CC BY
111
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ и ммунология ♦
УДК 619:616.98:578.825.1-085.371
Исследование гуморальной иммунной реакции на применение живой вакцины против ИЛТ у птиц, ранее иммунизированных
^ V V V V
рекомбинантной вирусной векторной вакциной
С.А. Похвальный, кандидат ветеринарных наук, научный сотрудник лаборатории профилактики болезней птиц (pohvalniy@arriah.ru), В.Ю. Кулаков, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики болезней птиц (kulakov@arriah.ru), В.Н. Решетникова, аспирант, младший научный сотрудник лаборатории эпизоотологии и мониторинга (reshetnikova@arriah.ru)
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») (600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец).
Для профилактики слабых форм ИЛТ, которые наиболее превалентны в промышленном птицеводстве России, иногда используют вирусную векторную рекомбинантную вакцину и впоследствии живую аттенуированную вакцину. При этом в продаже отсутствуют гликопротеин-специфические наборы ИФА для обнаружения антител к вирусу ИЛТ у цыплят, привитых вирусными векторными вакцинами.
Цель исследования. Определить гуморальную иммунную реакцию на применение живой вакцины против ИЛТ у ранее иммунизированных рекомбинантной вирусной векторной вакциной птиц с помощью коммерческого твердофазного набора ИФА.
Материалы и методы. В эксперименте использовали две группы цыплят: 1-я группа — цыплята, иммунизированные в односуточном возрасте в условиях птицефабрики рекомбинантной вирусной векторной вакциной против ИЛТ; 2-я группа — цыплята, выращенные из СПФ-яиц и не привитые против ИЛТ рекомбинантным препаратом. В 29-суточном возрасте цыплята 1-й и 2-й группы были разделены на 2 подгруппы каждая (1.1, 1.2 и 2.1, 2.2, соответственно). При этом подгруппы 1.1 и 2.1 были иммунизированы эмбрион-вакциной против ИЛТ из штамма «О». Цыплята подгрупп 1.2 и 2.2 служили в качестве контроля прививки живой вакцины. Проводили анализ титров сывороточных антител к вирусу ИЛТ с помощью ИФА до и после иммунизации эмбрион-вакциной. Заключение. Было установлено, что предшествующее применение векторного препарата не препятствовало приживлению и развитию живого вакцинного вируса.
Ключевые слова: инфекционный ларинготрахеит птиц, рекомбинантная вирусная векторная вакцина, гуморальный отклик
Сокращения: ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, ИЛТ — инфекционный ларинготрахеит птиц, ИФА — иммуноферментный анализ; СПФ — свободные от патогенных факторов (животные, в организме которых исключено присутствие определенных патогенных микроорганизмов и специфических антител к ним)
Введение
Инфекционный ларинготрахеит птиц — это экономически значимая болезнь, которая встречается по всему миру в виде спорадических вспышек. Превалирует слабая форма ИЛТ, характеризующаяся носовыми выделениями, конъюнктивитами и снижением яичной продуктивности у кур-несушек [3, 5, 8].
В настоящее время наиболее распространенным методом борьбы с ИЛТ является специфическая профилактика с использованием живых вакцин [5]. Однако у птиц, как при переболевании, так и после вакцинации, присутствует экскреция вируса ИЛТ во внешнюю среду, что предполагает горизонтальную передачу, циркуляцию вируса в стаде, а также развитие латентных (бессимптомных) форм болезни, при которых возбудитель персистирует в дыхательных путях и в ганглии тройничного нерва. При этом латентный вирус сохраняет способность к реактивации, которая может наступать после воздействия стресс-факторов [1...3, 5].
В связи со сложностями вакцинопрофилактики ИЛТ, в США и ряде других стран приняты национальные программы по искоренению ИЛТ, включающие в себя радикальные меры по уничтожению больной и восприимчивой птицы в очаге и угрожаемой зоне (stamping out) и отказ от использования живых вакцин из аттену-ированных штаммов вируса [2, 3, 5, 7, 8].
Альтернативой перечисленным методам борьбы с ИЛТ считается использование рекомбинантных вирусных векторных вакцин [3], разработка которых за последние 30 лет в европейских странах, в США и Австралии получила мощное развитие [4, 7]. Однако имеются публикации, подвергающие сомнению эффективность векторных вакцин [10]. Важно отметить, что без использования специальных гликопротеин-специфических диагностических наборов ИФА оценка результативности применения векторной вакцины становится невозможной [6]. В этой связи изучение иммунногенного действия векторной вакцины против ИЛТ считали актуальным.
Цель исследования
Определить гуморальную иммунную реакцию на применение живой вакцины против ИЛТ у ранее иммунизированных рекомбинантной вирусной векторной вакциной птиц с помощью коммерческого твердофазного набора ИФА.
