CC BY
9УДК 616.24-006.6-08; 615.277.3]-092.9 https://doi.org/10.29296/25877313-2020-06-08
© Коллектив авторов, 2020
ИССЛЕДОВАНИЕ ИНКАПСУЛИРОВАННОГО В ЛИПОСОМЫ ИНГИБИТОРА ГЛИКОЛИЗА МОНОЙОДАЦЕТАТА В КАЧЕСТВЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО АГЕНТА НА МОДЕЛИ КАРЦИНОМЫ ЛЕГКИХ ЛЬЮИС
Е.Е. Буйко
аспирант,
Исследовательская школа химических и биомедицинских технологий, Томский политехнический университет (г. Томск) Е-mail: buykoevgen@yandex.ru Д.А. Коршунов
к.м.н, науч. сотрудник, лаборатория биохимии опухолей,
Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр (г. Томск) Е-mail: ieved@ya.ru И.В. Кондакова
д.м.н., зав. лабораторией биохимии опухолей,
Научно-исследовательский институт онкологии, Томский национальный исследовательский медицинский центр (г. Томск) Е-mail:kondakova@oncology.tomsk.ru
Актуальность. Достижения в понимании молекулярных механизмов, связанных с эффектом Варбурга, стали основой для создания новых специфических антигликолитических агентов. Несмотря на их успешные доклинические испытания, многие новые противоопухолевые средства на основе ингибиторов гликолиза потерпели неудачу в клинических исследованиях, продемонстрировав системную токсичность. Эффективным подходом снижения системной интоксикации является адресная доставка лекарств с помощью липосом. Однако существуют технические сложности получения липосом для низкомолекулярных соединений, к которым относятся ингибиторы гликолиза, а также эффективности доставки к опухоли в силу особенностей биораспределения и фармакокинетики липосом.
Цель работы. Оценить противоопухолевый и антиметастатический эффекты у ингибитора гликолиза монойодацетата, погруженного в липосомы.
Материал и методы. Оценку терапевтического действия антиметаболита выполняли на мышах линии C57BL/6j, используя модель карциномы легких Льюис. В качестве референтного препарата применяли метотрексат. Липосомы получали методом экструзии. Готовые липосомы очищали от не включенного компонента методом диализа. Липосомы вводили через хвостовую вену. Результаты. Торможение роста первичной опухоли в случае применения монойодацетата в самостоятельной форме было сопоставимо с действием метотрексата, достигая в среднем 15%. При лечении липосомальными формами монойодацетата индекс торможения роста повышался до 25%. Торможение роста метастазов в легких мышей при применении и монойодацетата, и метотрексата оказалось сильнее действия препаратов на первичный очаг. Средний показатель в этих леченых группах составил 65%. Липосо-мальная форма монойодацетата, в отличие от аналогичной формы метотрексата, достоверно не тормозила рост метастазов. Выводы. Липосомальные формы монойодацетата сильнее тормозят рост первичного очага в сравнении с их действием в самостоятельной форме, но при этом в результате изменения биораспределения уменьшается антиметастатический эффект.
Ключевые слова: монойодоацетат, метотрексат, липосомальные лекарственные формы, противоопухолевый эффект.
Для цитирования: Буйко Е.Е., Коршунов Д.А., Кондакова И.В. Исследование инкапсулированного в липосомы ингибитора гликолиза монойодацетата в качестве противоопухолевого агента на модели карциномы легких Льюис. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2020;23(6):45-49. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-06-08
Разработка новых подходов лечения, которые имели бы избирательную направленность в отношении опухолевых клеток с минимальным воздействием на здоровые ткани, по-прежнему, остается серьезной проблемой онкологии [1]. Одним из наиболее важных метаболических изменений в злокачественных опухолевых клетках является
формирование эффекта Варбурга, воздействие на который можно рассматривать как один из ключевых моментов противоопухолевой терапии [2, 3]. Достижения в понимании сложных клеточных и молекулярных механизмов, связанных с эффектом Варбурга, стали основой для создания новых селективных и специфических агентов, некоторые из ко-
торых в настоящее время дошли до клинических испытаний. При этом одна из ключевых проблем, связанных с агентами, вмешивающимися в гликолиз опухоли, заключается в том, что они вмешиваются в метаболизм нормальных клеток, гликолити-ческая активность которых также является основополагающей [4]. Несмотря на успешные доклинические испытания, многие новые противоопухолевые средства, относящиеся к ингибиторам гликолиза, потерпели неудачу в I или II фазе клинических исследований, продемонстрировав системную токсичность [5]. Такая ситуация требует поиска селективных антигликолитических агентов с низкой токсичностью или использования методов, которые снижали бы побочные токсические эффекты.
