CC BY
162018, том 21, № 2 УДК 612.12-074:541.69
ИССЛЕДОВАНИЕ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ СЫВОРОТКИ КРОВИ В ПРИСУТСТВИИ НАНОКОМПОЗИТА ПОЛИСТИРОЛ/БЕНТОНИТ/
МАГНЕТИТ IN VITRO
Ситникова О. Г.1, Алексеева О. В.2, Клычева М. М.1, Родионова А. Н.2, Назаров С. Б.1, Агафонов А. В.2
Лаборатория клинической биохимии и генетики, ФГБУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова» Минздрава России, 153045, Иваново, ул. Победы, 20, Россия
2Лаборатория «Химия гибридных наноматериалов и супрамолекулярних систем», (Российской академии наук Институт химии растворов им. Г.А. Крестова РАН, 153045, г. Иваново, ул. Академическая, 1, Россия
Для корреспонденции: Ситникова Ольга Григорьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории клинической биохимии и генетики ФГБУ «Ив НИИ М и Д им. В. Н. Городкова» Минздрава России, e-mail: og_sitnikova@ mail.ru
For correspondence: Sitnikova Olga G., PhD, senior researcher, V.N. Gorodkov Laboratory of clinical biochemistry and genetics, Ivanovo Research Institute of Maternity and Childhood, e-mail: [email protected]
Information about authors
Sitnikova O. G. http://orcid.org/0000-0003-2604-0724 Alekseeva O. V. http://orcid.org/0000-0002-5402-5866 Nazarov S. B. http://orcid.org/0000-0003-1545-7655 Klychevа M. M. http://orcid.org/0000-0002-1725-8505 Rodionova A. N. http://orcid.org/0000-0002-0665-8220 Agafonov A. V. http://orcid.org/0000-0003-3375-6819
РЕЗЮМЕ
Проведено исследование методом индуцированной хемилюминесценции свободнорадикальных процессов и антиоксидантной активности полистирольных композитов с различной концентрацией бентонит/магнетита in vitro. В качестве полимерной матрицы для получения композитов был выбран атактический полистирол. Магнетизированная глина получена методом химического соосаждения солей железа в порах бентонита. Композиционные материалы ПС/бентонит/магнетит получены методом механического диспергирования частиц магнетизированной глины в растворе полистирола в о-ксилоле. Процесс удаления растворителя из полимерного композита контролировали весовым методом. Толщина полученных пленок составляла 40 мкм. Содержание магнетизированного бентонита в композите варьировали от 0 до 5 мас. %. Установлено, что композиты полистирол/бентонит/магнетит с концентрацией 3 и 5 мас. % бентонит/магнетита оказывают влияние на процесс свободнорадикального окисления и антиоксидантную активность сыворотки крови in vitro неодинаково. В концентрации 3 мас. % проявляют как прооксидантный, так и антиоксидантный эффект. Композиты полистирол/бентонит/ магнетит с концентрацией 5 мас. % бентонит/магнетита обладают антиоксидантной активностью in vitro.
Ключевые слова: свободнорадикальное окисление; хемилюминесценция; бентонит/магнетит; композиты.
A RESEARCH OF INDUCED CHEMILUMINESCENCE OF COMPOSITES OF POLYSTYRENE/
BENTONITE/MAGNETITE IN VITRO
Sitnikova O. G.1, Alekseeva O. V.2, Klycheva M. M.1, Rodionova A. N.2, Nazarov S. B.1, Agafonov A. V.2
1V.N. Gorodkov Ivanovo Research Institute of Maternity and Childhood, Ivanovo, Russia 2 Institute of Solution Chemistry, Russian Academy of Sciences, Ivanovo, Russia
SUMMARY
By the method of induced chemiluminescence, free radical processes and antioxidant activity of polystyrene composites with different concentrations of bentonite/magnetite have been studied in vitro. Atactic polystyrene was selected as the polymer matrix for the composites. Magnetized clay was obtained by chemical co-precipitation of iron salts in the pores of bentonite. Composite materials PS / bentonite / magnetite were obtained by mechanical dispersion of magnetized clay particles in a polystyrene solution in o-xylene. The process of solvent removal from the polymer composite was controlled by the weight method. The thickness of the obtained films was 40 |m. The content of magnetized bentonite in the composite varied from 0 to 5 wt. %. It was found that the composites of polystyrene / bentonite / magnetite with a concentration of 3 and 5 wt. % of bentonite / magnetite differently affect the process of free radical oxidation and antioxidant activity of blood serum in vitro. The concentration of 3 wt. % exhibits both Pro-oxidant and antioxidant effects. Composites polystyrene / bentonite / magnetite with a concentration of 5 wt. % of bentonite / magnetite have antioxidant activity in vitro.