Материалы и методы
Эмбрион-вакцина против ИЛТ птиц из штамма «О» (производитель ФГБУ «ВНИИЗЖ») вызывает формирование им-
С.А. Похвальный, В.Ю. Кулаков, В.Н. Решетникова
Рис. Титры антител к вирусу ИЛТ (lgT) в сыворотках крови цыплят соответственно подопытным группам и возрасту (сутки). Даны хронологически соответствующие средние логарифмические значения титров антител к вирусу ИЛТ соответственно подопытной группе (n=10) и возрасту цыплят (обозначены диапазоны стандартных отклонений): 4 — группа 1 (цыплята, привитые в односуточном возрасте векторной вакциной против ИЛТ); А — группа 2 (цыплята, выращенные из СПФ-яиц и не привитые векторной вакциной против ИЛТ). В 29-суточном возрасте цыплята групп 1 и 2 были разделены на 2 подгруппы каждая (1.1, 1.2 и 2.1, 2.2). Цыплята групп 1.1 (4) и 2.1 (А) были иммунизированы эмбрион-вакциной против ИЛТ из штамма «О» (вертикальная пунктирная линия указывает на момент вакцинации). Цыплята групп 1.2 (•) и 2.2 (■) служили в качестве контроля Pic. Mean and standard deviation of ELISA values of sera collected from groups of chickens at various times.
Two groups of chickens were used. 4 — Chickens of group 1 were vaccinated at the age of one day with a viral vectored recombinant vaccine against infectious laryngotracheitis (ILT) on the poultry farm. А — Chickens of group 2 were hatched from SPF eggs and not anti-ILT immunized with the recombinant vaccine. Chickens of both groups were divided into subgroups at the age of 29 days (two subgroups per group: 1.1, 1.2 and 2.1, 2.2, respectively). Chickens of subgroups 1.1 (4) and 2.1 (А) were vaccinated with ILTV O strain-based chicken embryo vaccine at the age of 29 days. Chickens of subgroups 1.2 (•) and 2.2 (■) were not vaccinated. Lines indicate mean values
мунного ответа к вирусу ИЛТ через 14.. .21 сутки после однократного применения продолжительностью 6 месяцев. Вакцину применяли окулярно в соответствии с инструкцией.
Были сформированы 2 группы клинически здоровых цыплят по 40 голов: 1-я группа — цыплята яичного кросса «Хайсекс коричневый», иммунизированные в односуточном возрасте в условиях птицефабрики рекомбинант-ной вирусной векторной вакциной против ИЛТ («Инновакс ILT»); 2-я группа — цыплята, которые были получены из СПФ-эмбрионов кур («Valo Biomedia GmbH», Германия). Эксперимент проводили на базе вивария ФГБУ «ВНИИЗЖ» в боксовом помещении. Птиц соответственно сформированным группам содержали в отдельных изоляторах.
В сыворотках крови цыплят определяли титры антител к вирусу ИЛТ с помощью твердофазного метода ИФА на коммерческих диагностических наборах («ProFLOCK LT ELISA Kit», Synbiotics Corp). В тексте значения титров указаны в размерности десятичных логарифмов (lg). Позитивно-негативный порог для данной тест-системы составлял 2,531lg. Интенсивность иммунного ответа считали показателем приживления и развития вакцинного вируса в организме птицы.
Использовали стандартные методы статистической обработки выборок варьирующих переменных. В тексте представлены средние значения титров сывороточных антител и их стандартные отклонения (x±s), установленные по результатам 10 выборочных измерений (n=10). Для обнаружения существенности различий средних оценок использован метод множественных сравнений Шеф-
фе. Вычислительные операции и построение диаграммы выполняли с помощью приложения Microsoft Office Excel.
Результаты
В течение всего эксперимента через заданные интервалы времени во всех группах птиц брали пробы крови для исследования сывороток в ИФА на присутствие антител к вирусу ИЛТ. В возрасте 29 суток цыплята 1-й и 2-й группы были разделены на 2 подгруппы по 20 гол. каждая (1.1, 1.2 и 2.1, 2.2, соответственно). При этом цыплятам подгруппы 1.1 и 2.1 была окулярно привита эмбрион-вакцина против ИЛТ из штамма «О». Цыплята подгрупп 1.2 и 2.2 не были привиты живой вакциной и служили в качестве контроля.
На 5.. .7-е сутки после вакцинации у цыплят подгруппы 1.1 наблюдали поствакцинальную реакцию в виде признаков серозного конъюнктивита. Доля реагирующих птиц в группе составила 12 %. У цыплят подгруппы 2.1, выращенных из СПФ-яиц, данная реакция отсутствовала. Результаты серологических исследований птиц представлены на рисунке.