Одним из подходов для снижения системного токсического действия и увеличения терапевтического индекса является адресная доставка лекарств с помощью липосом [6]. Существует множество технологий получения липосомальных форм препаратов. Каждая из них имеет свои преимущества и недостатки [7]. Ключевая проблема получения липосом заключается в использовании температур в пределах 70-80 °С и выше. Это связано с тем, что прохождение через поры мембраны тем лучше, чем выше текучесть липидов. Последняя, в свою очередь, зависит от температуры. В результате этой технической особенности до недавнего времени на рынке среди противоопухолевых препаратов был представлен в липосомальной форме лишь доксорубицин, выдерживающий высокие температурные перепады [6].
Среди известных ингибиторов гликолиза можно выделить ряд соединений, которые обладают потенциально высокой синергией с липосо-мами в силу их индивидуальных свойств. В частности, такой ингибитор, как монойодацетат обладает в большей степени кардиотоксичностью, которую можно значительно снизить, используя ли-посомальную форму препарата, за счет изменения биораспределения [8].
Цель работы — оценить противоопухолевый и антиметастатический эффекты у мо-нойодацетата, погруженного в липосомы.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Оценку терапевтического действия антиметаболита проводили на мышах линии C57BL/6j (самцы) массой 25-30 г, полученных из питомника НИИ фармакологии и регенеративной медицины
имени Е.Д. Гольдберга Томского национального исследовательского медицинского центра. Исследования выполняли с соблюдением правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ Р 51000.3 96 и ГОСТ Р 51000.4 96), международных рекомендаций «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Strasburg, 1986 г.).
Для перевивки карциномы Льюис (LLC) всем животным единовременно инокулировали в мышцу бедра по 1,5 млн опухолевых клеток LLC в 0,2 мл 0,9% NaCl. Объем бедра измеряли штангенциркулем.
В исследовании противоопухолевого действия ингибиторов гликолиза использовали мо-нойодацетат (Sigma Aldrich, США). Референтным препаратом служил метотрексат (Эбеве Фарма, Австрия). Для получения эмульсии полых липо-сом применяли 1,2-дипальмитоил-глицеро-3-фосфохолин (DPPC) и холестерол (Chol) (Sigma Aldrich, Япония). Использовали следующие молярные соотношения липидов: DPPC : Chol = 9 : 0,02. Ингибитор гликолиза монойодацетат или ме-тотрексат помещали в камеру экструдера, содержащую эмульсию липосом. Суспензию эмульсии липидных пленок и препаратов пропускали 12 раз через поликарбонатные фильтры диаметром 100 нм (Sartorius, Германия) при температуре 45-60 °С в экструдере и давлении аргона в диапозоне от 2 до 10 МПа. Полученные липосомы очищали от не включенного компонента с помощью мембраны для диализа (ROTH, США).
Препараты в липосомальной форме вводили в хвостовую вену в течение трех дней в максимально переносимой дозе. В самостоятельной форме препараты животным вводили внутрибрюшинно. Лечение животных начинали при достижении размеров опухоли 500 мм3 и колебании среднего объема в группе не более 10% (шестые сутки от момента инокуляции опухолевых клеток). Контрольные животные получали пустые липосомы или физиологический раствор в том же объеме. Животных выводили из опыта на 21-е сутки эксперимента при токсической дозе золетила (VIRBAC, Франция).
