CC BY
238
Химия растительного сырья. 2011. №4. С. 83-87.
УДК 668.411:674.032.14:547.972
ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА СМОЛЫ ДРЕВЕСИНЫ ЛИСТВЕННИЦЫ
© Л.А. Остроухова1, В.А. Ралдугин2, В.А. Бабкин1, H.A. Онучина1, А.А.Левчук1
1 Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, ул. Фаворского, 1,
Иркутск, 664033 (Россия), e-mail: babkin@irioch.irk.ru
2Новосибирский институт органической химии им. H.H. Ворожцова СО РАН,
пр. Академика Лаврентьева, 9, Новосибирск, 630090 (Россия)
Методами высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии изучен групповой, качественный и количественный состав смолистых веществ ядровой древесины лиственницы, являющихся отходом при производстве дигид-рокверцетина. Впервые в составе экстрактивных веществ биомассы лиственницы обнаружено дитерпеновое соединение - изоцемброл, обладающее свойствами гормонального регулятора роста растений. Химический состав смолистых веществ позволяет прогнозировать высокую биологическую активность изученного продукта и определить направление его практического использования.
Ключевые слова: ядровая древесина лиственницы, смола, экстрактивные вещества, химический состав.
Исследование выполнено врамках программы «Комплексная безотходная переработка биомассы лиственницы».
Введение
При производстве дигидрокверцетина из ядровой древесины лиственницы (Larix sibirica Ledeb.) в качестве побочного продукта выделяется значительное количество экстрактивных смолистых веществ. Суммарная фракция этих веществ, по предварительным данным, обладает высокой биологической активностью, проявляет ранозаживляющее и противоожеговое действие. Для определения путей практического использования препарата на основе этого комплекса необходимо полнее изучить его химический состав, что позволит определить параметры его сертификации.
Экспериментальная часть
Динамику содержания экстрактивных веществ в древесине лиственницы (Larix sibirica Ledeb) определяли на живом дереве, произрастающем в Иркутском районе. Возраст дерева 120-130 лет.
Время заготовки древесины лиственницы (Larix sibirica Ledeb.) - октябрь 2009 г. Место заготовки -Балаганский район Иркутской области. Для работы использовали щепу, полученную при измельчении ядровой древесины лиственницы. Для изготовления щепы применяли окоренную комлевую часть дерева (баланс). Максимальная длина баланса от комля 2 м, наименьший диаметр баланса 350 мм.
Экстракцию щепы проводили этилацетатом с последующим удалением из экстракта флавоноидов по способу [1]. Исследовали оставшуюся смолистую часть экстракта.
Экстракт разделяли на кислую и нейтральную части обработкой насыщенным раствором бикарбоната натрия или 0,5 раствором NaOH.
Анализ хромато-масс-спектрометрией проведен системой Agilent 5975 (Москва, ФГПУ «Антидопинговый центр»). Предварительно образец силилировали №метил-^триметилсилил)-трифторацетамидом для придания летучести кислотам и другим ОН-содержащим соединениям. Опознание соединений проводилось через базы данных: NISTO2.L , wiley7n.1 , PMW_BIG.L .
* Автор, с которым следуетв ести переписку.
84
Л. А. Остроухова, В.А. Ралдугин, В.А. Бабкин, H.A. Онучина, А.А.Левчук
Анализ ГЖХ осуществляли на хроматографе «Хром 5»; в режиме линейного программирования температуры колонки (60-250 °С, 3°/мин.); жидкая фаза силикон ХЕ-60, 5% хроматон N-AW; колонка 2,5 м х 3 мм; газ-носитель гелий, 60 мл/мин. Образцы предварительно метилировали диазометаном.
Для разделения и идентификация флавоноидов, фенолокислот и лигнанов применяли тонкослойную хроматографию (ТСХ), колоночную хроматрографию, ВЭЖХ.
ТСХ выполняли с использованием пластинок Silicia gel 60 F254. Хроматограммы развивали в системе хлороформ - метанол (4 : 1). Обнаружение веществ на хроматограммах проводили реагентами, дающими с анализируемыми веществами окрашенные соединения либо флуоресценцию в УФ-свете: а) диазотирован-ную сульфаниловую кислоту (ДСК, 0,1 гв 20 мл 10% раствора NaHCO3); б) 5% раствор AlCl3 в 50% этиловом спирте.