Keywords: chemiluminescence; polystyrene composites; bentonite/magnetite; free radical oxidation.
Одной из актуальных проблем современной биомедицины является исследование свободнора-дикального окисления липидов (СРО), продукты которого оказывают повреждающее действие на мембраны клеток. Известно, что свободные кислородные радикалы образуются во всех аэробных организмах во время как физиологических, так и патологических процессов. Усиление СРО липидов является одним из патогенетических звеньев различных заболеваний любого генеза. Скорость СРО липидов и содержание свободных радикалов в организме поддерживается на определенном уровне многоступенчатой антиоксидантной системой регуляции, включающей витамины, низкомолекулярные антиоксиданты и специфические ферменты. Для нормализации свободнорадикальных процессов липидов используют лекарственные препараты с антиоксидантным действием. Защитное действие антиоксидантов заключается в их способности поглощать свободные радикалы, что позволяет поддерживать биохимические процессы в организме человека на должном уровне [1; 2].
В настоящее время проводится поиск новых соединений, влияющих на свободнорадикальное окисление липидов. Внимание исследователей привлекают композиты полимеров, содержащие в качестве неорганических наполнителей наночасти-цы оксидов металлов, таких как магнетит Ре3О4, который обладает развитой поверхностью и высокой удельной намагниченностью. Для стабилизации магнитных частиц в растворе могут быть использованы неорганические соединения, в частности, бентонитовые глины [3]. Одной из отличительных особенностей бентонита является безвредность его для организма. Кроме того, известно, что бентониты адсорбируют токсичные вещества, что позволяет широко использовать их в медицине [4; 5].
В качестве полимерной матрицы для получения композитов часто выбирается полистирол (ПС), который обладает хорошими пленкообразующими свойствами и находит широкое применение в различных областях промышленности и медицины. Ранее нами было показано, что композиты на основе полистирола и полиметилметакрилата, допированные фуллереном и гидроксиаппатитом, обладают антиоксидантными свойствами [6; 7; 8]. Можно ожидать, что композиты на основе ПС, модифицированного бентонит/магнетитом, также могут проявлять биологическую активность. Однако антиоксидантное действие таких композитов в биологических жидкостях изучено недостаточно.
Целью настоящей работы явилось исследование влияния композитов полистирол/бентонит/ магнетит на свободнорадикальное окисление ли-пидов и антиоксидантную активность в сыворотке крови in vitro.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для исследования влияния пленочных материалов на процессы свободнорадикального окисления липидов использовалась «сливная» сыворотка крови от 10 пациенток, поступивших в акушерскую или гинекологическую клиники ФГБУ «Ив. НИИ М и Д им. В.Н. Городкова» Минздрава России. Все пациентки при поступлении в клинику подписывали информационное согласие на обследование, включающее взятие крови и другие процедуры, на что имелось одобрение этического комитета. Забор крови осуществлялся у небеременных женщин, поступивших в клинику с нарушениями менструальной функции эндокринного генеза.
В качестве полимерной матрицы для получения композитов был выбран атактический полистирол (ПС) («АЫпсЬ», Германия) со среднечисловой молекулярной массой Мп=1.4-105 и полидисперсностью Mw/Mn=1.64. Наполнителем служил бентонит («81дта-АИпсЬ», США), модифицированный магнетитом. Магнетизированная глина была получена методом химического соосаждения солей железа в порах бентонита [9]. Композиционные материалы ПС/бентонит/магнетит были получены методом механического диспергирования частиц магнетизированной глины в растворе полистирола в о-ксилоле. Для этого растворы ПС и ПС с добавками бентонит/магнетита в о-ксилоле готовили гравиметрически с последующим перемешиванием на магнитной мешалке со скоростью 180 об/мин в течение 72 часов до получения однородного геля. Затем полученные растворы (концентрация ПС в растворах - 17 мас. %) поливали на стеклянную подложку и высушивали под вакуумом при 293 К до полного удаления растворителя. Процесс удаления растворителя из полимерного композита контролировали весовым методом. Толщина полученных пленок составляла 40 мкм. Содержание магнетизированного бентонита в композите варьировали от 0 до 5 мас. %.