Торможение роста опухоли (ТРО) вычисляли по формулам:
(S - Spn ) х 100%
ТРОv =-
где и Боп - средний объем опухоли в контрольной и опытной группах соответственно;
ТРОм =
(NK -Non ) х 100%
Nk
где N и Коп - средняя масса опухоли в контрольной и опытной группах соответственно.
Уровень торможения метастазов (ТМ) в легких рассчитывали по формуле
ТМ =
(Мк-МоП ) х 100%
М
тактных животных на фоне опухолевого процесса летальность в группе увеличивалась до 100%. При введении метотрексата изменение МПД у животных с привитой опухолью не наблюдалось, МПД составила 6 мг/кг [10].
Результаты эксперимента о противоопухолевом действии монойодацетата и его липосомальной формы приведены в таблице и на рисунке.
где Мк и Моп - средняя масса метастазов в легких контрольной и опытной группах соответственно
[9].
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ 81ай8йса 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для оценки фармакологического действия препарата предварительно проведен поиск максимальной переносимой дозы (МПД) животными для исследуемых препаратов. Оказалось, что МПД в случае применения ингибитора гликолиза мо-нойодацетата у животных с привитой опухолью вдвое меньше таковой, чем у интактных мышей линии С57BL/6j и составила 9 мг/кг. При введении монойодацетата мышам в МПД 18 мг/кг для ин
Площадь метастазов в легких мышей на 21-е сутки: MTX - при введении метотрексата в течение трех дней в МПД; LipMTX -при терапии липосомальной формой метотрексата; MIA - при введении монойодацетата в течение трех дней в МПД; LipMIA -на фоне терапией липосомальной формой монойодацетата (* -достоверное отличие от нелеченой группы, р< 0,05; # - достоверное отличие от группы MTX, р< 0,05)
Динамика торможения роста опухоли первичной опухоли относительно роста нелеченой группы
Группа Сутки
2-е 3-и 4-е 5-е 6-е 7-е
MTX, % 29/71 11,01 19,21 16,9' 7,01 17,71
LipMTX, % 20,81,2 0,92 9,01,2 23,8',2 11,51 25,71,2
MIA, % 3,02,3 5,02 -0,62,3 12,31A3 5,8 16,0й
LipMIA, % 8,91,2,3 4,22 12,7',2,4 25,4iA4 9,61 25,01,2,4
Примечание : MTX - динамика роста опухоли при введении метотрексата в течении трех суток в МПД; LipMTX - противоопухолевая терапия липосомальной формой метотрексата; MIA - динамика роста опухоли при введении монойодацетата в течении трех суток в МПД; LipMIA - динамика роста опухоли на фоне липосомальной формы монойодацетата; 1 - достоверное отличие от нелеченой группы (р < 0,05); 2 - достоверное отличие от группы MTX (р< 0,05); 3 - достоверное отличие от группы LipMTX (р < 0,05); 4 - достоверное отличие от группы MIA (р < 0,05).
Как видно из результатов, эффективность ТРО ингибиторов монойодацетата достигало максимум 15% к концу эксперимента и было сопоставимо с действием метотрексатана конечном этапе. Наибольший терапевтический эффект метотрексата наблюдался на начальных этапах с момента введения препарата, однако в дальнейшем он снижался.
Липосомальные формы показали иную динамику. Так, эффективность противоопухолевого эффекта монойодацетата выросла до 25%. В целом терапевтический эффект оставался стабильным на протяжении всего времени наблюдения.
В случае с референтным препаратом мето-трексатом картина изменилась диаметрально в противоположную сторону. В отличие от его самостоятельной формы, противоопухолевый эффект имел нарастающий вектор от начала терапии. При этом для липосомальной формы метотрексата было выявлено увеличение токсичности, гибель животных составила 25%.