Обращенно-фазная ТСХ выполнялась на пластинках Сорбтон-2 в системе ацетонитрил - 2% водный раствор уксусной кислоты (2 : 3), проявитель - 5% раствор AlCl3 в 50% этаноле.
Анализ методом ВЭЖХ проводили в следующих условиях: хроматографическая система: Agilent 1260 с УФ-детектором и обращенно-фазной колонкой. Аналитическая длина волны 280 нм (лигнаны), 270, 290 нм (флавоноиды), 254, 280, 320 нм (фенолокислоты). Идентификацию отдельных пиков на хроматограммах проводили по временам удерживания, УФ-спектрам и ко-хроматографией с аутентичными образцами. Колонка -Zorbax CB Ci8 5цш, 250 x 4.6 mm. Подвижная фаза - градиент: ацетонитрил (20-50 об.) в 2% уксусной кислоте. Скорость потока подвижной фазы - 1,3мл/мин. Петля: 20 д1.
Количественное содержание дигидрокверцетина определяли методом ВЭЖХ в приведенных условиях с использованием в качестве внешнего стандарта Государственного стандартного образца ДКВ (ФС 42-3853-99).
Обсуждениерезультатов
Этилацетатный экстракт смолистых веществ, оставшийся после извлечения основного количества флавоноидов [1], был разделен на твердую и жидкую смолу, из которых в свою очередь обработкой растворителями с возрастающей полярностью получены отдельные фракции. Количественное содержание фракций смолистых веществ представлено в таблице 1.
Следует заметить, что соотношение твердой и жидкой фракции смолы непостоянно и изменяется в зависимости от времени года заготовки сырья. Установлено, что минимальное содержание экстрактивных веществ в древесине наблюдается в ноябре-декабре, возрастает к июлю, достигая максимума в августе (рис. 1). Наибольшее содержание жидкой смолы наблюдается в весенне-летний период.
Таблица 1. Количественное содержание отдельных фракций смолистых веществ древесины лиственницы
Растворитель Состав жидкой фракции, % Состав твердой фракции, %
Гексан 95,5 43,1
Бензол 1.2 9,2
Хлороформ 0,9 2,5
Горячая вода 0,2 2,7
Остаток смолы 1,2 42,5
6 5 4
о
И 3
н 3
* 2
0s
1 0
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Месяц (январь-декабрь)
Рис. 1. Содержание экстрактивныхвеществ в древесине лиственницы
Таблица 2. Количественное содержание смоляных и
жирных кислот в гексановой фракции смолы древесины лиственницы
Гексановая фракция смолистых веществ как жидкой, так и твердой фракции состоит из нейтральных соединений (37%) и смеси карбоновых кислот (63%), которые представлены известными дитерпеновыми (смоляные кислоты) и алифатическими жирными кислотами.
Изучение кислой части гексановой фракции смолы проведено ГЖХ анализом метиловых эфиров кислот и хромато-масс-спектрометрическим методом.
При анализе образца хромато-масс-спектрометрией в диапазоне с временами выхода от 15,5 до 22,5 мин выделено 25 пиков с интенсивностью 0,5% и более. Все их можно разделить на три группы: 1) жирные кислоты ~14%; 2) смоляные кислоты ~73%; 3) группа веществ с молекулярной массой от 358 до 485 (с учетом триметилсилильной защиты) ~13%. Данные по составу кислой фракции приведены в таблице 2.
Анализ кислой фракции методом ГЖХ подтвердил качественный состав жирных и смоляных кислот.
Нейтральную часть жидкой фракции изучали методом ГЖХ, предварительно проведя метилирование соединений диазометаном. Сумма нейтральных соединений гексановой фракции смолы имеет сложный состав. В таблице 3 приведены результаты группового анализа образца смолы.
