/г листа по формуле:
М = а • 10n/V,
где: а - количество выросших колоний; 10п - разведение; V - посевная доза (0,1 мл).
Идентификацию полученных культур микроорганизмов проводили с использованием методов молекулярной биологии. ДНК выделяли набором реагентов «Проба-ГС» от «Агродиагностика». Далее провели постановку классической ПЦР. Наиболее удобным для идентификации бактерий считается ген 16S рРНК, поэтому мы использовали универсальные бактериальные праймеры 8UA_519B (www.enotes.com/topic/16S_ribosomal_RNA). Детекцию ампликонов осуществляли гельдокументирующей системой GelDoc (Bio-Rad Laboratories, США).
Определение нуклеотидной последовательности участка гена 16S pPHK осуществляли методом секвенирования ПЦР-фрагментов с применением набора реактивов Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 3500XL («Applied Biosystems», США).
Филогенетический скрининг сходства нуклеотидной последовательности гена 16S pPHK изолированных штаммов бактерий проводили по базе данных GenBank NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) с помощью программы BLAST.
Нами было изолировано 97 штаммов микроорганизмов. На основе анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК изолированных штаммов бактерий с максимальной степенью идентификации 96-99,9% можно сказать, что микробиота филлосферы исследованных растений представлена следующими видами микроорганизмов:
1. Обилие видов бактерий, изолированных с образцов _растений (количество штаммов), ед._
Вид бактерий Тамбовская область Московская область Обилие вида, %
Тамбовская область Московская область
Bacillus 23 22 48,94 44
Pseudomonas S 6 17,02 12
Micrococcus 2 6 4,26 12
Microbacterium 1 15 2,13 30
Enterobacter 7 - 14,87 -
Curtobacterium 2 - 4,26 -
Frigoribacterium 2 - 4,26 -
Agrobacterium 1 - 2,13 -
Ochrobactrum 1 - 2,13 -
Lysinibacillus - 1 - 2
Итого 47 50 100
Bacillus (B. megaterium, B. thuringiensis, B. mycoides, B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis, B. safensis, B. pumilus), Micrococcus (M. flavus, M. luteus), Curtobacterium flac-cumfaciens, Pseudomonas putida, Pseudomonas fuorescens, Lysinibacillus sp., Enterobacter cloacae, Microbacterium (M. yannicii, M. barkeri), Agrobacterium tumefaciens и Ochrobactrum cytisi (табл. 1).
Исходя из полученных результатов, бактерии, относящиеся к роду Bacillus, характеризуются наибольшим обилием, т.к. как имеют значительную численность в исследуемом сообществе (общая численность составила 2,3 х 105 КОЕ/г листа в образцах из Тамбовской области и 2,2 х 105 КОЕ/г листа - из Московской). Данные бактерии можно считать доминирующими среди эпифит-ных бактерий филлоплана растений обоих регионов. Численность бактерий родов Pseudomonas, Micrococcus, Microbacterium на московских образцах была умеренной. На тамбовских образцах выявлено обилие бактерий родов Pseudomonas и Enterobacter. Бактерии рода Enterobacter не относятся к типичным эпифитам, но широта их распространения (встречаются в пресной воде, почве, сточных водах, на растениях, овощах, в испражнениях человека и животных) и значительная численность изолированных нами штаммов, говорит о том, что данные бактерии обладают разнообразными приспособительными механизмами и способны вести, хотя и временно, эпифитный образ жизни.
Бактерии, составляющие незначительную часть сообщества были являются редкими, а соответственно имеют низкие показатели значимости в сообществе. К ним относятся бактерии родов Micrococcus, Curtobacterium, Frigoribacterium, Agrobacterium, Ochrobactrum - в Тамбовской области и Lysinibacillus - в Московской.
Популяции микроорганизмов подвержены значительным изменениям и колебаниям численности. Поэтому выравненность данных сообществ довольно низка. В исследуемый летне-осенний период сообщества эпифитных бактерий, образцов растений, отобранных нами в Тамбовской области, характеризовались более низкой степенью выравненности, нежели сообщества бактерий московских образцов. Высокая выравненность видов в сообществе характеризует его разнообразие, следовательно популяции филлобактерий растений из Московской области более разнообразны, чем популяции из Тамбовской области.