В пробирки, содержащие 1 мл «сливной» сыворотки крови, помещали образцы исходной поли-стирольной или композиционной ПС/магнетизированная глина пленок размером 1,5 см2 и массой 5 мг и с определенной концентрацией бентонит/ магнетита, затем инкубировали в течение одного часа при температуре 4° С для ограничения влияния микробиологических факторов. Контролем служила «сливная» сыворотка крови без образцов пленки.
Определение интенсивности свободнорадикального окисления липидов в исследуемых образцах проводили методом железоиндуцированной хемилюминесценции (ХЛ) на приборе «БХЛ-07» (Россия). В качестве индукторов ХЛ использовали фармакопейный препарат «Гидроперит», содержа-
2018, том 21, № 2
щий 34% пероксид с сульфатом железа II (FeSO4) -«Sigma-Aldrich» (США). Для регистрации ХЛ в измерительную кювету биохемилюминометра вносили 0,1 мл сыворотки крови, 0,4 мл фосфатного буфера рН 7,5, 0,4 мл раствора сульфата железа (0,05 мМ). Кювету помещали в измерительную камеру прибора. Далее вводили 0,2 мл 2 % раствора пероксида водорода и регистрировали ХЛ в течение 30 секунд.
Для количественной оценки кинетической кривой ХЛ использовались параметры: Imax - максимальная интенсивность свечения, размерность -мВ; S - величина светосуммы, размерность - мВ*с; ST - светосумма свечения после достижения максимума свечения, размерность - мВ*с - эти показатели отражают потенциальную способность биологического объекта к свободнорадикальному окислению. Антиоксидантный потенциал оценивался по величине тангенса угла максимального наклона кривой к оси времени (tg a, размерность мВ/с). Вышеприведенные параметры ХЛ, рассчитывались автоматически.
Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы Statistica 6,0 (Stat soft) for Windows. Учитывая характер распределения, отличный от нормального, описание представлено в виде медианы - середины распределения изучаемого признака и интерквартильно-го интервала (ME [Q25; Q75]). Сравнение средних величин в группах проводили с использованием критерия Wilcoxona. Статистически значимыми считали различия при р<0,05 [10].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние исходных и модифицированных ПС пленок было изучено по отношению к свободным радикалам и активным формам кислорода (АФК), генерируемым в реакциях свободнорадикального окисления липидов в «сливной» сыворотке крови методом индуцированной ХЛ. Как видно из полученных кинетических кривых ХЛ (рис. 1), всплеск
свечения, связанный с выходом свободных радикалов (Н02^, 02^, 02-, ОНО, наблюдался в течение первых секунд от начала реакции.
В таблице приведены показатели хемилю-минесценции «сливной» сыворотки крови после контакта с исходной ПС пленкой и с содержащей магнетизированную глину. Отмечено, что изменения показателей ХЛ в «сливной» сыворотке крови после воздействия исходной полистирольной пленки, как и в предыдущих исследованиях с ПС композитами, содержащими другие неорганические наполнители (фуллерен, гидроксиапатит), отсутствуют [6; 7; 8].
Выявлено увеличение параметра 1тах и показателей хемилюминесценции 8 и 8Т (р=0.009) после контакта с полимерной пленкой, модифицированной 3 мас. % бентонит/магнетитом, что связано с усиленным образованием свободных радикалов липидов и АФК. Следует отметить, что в данном случае наблюдается прооксидантный эффект композита. Отмечено повышение показателя 1да, характеризующего максимальную крутизну спада хемилюминесцентной кривой, что, возможно, связано с усилением свободнорадикальных реакций; в данном случае это проявление антиоксидантных свойств композита с этой концентрацией.
Как видно из таблицы 1, параметры 1тах, 8 и 8Т для композита, содержащего 5 мас. % магнетизированного бентонита, достоверно не отличались от значений для «сливной» сыворотки крови. Возможно, это связано с более высоким содержанием железа в композите, так как достаточная концентрация ионов Бе2+ в данном случае разлагает гидроперекиси, снижая интенсивность свечения [11, 12]. Достоверное увеличение показателя 1да, отражающего антиоксидантный потенциал проб, после воздействия на сыворотку крови композитов, содержащих 5 мас. % бентонит/магнетита, свидетельствует о способности этих материалов проявлять антиоксидантную активность, что позволит использовать их в качестве антиоксидантных средств.