В живице лиственницы [2] и древесной смоле присутствуют бициклический спирт лабданового ряда эпиманоол и характерные для лиственницы дитерпеновые соединения лариксол и лариксацетат.
Название Содержание, % от веса гек-
сановой фракции смолы
Жирные кислоты
Гексадекановая 3,21
Гептадекановая 0,82
9,12(7,7)-октадекадиеновая 4,11
Олеиновая 2,15
Нонадекановая 0,11
Смоляные кислоты
Пимаровая 1,26
Изопимаровые 19,28
Сандаракопимаровая 13,91
Дегидроабиетиновая 3,18
Абиетиновая 13,96
Палюстровая/левопимаровая 10,86
Неоабиетиновая 10,18
OH
OR
OH
R =H лариксол; R = Ac лариксацетат
Эпиманоол
В нейтральной части смолистых веществ лиственницы обнаружено неизвестное ранее для лиственницы дитерпеновое соединение - изоцемброл, имеющее структуру 2 и обладающее свойствами гормонального регулятора роста растений [3]. Это необычное по структуре вещество характерно для кедра сибирского, способ его выделения из кедровой смолы (живицы) был защищен ранее авторским свидетельством СССР.
Таблица 3. Групповой состав нейтральных соединений смолы древесины лиственницы
Название отдельных фракций нейтральных соединений смолы Содержание (% от веса нейтральной фракции)
Смесь moho-, сескви- и дитерпеновых углеводородов 15,1
Карбонильные соединения (дитерпеновые альдегиды, натив- 25,4
ныеметиловые эфиры смоляных кислот, сложные эфиры
Р-ситостерина и кампестерина с высшими жирными кислотами,
триглицериды)
Смесь дитерпеновых спиртов (изоцемброл, 4-эпиизоцемброл 12,4
и эпиманоол)
Полярные спирты (дитерпеновые спирты, соответствующие 20,0
известным дигерпеновым кислотам живицы лиственницы,
а также фитостерины - Р-ситостерин и кампестерин
Полярные дитерпеновые соединения - лариксол, лариксацетат, 27
известные также для лиственничной живицы
86
Л. А. Остроухова, В.А. Ралдугин, В.А. Бабкин, Н.А. Онучина, А.А.Левчук
Изоцемброл, выделенный из смолы древесины лиственницы, представляет собой смесь двух соединений одинаковой химической структуры, различающихся только стереохимией при одном из углеродных атомов. Эти вещества тождественны друг другу по своей биологической активности и потребительским свойствам (изоцемброл и 4-эпиизоцемброл, формулы 1 и 2 соответственно). При попытке прямого определения спиртов 1 и 2 методом ВЭЖХ их пики накладываются на пики других, близких к ним по хромато-графическим свойствам компонентов смолы, и поэтому прямой метод анализа методом ВЭЖХ практически невозможен.
Нами показано, что количественное превращение (дегидратации) изоцемброла и 4-эпиизоцемброла в известный углеводород цембрен (формула 3) с последующим количественным определением содержания образовавшегося цембрена позволяет сделать на этой основе расчет количественного содержания смеси изоцембролов 1 и 2. Цембрен проявляет сильное поглощение в УФ-спектре (Хтах 240 пт), его пик на хроматограмме ВЭЖХ не совпадает с пиками других компонентов смолы, поэтому легко поддается количественной обработке.
ОН
ОН
1 2 3
При этом предварительно проводится определение содержания нативного цембрена, уже присутствующего в смоле, которое учитывается при расчете количественного содержания суммы определяемых спиртов 1 и 2.
Фракция твердых смолистых веществ, растворимых в хлороформе, также была разделена на кислую и нейтральную части.
В кислой части во фракции фенолкарбоновых кислот хроматографическими методами (ТСХ. БХ, ВЭЖХ) и сравнением с аутентичными образцами идентифицированы ванилиновая и феруловая кислоты.