Антиметастатическая активность у ингибиторов оказалось различной. Уровни торможения метастазов в легких у монойодацетата и метотрекса-та оказались сильнее действия препаратов на первичный очаг. Средний показатель в обеих леченых группах составил 65%. (рисунок). Липосомальная форма монойодацетата в отличие от метотрексата достоверно не тормозила рост метастазов.
ВЫВОДЫ
Исследование показало, что монойодацетат обладает в достаточной степени противоопухолевой активностью на модели карциномы легких Льюис. Максимально переносимая доза монойо-дацетата оказалась выше в самостоятельной форме при том же уровне терапевтической активности химиопрепарата метотрексата, что указывает на лучшую переносимость и безопасность ингибито-
ра гликолиза. В липосомальной форме противоопухолевое действие монойодацетата, возможно за счет биораспределения, изменилось - снизилась антиметастатическая активность и увеличилось торможение роста первичного очага опухоли.
ЛИТЕРАТУРА
1. Afroze Alam, Farooq U., Ruchi Singh, Dubey V.P., Shailendra Kumar et al. Chemotherapy Treatment and Strategy Schemes: A Review. Open Acc. J. of Toxicol. 2018; 2: 555-600.
2. Hanahan D., Weinberg R.A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011; 144: 646-674.
3. Коршунов Д.А., Шашова Е.Е., Кондакова И.В. Современные представления о метаболическом перепрограммировании в злокачественных новообразованиях. Биохимия. 2019; 84: 1385-1400.
4. Коршунов Д.А., Петрова З.В., Кондакова И.В. Противоопухолевые мишени в гликолитическом метаболизме злокачественных новообразований. Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина. 2014; 25: 35-42.
5. Amoedo N.D., Obre E., Rossignol R. Drug discovery strategies in the field of tumorenergy metabolism: Limitation sbymetabolic flexibility and metabolic resistance to chemotherapy. Biochim. Biophys. Acta. 2017; 1858: 674-685.
6. Li Z., Tan S., Li S., Shen Q., Wang K. Cancer drug delivery in the nano era: An overview and perspectives (Review). Oncol. Rep. 2017; 38: 611-624.
7. Akbarzadeh A., Rezaei-Sadabady R., Davaran S., Joo S.W., Zarghami N., Hanifehpour Y., Samiei M., Kouhi M., Nejati-Koshki K. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Res. Lett. 2013; 8: 102.
8. Abe H. Regulation of Cardiac Function: Molecular, Cellular and Pathophysiological Aspects. Tokyo: Japan scientific so-cieti espress. 1984. 330 p.
9. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2013. 944 с.
10. Коршунов Д.А., Климов И.А., Иванов В.В., Кондакова И.В. Исследование ингибиторов гликолиза монойодацетата и 2-дезокиглюкозы в качестве противоопухолевых агентов в эксперименте на модели карциномы легких Льюис. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2018; 165: 644-647.
Поступила после доработки 5 мая 2020 г.
STUDY OF LIPOSOME ENCAPSULATED MONOACETATE GLYCOLYSIS INHIBITOR AS AN ANTITUMOR AGENT IN A LEWIS LUNG CARCINOMA MODEL
© Authors, 2020 E.E. Buyko
Post-graduate Student, Research School of Chemistry and Applied Biomedical Sciences, Tomsk Polytechnic University (Tomsk)
E-mail: buykoevgen@yandex.ru
D.A. Korshunov
Ph.D. (Med.), Research Scientist,
Laboratory of Tumor Biochemistry, Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center (Tomsk) E-mail: ieved@ya.ru
I.V. Kondakova
Dr.Sc. (Med.), Head of Laboratory of Tumor Biochemistry,
Cancer Research Institute of National Research Medical Center (Tomsk)
E-mail: kondakova@oncology.tomsk.ru
Background. Advances in understanding the molecular mechanisms associated with the Warburg effect have become the basis for the creation of new specific anti-glycolytic agents. Despite their successful preclinical trials, many new anticancer agents based on glycolysis inhibitors have failed in clinical trials, demonstrating systemic toxicity. An effective approach to reducing systemic intoxication is targeted drug delivery using liposomes. However, there are technical difficulties in obtaining liposomes for low molecular weight compounds, which include glycolysis inhibitors, as well as the efficiency of delivery to the tumor due to the peculiarities of liposome biodistribution and pharmacokinetics.