40-
ю
25
30
15 20 время, С
Рис. 1. Кинетика ХЛ в «сливной» сыворотке крови после воздействия композитов ПС/бентонит/магнетит с различной концентрацией наполнителя, мас. %: 1 - 0; 2 - 3; 3 - 5; 4 - контроль.
Таблица 1
Показатели хемилюминесценции «сливной» сыворотки крови после контакта с исходной ПС пленкой и
с содержащей магнетизированную глину
Концентрация наполнителя в композите (мас. %) Показатели хемилюминесценции в %) Медиана [25; 75 перцентили]
Imax (мВ) S (мВ*с) SТ (мВ*с) tga (мВ/с)
Контроль 132 [129; 144] 1646 [1586; 1752] 1533 [1442; 1612] 19.5 [19.5; 24]
0 п=10 142 [138; 151] 1732 [1647; 1993] 1589 [1520; 1852] 24.75 [23.25; 25.5]
3 п=10 150 * [141; 152] 1750 * [1733; 1843] 1627 * [1607; 1718] 26.25 * [24; 31.5]
5 п=10 141 [119; 143] 1767 [1590; 1834] 1639 [1462; 1704] 25.5 * [24; 30]
Примечание: * - достоверные отличия по отношению к контролю (р<0.05)
Таким образом, прооксидантные свойства исследуемого материала можно объяснить тем, что концентрация 3 мас. % данного композита оказалась недостаточной для обезвреживания свободных радикалов, а увеличение концентрации до 5 мас. % позволило ему проявить антиоксидантный эффект. Выбор различных концентраций композита предназначен для выявления только антиокси-дантных свойств. В дальнейшей работе предполагается исследование композита с концентрацией 5 мас. % бентонит/магнетита при конкретной патологии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Установлено, что композиты полистирол/бентонит/магнетит с концентрацией 3 и 5 мас. % бентонит/магнетита оказывают влияние на процесс свободнорадикального окисления и антиоксидант-ную активность сыворотки крови in vitro неодинаково. В концентрации 3 мас. % проявляют как прооксидантный, так и антиоксидантный эффект. Композиты полистирол/бентонит/магнетит с концентрацией 5 мас. % бентонит/магнетита обладают антиоксидантной активностью in vitro.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors hav no conflict of interests to declare.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты. Вестн. РАМН. 1998; (7):43-51.
2. Узбеков М.Г. Перекисное окисление ли-пидов и антиоксидантные системы при психических заболеваниях. Социал. и клин. психиатрия. 2014;24(4):97-103.
3. Алексеева О.В., Родионова А.Н., Багров-ская Н.А., Агафонов А.В. Структура и свойства гибридных композитов на основе гидроксиэтил-целлюлозы и слоистого алюмосиликата // Фи-
зикохимия поверхности и защита материалов. 2014;50(3):250-253. doi: 10.7868/S0044185614030024
4. Гылымхан Н.Т., Жумагалиева Ш.Н., Аби-лов Ж.А. Исследование системы бентонитовая глина-тамариксидин для создания мягких лекарственных форм. Докл. НАН Республики Казахстан. 2016;(4):24-33.
5. Hernández-Hernández K.A., Illescas J., Díaz-Nava MdC, Muro-Urista C. R., Martínez-Gallegos S., Ortega-Aguilar R.E. Polymer-Clay Nanocomposites and Composites: Structures, Characteristics, and their Applications in the Removal of Organic Compounds of Environmental Interest. Med. Chem (Los Angeles) 2016;6(3):201-210. dx.doi.org/10.4172/2161-0444.1000347
6. Ситникова О.Г., Назаров С.Б., Алексеева О.В., Багровская Н.А., Клычева М.М., Попова И.Г. Исследование свободнорадикальных процессов и антиоксидантной активности гибридных композитов с гидроксиапатитом на основе полистирола in vitro. Вестн. новых мед. технологий. 2014;21(4):129-133.
7. Ситникова О.Г., Назаров С.Б., Алексеева О.В. Клычева М.М., Багровская Н.А.
Исследование влияния фуллеренсодержащих нанокомпозитов на свободнорадикальные процессы in vitro. Крымский журн. эксперим. и клин. мед. 2016;7(2):44-48.