На состав микрофлоры влияют самые разные факторы, например, климат и местообитание. Как мы уже показали выше, растения из различных регионов характеризуются различным обилием видов и выравненностью этих видов в сообществе. Большое значение имеет также к какому виду (культурному или дикорастущему) относится растение. Так, с культурных растений нами было изолировано 81% штаммов бактерий. Таким образом, культурные растения (капуста белокочанная и цветная, кукуруза, салаты) отличаются более высоким видовым разнообразием эпифитных микроорганизмов, что возможно связано с более высокой питательностью продуктов экзоосмоса, благоприятными условиями для развития данных микроорганизмов, чем на поверхности фил-лоплана дикорастущих растений. Бактерии, полученные с дикорастущих растений, представлены всего 4 видами: Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Pseudomonas fuorescens, Enterobacter cloacae. В то время, как бакте-
рии с культурных растений представлены 20 видами, относящимися 10 родам (табл. 1).
Фактором, косвенно влияющим на качественный состав эпифитных бактерий, служит вегетативная фаза развития растений. Мы сравнили образцы капуты белокочанной раннеспелого сорта Июньская и позднеспелого сорта Слава и гибрида F1 Колобок (табл. 2).
2. Биоразнообразие эпифитных бактерий, в зависимости от скороспелости сорта _капусты белокочанной_
№ п/п Капуста раннеспелая Капуста позднеспелая
Вид бактерии
1 Bacillus + +
5 Micrococcus + -
7 Pseudomonas + -
8 Microbacterium + +
9 Lysinibacillus + -
10 Curtobacterium - +
Капуста раннеспелая отличается большим не только видовым, но и численным разнообразием микробного сообщества, нежели капуста позднеспелая. Количество бактерий 1,4 х 104 КОЕ/г листа - обсемененность капусты Июньская и 7 х 103 КОЕ/г листа - показатель обсеме-ненности капусты сортов Слава и Колобок. Это можно объяснить степенью сформированности кочана. На момент отбора образцов капуста Июньская находилась в фазе потребительской спелости. Следовательно химический состав продуктов экзоосмоса значительно отличался от несформировавшейся позднеспелой капусты. Питательные вещества, выделяемые растением на поверхности листа, являются достаточными для поддержания жизнедеятельности больших популяций микроорганизмов. Вещества, вымываемые из листьев растений, включают в себя различные органические и неорганические соединения, такие как сахара, органические кислоты, аминокислоты и различные соли. Обилие питательных веществ может меняться в зависимости от вида растения, возраста листа и условий выращивания. Наличие у растений механизмов, предотвращающих потери питательных веществ при гуттации, значительно обедняет питательными веществами прижизненные выделения растений, что и является служит сдерживающим фактором роста и развития микроорганизмов - эпифитов. Эпифитные микроорганизмы, в состав которых входят некоторые представители родов Pseudomonas и Bacillus, на протяжении длительной эволюции приспосабливались питаться выделениями растений. Недостаток питательных веществ на поверхности экологических ниш филлосферы - основной экологический фактор, обусловливающий развитие эпифитных микроорганизмов. В благоприятных условиях наличие питательных веществ служит определяющим фактором размера популяции эпифитов. Однако доступность этих питательных веществ значительно варьирует как на поверхности листа, так и в пределах растения в целом. Аккумуляция питательных веществ и микробная колонизация не являются статистическими процессами и, вероятно, происходят скачкообразно под воздействием факторов окружающей среды.
Биоценозы с богатым биологическим разнообразием организмов имеют более высокую стабильность и устой-
чивость к внешним и внутренним изменениям, так как вместо одних видов, по той или иной причине покинувших биоценоз, возникают дублеры, способные их заменить. Микроорганизмы обладают большим физиологическим и биологическим разнообразием. Они быстрее остальных реагируют на изменения окружающей среды. Величина биоразнообразия как внутри вида, так и биосферы в целом признана в биологии одним из главных показателей жизнеспособности как отдельного вида, так и экосистемы в целом и получила название «Принцип биологического разнообразия». Действительно, при сравнительном однообразии свойств особей внутри вида любое значительное изменение условий обитания может сильно снизить выживаемость вида, чем в случае, когда вид имеет большую величину биологического разнообразия [9, 10].
