CC BY
118
УДК 636.4:577.29:57.085.2 Ил. 3. Библ. 12.
ИССЛЕДОВАНИЕ IN VITRO БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Федулова Л.В., канд. техн. наук, Кашинова Э.Б.
ФГБНУ «ВНИИМП им. В.М. Горбатова»
IN VITRO STUDY OF THE BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES OF ANIMAL ORIGIN
Fedulova L.V., Kashinova E.B.
The V.M. Gorbatov All-Russian Meat Research Institute
Ключевые слова:
биологически активные вещества, in vitro, индекс площади, эксплантат желудка, эксплантат кишечника
Реферат
Приведены результаты исследования биологической активности in vitro фракций смеси экстрактов поджелудочной железы, слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки свиней с различной молекулярной массой (более 50 кДа, от 50 до 5 кДа и менее 5 кДа) в концентрации 100 нг/мл на эксплантатах желудка и кишечника 10-дневных куриных эмбрионов. Показано, что добавление в питательную среду фракций приводило к стимуляции роста эксплантатов тканей желудка куриных эмбрионов. Наибольшей биологической активностью обладают низкомолекулярная фракция с молекулярной массой менее 5 кДа. Отмечено достоверное повышение индекса площади (ИП) эксплантатов тканей желудка и кишечника на 60 % и 50 % относительно контроля с образованием монослоя эпителиоцитов, характеризующиеся высокой пролиферативной активностью. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 16-16-10073).
Введение
В настоящее время биотехнология, сформировавшаяся как самостоятельная наука в начале XX в., интенсивно развивается, способствуя промышленно-техно-логическому прорыву. За последние годы разработано большое количество новых методов исследования и интенсификации процессов, открывающих ранее неизвестные возможности в получении биопрепаратов, способов выделения, идентификации и очистки биологически активных веществ, а также новых видов продуктов питания. Этому послужили выдающиеся открытия ученых в области изучения ферментов, биохимической генетики, молекулярной биологии, биоэнергетики, эмбриологии и клеточной биологии [1]. А ведь зачастую, настоящие научные открытия предугадывали писатели в своих фантастических произведениях. В качестве примеров можно привести роман «Вечный хлеб» (1929 г.)
Keywords:
biologically active substances, in vitro, area index, stomach explants, intestine explants
Summary
The paper presents the results of the in vitro study on the biological activity of the fractions of the mixture of the porcine pancreas, gastric mucosa and duodenum extracts with different molecular weights (more than 50 kDa, from 50 to 5 kDa and less than 5 kDa) with a concentration of 100 ng/ml on the stomach and intestine explants from the 10-day-old chicken embryos. It is shown that addition of the fractions into the growth medium led to the stimulation of the growth of the stomach tissue explants from the chicken embryos. The low molecular weight fraction with the molecular weight less than 5 kDa had the highest biological activity. We noticed the reliable increase in the area index of the explants of the stomach and intestine tissue by 60 % and 50 % relative to the control with the development of the monolayer of the epithelial cells, which are characterized by high proliferative activity. This work was supported by the Russian Science Foundation (project No. 16-16-10073).
Александра Романовича Беляева, в котором описано изобретение регенерирующей в геометрической прогрессии питательной студенистой субстанции, похожей на лягушачью икру; произведений Герберта Уэллса («Пища богов», 1904 г.) и Айзека Азимого («Памяти отца», 1959 г.), в которых описаны открытия веществ, позволяющих ускорять рост живых существ в десятки раз; Артура Чарлза Кларка — сюжет рассказа которого основывается на получении, посредством химического синтеза, еды в виде различных субстанций — при этом особую популярность получает новый продукт, имитирующий вкус мяса, исчезнувших видов животных, неопознанный биохимиками будущего.
Сегодня особую актуальность приобретают методы in vitro («в пробирке») — эксперименты проводятся вне живого организма, с использованием культур живых клеток или бесклеточных моделях, применяю-
щиеся в различных областях: молекулярной биологии, биохимии, фармакологии, медицине, генетике и др. [2].