8. Alekseeva O.V., Sitnikova O.G., Bagrovskaya N.A., Noskov A.V. Effect of polystyrene/fullerene composites on the lipid peroxidation in blood serum. Chem. Chem. Technol. 2016;10(1):91-95. doi: 10.23939/chcht10.01.091
9. Алексеева О.В., Родионова А.Н., Багров-ская Н.А., Агафонов А.В. Синтез, структура и свойства композита бентонит/магнетит. Физикохимия поверхности и защита материалов. 2016. Т.52, №5, с. 505-509.
10. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М., 2002; 312.
2018, том 21, № 2
11. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесцен-ция. Успехи биол. химии. 2009;49:341-388.
12. Проскурнина Е.В., Полимова А.М., Соза-рукова М.М. и др. Кинетическая хемилюминесцен-ция как метод оценки окислительного стресса при обследовании пациентов с сахарным диабетом 2-го типа. Бюл. эксперим. биол. и мед. 2016;161(1):149-152.
REFERENCES
1. Vladimirov Ju.A. Free radicals and antioxidants. Vestn. RAMN. 1998;(7):43-51. (In Russ)
2. Uzbekov M.G. Lipid peroxidation and antioxidant systems in mental disorders (Part I). Social. i klin. psihiatrija. 2014;24(4):97-103. (In Russ)
3. Alekseeva O.V., Rodionova A.N., Bagrovskaya N.A., Agafonov A.V. Structure and properties of hybrid composites based on hydroxyethyl cellulose and laminar alumosilicate. Fizikohimija poverhnosti i zashhita materialov. 2014;50(3):300-303. (In Russ) doi: 10.7868/S0044185614030024
4. Gylymhan N.T., Zhumagalieva Sh.N., Abilov Zh.A. A study of the system, bentonite clay-tamaricoides for the creation of soft medicinal forms. Dokl. NAN Respubliki Kazahstan. 2016;(4):24-33.
5. Hernández-Hernández K.A., Illescas J., Díaz-Nava MdC, Muro-Urista C. R., Martínez-Gallegos S., Ortega-Aguilar R.E. Polymer-Clay Nanocomposites and Composites: Structures, Characteristics, and their Applications in the Removal of Organic Compounds of Environmental Interest. Med. Chem (Los Angeles). 2016;6(3):201-210. dx.doi.org/10.4172/2161-0444.1000347
6. Sitnikova O.G., Nazarov S.B., Alekseeva O.V., Bagrovskaja N.A., Klycheva M.M., Popova I.G. Investigation of free radical processes and antioxidant activity of hybrid composites with hydroxyapatite based on polystyrene in vitro. Vestn. novyh med. tehnologij. 2014;21(4)129-133. (In Russ)
7. Sitnikova O.G., Nazarov S.B., Alekseeva O.V., Klycheva M.M., Bagrovskaya N.A. Investigation of the effect of fullerene-containing nanocomposites on free radical processes in vitro. Krymskij zhurn. jeksperim. i klin. med. 2016;7(2):44-48. (In Russ)
8. Alekseeva O.V., Sitnikova O.G., Bagrovskaya N.A., Noskov A.V. Effect of polystyrene/fullerene composites on the lipid peroxidation in blood serum. Chem. Chem. Technol. 2016;10(1):91-95 doi: 10.23939/ chcht10.01.091
9. Alekseeva O.V., Rodionova A.N., Bagrovskaja N.A., Agafonov A.V. Sintez, struktura i svojstva kompozita bentonit/magnetit. Fizikohimija poverhnosti i zashhita materialov. 2016;52(5):505-509.
10. Rebrova O.YU. Statisticheskiy analiz meditsinskikh dannykh. Primeneniye paketa prikladnykh programm STATISTICA [Statistical analysis of medical data. The use of the STATISTICA software package]. Moscow, MediaSfera Publ., 2002. (In Russ)
11. Vladimirov Ju.A., Proskurnina E.V. Free radicals and cell chemiluminescence. Uspehi biol. himii. 2009;49:341-388. (In Russ)
12. Proskurnina E.V., Polimova A.M., Sozarukova M.M., Vladimirov Y.A., Prudnikova M.A., Ametov A.S. Kinetic Chemiluminescence as a Method for Oxidative Stress Evaluation in Examinations of Patients with Type 2 Diabetes Mellitus. Bjul. jeksperim. biol. i med. 2016;161(1):131-133. (In Russ)