Aims. To evaluate the antitumor and antimetastatic effects of a monoiodoacetate glycolysis inhibitor immersed in liposomes. Material and methods. The therapeutic effect of antimetabolite was evaluated in C57BL/6j mice using a Lewis lung carcinoma model. Methotrexate was used as a reference preparation. Liposomes were obtained by extrusion. Ready liposomes were purified from the not included component by dialysis methods. Liposomes were injected through the tail vein.
Results. The inhibition of the growth of the primary tumor in iodoacetate in an independent form was comparable with the effect of methotrexate, reaching an average of 15%. Treating with liposomal forms of iodoacetate increased the growth inhibition index to 25%. Inhibition of the growth of lung metastases in iodoacetate and methotrexate was stronger than the effect of drugs on the primary tumor. The averages in these treated groups were 65%. The liposomal form of iodoacetate, in contrast to the similar form of methotrexate, did not significantly inhibit the growth of metastases.
Conclusions. Liposomal forms of iodoacetate inhibit the growth of the primary focus more strongly in comparison with their independent action, however, as a result of changes in biodistribution, the antimetastatic effect decreases.
Key words: iodoacetate, methotrexate, liposomal dosage forms, antitumor effect.
For citation: Buyko E.E., Korshunov D.A., Kondakova I.V. Study of liposome encapsulated monoacetate glycolysis inhibitor as an antitumor agent in a Lewis lung carcinoma model. Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry. 2020;23(6):45-49. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-06-08
REFERENCES
1. Afroze Alam, Farooq U., Ruchi Singh, Dubey V.P., Shailendra Kumar et al. Chemotherapy Treatment and Strategy Schemes: A Review. Open Acc. J. of Toxicol. 2018; 2: 555-600.
2. Hanahan D., Weinberg R.A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011; 144: 646-674.
3. Korshunov D.A., Shashova E.E., Kondakova I.V. Sovremennye predstavlenija o metabolicheskom pereprogrammirovanii v zlokachestvennyh novoobrazovanijah. Biohimija. 2019; 84: 1385-1400.
4. Korshunov D.A., Petrova Z.V., Kondakova I.V. Protivoopuholevye misheni v glikoliticheskom metabolizme zlokachestvennyh novoobrazovanij. Vestnik RONC im. N.N. Blohina. 2014; 25: 35-42.
5. Amoedo N.D., Obre E., Rossignol R. Drug discovery strategies in the field of tumorenergy metabolism: Limitation sbymetabolic flexibility and metabolic resistance to chemotherapy. Biochim. Biophys. Acta. 2017; 1858: 674-685.
6. Li Z., Tan S., Li S., Shen Q., Wang K. Cancer drug delivery in the nano era: An overview and perspectives (Review). Oncol. Rep. 2017; 38: 611-624.
7. Akbarzadeh A., Rezaei-Sadabady R., Davaran S., Joo S.W., Zarghami N., Hanifehpour Y., Samiei M., Kouhi M., Nejati-Koshki K. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Res. Lett. 2013; 8: 102.
8. Abe H. Regulation of Cardiac Function: Molecular, Cellular and Pathophysiological Aspects. Tokyo: Japan scientific societi espress. 1984. 330 p.
9. Rukovodstvo po provedeniju doklinicheskih issledovanij lekarstvennyh sredstv. Pod red. A.N. Mironova. M.: Grif i K, 2013. 944 s.
10. Korshunov D.A., Klimov I.A., Ivanov V.V., Kondakova I.V. Issledovanie ingibitorov glikoliza monojodacetata i 2-dezokigljukozy v kachestve protivoopuholevyh agentov v jeksperimente na modeli karcinomy legkih L'juis. Bjulleten' jeksperimental'noj biologii i mediciny. 2018; 165: 644-647.