Наиболее ярким примером эксперимента in vitro может служить технология получения «мяса из пробирки». Впервые, в научном сообществе идея создания мяса, без необходимости убивать животных, используя стволовые клетки, была высказана в середине XIX века голландским студентом Медицинского университета Виллем ван Элен (Willem van Eelen), который долгое время (на протяжении нескольких десятилетий) пытался воплотить свою мечту, но так и не достиг значимых результатов. Стоит отметить, что мировая общественность обратила внимание на его исследования лишь в 1999 году, после того, как он запатентовал свою идею мяса неживотного происхождения. Спустя 10 лет, в 2011 году под руководством Марка Поста, главы факультета сердечно-сосудистой физиологии Маастрихтского университета Голландии, благодаря вложениям инвестора, в лице основателя Google Сергея Брина, была начата работа по проекту Cultured Beef. В России первые исследования по разработке перспективных методов получения культуральных стволовых клеток (ММСК) in vitro были начаты академиком Роговым Иосифом Александровичем, в последствии научно-исследовательские работы привели к получению биомассы, состоящей из клеток мышечной ткани [3, 4]. Исследования выделенных из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота клеточные популяции с фенотипом, подобным ММСК, выявили у них способность к формированию клеток жировой, костной и мышечной тканей при культивировании in vitro [5]. Исследование фракционного и аминокислотного состава клеточной биомассы показали ее сходство с белками мышечной ткани говядины и возможности применения ММСК в качестве пищевого белкового ингредиента [6].
За последние годы методы in vitro находят все большее применение в различных областях. Возможность использования клеточных культур в экспериментах в настоящее время широко используется с целью прогнозирования токсических и терапевтических эффектов лекарственных средств, а также биологически активных веществ животного происхождения. Это связано с возможностью оценить взаимодействие изучаемых веществ с клеткой в «чистом виде», выявлять изменения клеточных и субклеточных структур, которые в условиях целостного организма могут маскироваться или видоизменяться компенсаторными и регуляторными механизмами единой системы [7].
В настоящей статье приведены результаты исследования активности биологически активных веществ (БАВ) животного происхождения in vitro.
Материалы и методы
Исследуемыми образцами являлись смеси экстрактов поджелудочной железы, слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки различной молекулярной массы (более 50 кДа, от 50 до 5 кДа и менее 5 кДа). Экстракты получали традиционным способом [8, 9], смешанные экстракты (1:1:1) фракциониро-
вали на установке Vivaflow 200 (Sartorius, Германия) с использованием полиэфирсульфоновых мембран с размерами пор 5 кДа и 50 кДа при давлении 2,5 бар. Полученные фракции хранили при минус 40 °С.
Исследование биологической активности фракций проводили на 60 эксплантатах тканей желудка и 60 эксплантатах тканей кишечника 10-дневных куриных эмбрионов, инкубируемых при 38,5 °С в увлажненной атмосфере в CO2 — инкубаторе (Lamsystems, Россия). После отделения эксплантатов — фрагментов тканей желудка и кишечника куриных эмбрионов, их помещали в чашки Петри с коллагеновым покрытием (SPL Lifesciences, Корея) и инкубировали 15-20 минут при 37 °С. После чего к эксплантатам добавлялась питательная среда (35 % раствора Игла, 25 % феталь-ной сыворотки теленка, 35 % раствора Хенкса, 5 % куриного эмбрионального экстракта, 0,6 % глюкозы, 0,5 ед/мл инсулина, 100 ед/мл бензил — пенициллина, 2 мМ глютамин) [10], в которую вносили исследуемые фракции биологически активной веществ в концентрации 100 нг/мл и инкубировали при 37,8 °С в течение 48 часов. В качестве контроля использовали эксплантаты, культивируемые в условиях только питательной среды. Часть эксплантатов после инкубирования помещали на предметные стекла с адгезивным покрытием и окрашивали гематоксилин — эозином.
Анализировали эксплантаты с помощью фазово-контрастного инвертируемого микроскопа (ЛОМО, Россия), окрашенные препараты на световом микроскопе (Carl Zeiss, Германия). Критерием биологической активности служило определение интенсивности роста эксплантатов посредством определения индекса площади (ИП), который рассчитывали как соотношение площади всего эксплантата, включая периферическую зону роста, к исходной площади эксплантата (центральная зона). За условную единицу площади принимали квадрат окуляр — сетки микроскопа (сторона квадрата при увеличении 3,5 х 10 равнялась 150 мкм). Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100 % [11].