Из нейтральной части фракции хроматографированием на колонке с силикагелем (система: петро-лейный эфир - этилацетат, 1 : 1) выделена фракция лигнановых соединений, состоящая из четырех индивидуальных представителей. Рехроматографией выделено и идентифицировано методами ТСХ и ВЭЖХ, сравнением с известными образцами четыре лигнановых соединения: конидендрин, пинорезинол, ларици-резинол и секоизоларицирезинол. Среди лигнановых соединений количественно преобладают ларицирези-нол и секоизоларицирезинол. Ранее в ацетоновом экстракте ядровой древесины лиственницы были обна-ружены еще два соединения этого класса: 3,4-диванилилтетрагидрофуран и изоларицирезинол [4]. Следует отметить, что выделенные из древесины фенолокислоты и все лигнановые соединения имеют одинаковый гваяцильный тип замещения ароматического фрагмента, это позволяет предположить, что названные выше фенолокислоты являются генетическими предшественниками лигнанов.
Наличие лигнановых соединений в смолистой фракции древесины лиственницы тем более интересно, что по последним литературным данным большинство лигнанов - мощные антиоксиданты, со степенью воздействия такой же силы, или даже сильнее, чем обладает большинство флавоноидов. К тому же показано, что экстракты из древесины нескольких видов деревьев обладают более сильной степенью воздействия, чем отдельные соединения [5]. В институте цитологии и генетики СО РАН была установлена биологическая активность смолы лиственницы, отличная от активности дигидрокверцетина: смола обладает не только ростовыми свойствами, но и положительно влияет на силу и рост корневой системы растений.
При изучении фенольных компонентов смолистого экстракта, растворимых в горячей воде, мы обнаружили присутствие пяти соединений флавоноидной природы: дигидрокверцетина (ДКВ), дигидро-кемпферола, эриодиктиола, нарингенина и пиноцембрина, характерных для древесины лиственницы (рис. 2). Содержание ДКВ - 12% , дигидрокемпферола -1,3% от веса смолистых веществ, остальные флавонои-ды обнаружены в следовых количествах (< 0,5 %).
Рис. 2. ВЭЖ хроматограмма флавоиоидов твердой фракции смолистых веществ древесины лиственницы (Х=290 нм)
В твердом остатке смолы содержится до 30% ранее описанного нами нового полимера, мономерной единицей которого является флаванонол дигидрокверцетин. На основе данных ЯМР 13С установлено, что мономерные единицы полимера связаны межфлавановой связью С6-С8 [4].
Выводы
Методами высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии изучен групповой, качественный и количественный состав смолистых веществ древесины лиственницы (Ьапх вШпса Ledeb.), являющихся отходом при производстве дигидрокверцетина. В нейтральной части смолистых веществ обнаружено неизвестное ранее для лиственницы дитерпеновое соединение - изоцемброл, обладающее свойствами гормонального регулятора роста растений. Химический состав смолистых веществ позволяет прогнозировать высокую биологическую активность изученного продукта и определить направление его практического использования.
Список литературы
1. Патент №2158598 (РФ) Способ получения дигидрокверцетина / В.А. Бабкин, Л.А. Остроухова, Д.В. Бабкин, Ю.А. Малков // БИ. 2000. №31.
2. Радбиль Б.А., Паршуков А.С., Пентегова В.А. и др. Смола нейтральная лиственничная - новый ценный лесохимический продукт // Гидролизная илесохимическая промышленность. 1985. №6. С. 10-11.
3. Ралдугин В.А., Козлов В.Е., Чекуров В.М. и др. Цембрановые спирты - новый тип гормональных ингибиторов роста растений // Химия природных соединений. 1981. №6. С. 733-738.
4. Иванова С.З., Федорова Т.Е., Остроухова Л.А. и др. Полимер дигидрокверцетина из древесины лиственницы сибирской и даурской // Химия растительного сырья. 2001. №4. С. 21-24.
5. Лаптева К.И., Тюкавкина Н.А., Рыжова Л.И. Лигнановые соединения из древесины Larix Daurica и L. Sibirica // Химия природных соединений. 1971. №6. С. 829.
6. Pietarinen S.P., Willfor S.M., Ahotupa M.J. at all. Knotwood and bark extracts: strong antioxidants from waste materials // Journal of wood science. 2006. V. 52. №5. Pp. 436-444.
Поступило в редакцию 3 июня 2011 г.