Таким образом, изучение количественного и качественного состава эпифитных бактерий некоторых культурных и сорных растений Тамбовского и Московского регионов показало, что в одинаковых условиях произрастания количество филлобактерий на разных растениях различно и определяется видом растений и фазой их развития. Большим разнообразием видов отличаются культурные растения, с сорных растений же нами было выявлено небольшое количество видов. Сравнительный анализ обилия видов в двух сравниваемых регионах выявил доминирующие виды бактерий, которые идентифицированы нами как род Bacillus и Pseudomonas. Бактерии рода Bacillus представлены 8 видами в Тамбовской области и 7 видами в Московской, а Pseudomonas - 2 видами. Характер эпифитных сообществ исследуемых растений отличается и разной степенью выравненности. Сообщества бактерий Тамбовских образцов растений характеризуются наличием большего количества случайных видов, чем популяции с московских образцов.
На надземных частях культурных растений количество бактерий увеличивается по мере роста и раз-
вития растений и достигает максимума в фазе зрелости, что показано на примере различных по скороспелости сортов капусты белокочанной.
Литература
1. Возняковская Ю.М. Микрофлора растений и урожай. - СПб., 1969.
2. Lindemann J., Upper C.D. Aerial Dispersal of Epiphytic Bacteria over Bean Plants // Applied and Environmental Microbiology, Vol. 50, № 5, 1985. - Р. 1229-1232.
3. Beattie G.A., Lindow S.E. Bacterial Colonization of Leaves: A Spectrum of Strategies // The American Phytopa-thological Society, Vol. 89, № 5, 1999. - Р. 353-359.
4. Kinkel L.L. Microbial population dynamics on leaves / Department of Plant Pathology, University of Minnesota, Saint Paul, 1997. - Р. 327-347.
5. Пархоменко Т.Ю., Пась А.Н. Использование микроорганизмов - антагонистов рода Bacillus при выращивании тюльпанов // Бюлопчш науки, 2010, 19. - С. 58-60.
6. Бороздина И.Б. Сравнительное изучение питательных сред для культивирования эпифитной микрофлоры // Вестник АГАУ, № 4 (90), 2012. - С. 31.
7. Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии. - М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 571 с.
8. Mercier J., Lindow S.E. Role of Leaf Surface Sugars in Colonization of Plants by Bacterial Epiphytes // Applied and Environmental Microbiology, Vol. 66, № 1, 2000. - Р. 369-374.
9. Евдокимова Г.А., Мозгова Н.П. Биоразнообразие почвенной биоты как фактор устойчивости почв к загрязнению // Тезисы Всероссийского совещания «Антропогенное воздействие на природу Севера и его экологические последствия», 1998.
10. Букварева Е.Н., Алещенко Г.М. Принцип оптимального разнообразия биосистем // Успехи современной биологии, 2005, Т. 125, № 4. - С. 337-348.
М08Е8-2014 Уже в 5 раз на базе старейшего аграрного вуза России РГАУ-МСХА имени
МОСКОВСКАЯ КА- Тимирязева и уникальной для Европейской территории страны Лаборатории агроэкологического мониторинга, моделирования и прогнозирования эко-\ I | \ | | \ рсл 11 Т А Я ^ ^
маЕжЖДУНАРОДНАЯ систем (созданной при поддержке Гранта Правительства Российской Федера-
ЛЕТНЯЯ ции № 11.034-31.0079) проводится Московская международная летняя эколо-
ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ гическая школа (MOSES-2014) по теме: «Смарт-технологии исследований в ШКОЛА экологии: детальный мониторинг, динамические модели, анализ рисков».
В работе школы приняли участие более 70 человек из России, из стран СНГ (Беларусь, Казахстан, Украина), а также гости из стран дальнего зарубежья (Китай, Индия, Монголия, Сербия, Замбия, Индонезия, Египет).
К проведению лекционных и практических занятий (на английском и русском языках) наряду с профессорами и профильными специалистами Тимирязевской академии по традиции привлекаются их коллеги из ведущих российских и зарубежных университетов и научных институтов. Теоретические занятия чередуются с мастер-классами, научными и полевыми экскурсиями на экологически стационары и экспериментальные объекты РГАУ-МСХА в Москве и Московской области.
Результатом научных семинаров школы станет итоговая Резолюция MOSES-2014 с перечнем актуальных проблем экологии и природопользования, а также постановка приоритетных задач межрегионального и международного сотрудничества в области экологического мониторинга, моделирования и прогнозирования проблемных экологических ситуаций. Лучшие доклады молодых ученых-слушателей школы будут рекомендованы членами оргкомитета и зарубежными учеными к опубликованию в международных экологических журналах.