Результаты исследования
В первые сутки культивирования тканей желудка и кишечника наблюдалось распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке, миграция клеток из эксплантата, адгезия апоптозных клеток разрушенной ткани, выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток, составляющих зону роста от края эксплантата.
По истечению 48 часов инкубирования при анализе эксплантатов отмечены хорошо выраженные зоны — центральная, представленная немигрирующими плотно расположенными эпителиоцитами, и периферическая (зона роста) — монослой клеток, формирующийся мигрирующими и пролиферирующими эпителиоцитами.
Добавление в питательную среду фракций приводило к стимуляции роста эксплантатов тканей желудка куриных эмбрионов. Отмечено, что низкомолекулярная фракция (Мм менее 5 кДа) способствовала достоверному увеличению площади периферической
Рисунок 1. Влияние исследуемых фракций биологически активных веществ на рост эксплантатов тканей желудка куриного эмбриона. Условные обозначение: ИП — индекс площади в % к исходной площади эксплантата
зоны эксплантатов тканей желудка куриных эмбрионов — индекс площади (ИП) составил 60 ± 1,6 % (п =20) по отношению к контрольным эксплантам. Образцы БАВ высокой молекулярной массой (более 50 кДа) и средней молекулярной массы (от 50 до 5 кДа) обладали менее выраженной активностью — наблюдалось незначительное увеличение роста монослоя эксплантатов — ИП составил 12 ± 3,2 % и 18, 8 ± 5,9 % соответственно (п = 40) (рисунок 1).
Исследования биологической активности фракций на эксплантатах тканей кишечника куриных эмбрионов показали, что исследуемые образцы по-разному влияют на образование монослоя и пролиферативную активность клеток тканей кишечника. Отмечено, что при добавлении в питательную среду высокомолекулярной фракции (Мм более 50кДа) ИП эксплантатов кишечника увеличивалось на 22,6 ± 2,9 % (п=20) относительно контрольного значения. Достоверного увеличения ИП эксплантатов тканей кишечника при добавлении в питательную среду фракции средней молекулярной массы (от 50 до 5 кДа) отмечено не было — составило в 1,8 ± 1,1 % (п = 20). Наибольшая активность выявлена у образцов низкомолекулярных фракций (Мм менее 5кДа) — ИП
Рисунок 2. Влияние исследуемых образцов на рост эксплантатов тканей кишечника куриного эмбриона.
Условные обозначение: ИП — индекс площади в % к исходной площади эксплантата
достоверно увеличивался на 50,8 ± 2,2 % по отношению к контрольному значению (n = 20) (рисунок 2).
Микроскопическое исследование препаратов фиксированных и окрашенных эксплантатов тканей желудка и кишечника, показало, что периферическая зона роста органных культур при добавлении исследуемых образцов представлена плотным монослоем клеток плоского эпителия. Стоит отметить, что при добавлении в среду среднемолекулярной фракции (от 5 до 50 кДа) на фиксированных препаратах эксплантатов желудка и, в особенности, кишечника, практически отсутствует зона роста и пролиферация эпителиоцитов. При этом наиболее плотный монослой пролиферирующих и мигрирующих клеток эпителия отмечены у эксплантатов, в питательную среду которых добавляли низкомолекулярную фракцию с молекулярной массой менее 5 кДа (рисунок 3).
Выводы
В результате проведенных исследований была показана возможность применения метода in vitro в качестве альтернативного метода определения биологической активности БАВ животного происхождения.
3Б
rj 1 I 'J , . . -L
Л'г'-д:Jr-. a",. " tri r.j V.-!-+,-.
• - •......
Рисунок 3. Микроскопическое исследование эксплантатов тканей желудка (А) и кишечника (Б) куриного эмбриона. Увеличение 20х. Условные обозначения: 1 — высокомолекулярная фракция БАВ (Мм более 50 кДа); 2 — среднемолекулярная фракция (от 50 до 5 кДа); 3 — низкомолекулярная фракция (менее 5 кДа)
Выявлено, что наибольшей биологической активностью обладает низкомолекулярная фракция (Мм менее 5 кДа) — индекс площади эксплантатов желудка и кишечника куриного эмбриона превышал 40 % относительно контрольных значений и составлял 60,2 ± 1,6 % для эксплантатов желудка и 50,8 ± 2,2 % для эксплантатов кишечника. Высоко- и средне-молекулярные фракции (Мм более 50 кДа и от 50 до 5 кДа) незначительно стимулировали рост эксплантатов как тканей желудка, так и тканей кишечника — ИП не превысил 20 %. Таким образом, можно сделать предположение, что низкомолекулярная фракция БАВ живот-
ного происхождения, содержащая преимущественно пептиды и аминокислоты, обладает регуляторным действием, способствует поддержанию гомеостаза — устанавливая равновесие между ростом, дифферен-цировкой, восстановлением и гибелью клеток [12].
© КОНТАКТЫ:
Федулова Лилия Вячеславовна а fedulova@vniimp.ru
Кашинова Эльта Басанговна а vivarium@vniimp.ru V +7(495)676-9211
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Северин Е.С. Биохимия / Е.С. Северин / М.: ГЭОТАР-МЕД. — 2004. — 738 с.
2. Rothman, S. S. Lessons from the living cell: the culture of science and the limits of reductionism / Rothman, S. S. / New York: McGraw%Hill, 2002. 272 pp.
3. Рогов И.А. Способ получения мясного продукта / И.А. Рогов, А.Ф. Валихов, Н.Я. Демин, Н.Г. Кроха, А.Б. Лисицын, Г.В. Семёнов, Е.И. Титов, В.А. Тутельян, С.И. Рогов, Л.К. Эрнст: заявитель и патентообладатель ФАО ГОУ ВПО Московский государственный университет прикладной биотехнологии.// Патент РФ 2314719. — заявл. 06.06.2006; бюл. №2.
4. Рогов И.А. Способ выращивания мяса in vitro. Обзор / И.А. Рогов, И.М. Волкова // Биозащита и биобезопасность. 2012. Т. IV, № 3 (12). С. 26-32.
5. Рогов И.А. Дифференцировка мультипотентных мезен-химных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота, в клетки мышечной ткани in vitro / И.А. Рогов, И.М. Волкова, К.В. Кулешов, И.П. Савченкова // Сельскохозяйственная биология. — 2012. — № 6. — С. 66-72.
6. Лисицын А.Б. Мясо in vitro как перспективный источник полноценного белка / И.А.Рогов, А.Б. Лисицын, К.Г. Та-ранова, И.М. Волкова // Все о мясе. — 2013. — № 4. С. 22-25.
7. Федулова Л.В. Перспектива применения методов ex vivo, in vitro и in vivo для оценки функциональных свойств мясных ингредиентов и продуктов питания / Л.В. Федулова, А.А. Сорокина // Международная научно-практическая конференция, посвященная памяти Василия Матвеевича Горбатова. — 2015. — №1. — С. 433-436.
8. Чернуха И.М. Изучение природы действующего вещества препарата «Колимак» / И.М. Чернуха, Л.А. Люблинская, Л.В. Федулова, А.Н. Макаренко, Е.А. Тимохина // Все
0 мясе. — 2013. — № 4. — С. 14-17.
9. Chernukha I.M. Design of the Treatment and Preventive Meat Product «Dinormin»/ I.M.Chernukha, L.V.Fedulova, E.R.Vasilevskaya, A. N. Makarenko //Вкник проблем бюлогп
1 медицини. — 2015. — Випуск 3, Том 1 (122). — С. 227-232.
10. Лопатина Е. В. Исследование участия Na/K-АТФазы в регуляции роста эксплантатов ткани сердца в органоти-пической культуре / Е. В. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2005. — Т.140. — № 8. — С. 150-152.
11. Цырлин В. А. Влияние ss-адреноблокаторов на рост кар-диомиоцитов в культуре ткани сердца / В.А. Цырлин // Артериальная гипертензия. — 2006. — Т. 12.- № 3. — С. 248-251.
12. Чугунов А.О. Неизвестные пептиды. / А.О. Чугунов // Наука и жизнь. — 2010. — №10. — C. 26-31.
REFERENCES:
1. Severin E.S. Biochimia [Biochemistry] / E.S. Severin / M.: GEOTAR-MED. — 2004. — 738 s.
2. Rothman, S. S. Lessons from the living cell: the culture of science and the limits of reductionism / Rothman, S. S. / New York: McGrawHill, 2002. 272 pp.
3. Rogov I.A. Sposob poluchenija mjasnogo produkta [Meat product's obtaining process] / I.A. Rogov, A.F. Valihov, N.Ja. Demin, N.G. Kroha, A.B. Lisicyn, G.V. Semjonov, E.I. Titov, V.A. Tutel'jan, S.I. Rogov, L.K. Jernst: zajavitel' i patentoobla-datel' FAO GOU VPO Moskovskij gosudarstvennyj universi-tet prikladnoj biotehnologii.// Patent RF 2314719. — zajavl. 06.06.2006; bjul. № 2.
4. Rogov I.A. Sposob vyrashhivanija mjasa in vitro. Obzor [Meat cultivating method in vitro. Overview] / I.A. Rogov, I.M. Volkova // Biozashhita i biobezopasnost'. 2012. T. IV, № 3 (12). S. 26-32.
5. Rogov I.A. Differencirovka mul'tipotentnyh mezenhimnyh stvolovyh kletok, vydelennyh iz kostnogo mozga i zhirovoj tkani krupnogo rogatogo skota, v kletki myshechnoj tkani in vitro [Differentiation of multipotent mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and adipose tissue of cattle in muscle cells in vitro] / I.A. Rogov, I.M. Volkova, K.V. Kuleshov, I.P. Savchenkova // Sel'skohozjajstvennaja biologija. — 2012. — № 6. — S. 66-72.
6. Lisitsyn A.B. Mjaso in vitro kak perspektivnyj istochnik polnocennogo belka [In vitro meat as a perspective source of complete protein] / I.A.Rogov, A.B. Lisitsyn, K.G. Taranova, I.M. Volkova // Vse o mjase. — 2013. — № 4. S. 22-25.
7. Fedulova L.V. Perspektiva primenenija metodov ex vivo, in vitro i in vivo dlja ocenki funkcional'nyh svojstv mjasnyh ingre-dientov i produktov pitanija [Ex vivo, in vitro and in vivo methods application to assess the functional properties of meat ingredients and food] / L.V. Fedulova, A.A. Sorokina // Mezhdunarodnaja nauchno-prakticheskaja konferencija, posvjashhennaja pamjati Vasilija Matveevicha Gorbatova. — 2015. — №1. — S. 433-436.
8. Chernukha I.M. Izuchenie prirody dejstvujushhego vesh-hestva preparata «Kolimak» [The study of the nature of the active ingredient of the drug «Kolimak»] / I.M. Chernuha, L.A. Ljublinskaja, L.V. Fedulova, A.N. Makarenko, E.A. Timo-hina // Vse o mjase. — 2013. — № 4. — S. 14-17.
9. Chernukha I. M. Design of the Treatment and Preventive Meat Product «Dinormin» / I.M. Chernukha, L.V. Fedulova, E. R.Vasilevskaya, A. N. Makarenko //Visnik problem biologii i medicini. — 2015. — Vipusk 3, Tom 1 (122). — S. 227-232.
10. Lopatina E.V. Issledovanie uchastija Na/K-ATFazy v regulja-cii rosta jeksplantatov tkani serdca v organotipicheskoj kul'ture [The study of participation of Na/K-ATPase in the heart tissue explants growth regulation in organotypic culture] / E. V. // Bjulleten' jeksperimental'noj biologii i mediciny. — 2005. — T. 140. — № 8. — S. 150-152.
11. Cyrlin V. A. Vlijanie ss-adrenoblokatorov na rost kardiomioc-itov v kul'ture tkani serdca [Ss-blockers effect on the cardiomy-ocytes cultivation in heart tissue culture] / V.A. Cyrlin // Arteri-al'naja gipertenzija. — 2006. — T. 12. — № 3. — S. 248-251.
12. Chugunov A.O. Neizvestnye peptidy. [Unknown peptides]/ A.O. Chugunov // Nauka i zhizn'. — 2010. — №10. — C. 26-31.