Приведенные на диаграмме средние оценки титров сывороточных антител демонстрируют, что у цыплят группы 1 в возрасте с 8-х до 29-е сутки (до вакцинации) происходила регрессия трансовариального иммунитета. Оценка падения титров в группе составила величину antilg (2,787-1,764)»10. В группе 2 в указанный период также были отмечены определенные колебания оценок титров, которые, вероятно, имели неспецифи-
Исследование гуморальной иммунной реакции на применение живой вакцины против ИЛТ у птиц, ранее иммунизированных рекомбинантной вирусной векторной вакциной
ческий характер. На дату иммунизации птиц эмбрион-вакциной (возраст птицы 29 суток) наибольший средний титр антител (1;764±0;060)lg наблюдали в группе 1.
В интервале 9.. .16 суток после прививки (возраст птицы 38...45 суток) в группах птиц 1.1 и 2.1, иммунизированных живой вакциной, происходил синхронный подъем титров сывороточных антител, значения титров достигли значений (2,596±0,218)lg и (2,769±0,131)lg, соответственно. При этом значения титров у данных цыплят начиная с 12 суток после прививки были статистически тождественны. В дальнейшем в данных подгруппах птиц рост титров сывороточных антител продолжался. По истечении 32 суток после прививки (возраст птицы 62 суток) титры в группах 1.1 и 2.1 составили (2,965±0,184)lg и (3,302±0,117)lg, соответственно. При этом значения титров статистических различий не имели.
У цыплят подгрупп 1.2 и 2.2, не привитых живой вакциной против ИЛТ, наблюдали неспецифические колебания средних значений титров сывороточных антител в нижней зоне позитивно-негативного порога тест-системы ИФА. Опыт был завершен через 56 суток после прививки эмбрион-вакциной (возраст птицы 85 суток). Значения и соотношение титров антител к вирусу ИЛТ в подопытных группах существенно не изменились.
Обсуждение
Составляющие оболочку вируса ИЛТ гликопротеиды (не менее 12) и их иммунологическая роль известны [3, 8, 9]. Основу вакцины «Инновакс ILT» против болезни Марека и ИЛТ составляют фибробласты эмбрионов кур, инфицированные рекомбинантным вирусом герпеса индеек, в ДНК которого встроены гены, кодирующие всего лишь 2 гликопротеина gD и gI вируса ИЛТ. Однако, как уже было указано, антитела к данным полипептидам могут быть зарегистрированы только гликопротеин-специфичес-кими диагностическими наборами ИФА [6]. Оценка гуморальной иммунной реакции птиц на рекомбинантную вакцину без специальных средств представляет проблему.
После прививки эмбрион-вакциной в группах птиц 1.1 и 2.1 наблюдали синхронный рост гуморальных антител к вирусу ИЛТ. Это явление свидетельствует о наличии системной иммунной реакции со стороны организма птицы на приживление и развитие вакцинного вируса. Интенсивность иммунного ответа на живую вакцину у цыплят, привитых ранее рекомбинантным препаратом (подгруппа 1.1), статистически не отличалась практически на всех хронологических точках от аналогичного показателя у цыплят, выращенных из СПФ-яиц.
Глазная реакция в ответ на применение живой вакцины у 12 % цыплят подгруппы 1.1 являлась допустимой и свидетельствует о факте приживления вакцинного вируса. У выращенных из СПФ-яиц цыплят подгруппы 2.1 данной реакции не наблюдали, причиной чего, скорее всего, являются фенотипические особенности птиц.
Заключение
Таким образом, предшествующая прививка птицы реком-бинантной вирусной векторной вакциной не препятствовала приживлению и развитию живого вакцинного вируса и не повлияла на динамику и интенсивность гуморального ответа на применение живой вакцины против данной болезни (быстрый интенсивный рост антител, наблюдаемый при вторичном гуморальном ответе).
Библиография
1. Кулаков, В.Ю. Биологические свойства слабовирулентного изолята вируса инфекционного ларинготрахеита птиц/ В.Ю. Кулаков, Д.Б. Андрейчук, С.А. Похвальный, К.Ю. Федосеев // Ветеринария сегодня. — 2014. — №1 (8). — С. 16-26.
2. Chin, R.P. Intervention strategies for laryngotracheitis: impact of extended downtime and enhanced biosecurity auditing / R.P. Chin, et al. // Avian Dis. — 2009. — Vol. 53. — No.4. — P. 574-577.
3. Coppo, M.J.C. Challenges and recent advancements in infectious laryngotracheitis virus vaccines / M.J.C. Coppo, et al. // Avian Path. — 2013. — Vol. 42. — No. 3. — P. 195-205.
4. Davison, S. Evaluation of the efficacy of a live fowlpox-vectored infectious laryngotracheitis / avian encephalomyelitis vaccine against ILT viral challenge / S. Davison, et al. // Avian Dis. — 2006. — Vol. 50. — No. 1. — P. 50-54.
5. Dufour-Zavala, L. Epizootiology of infectious laryngotracheitis and presentation of an industry control program / L. Dufour-Zavala // Avian Dis. — 2008. — Vol. 52. — No. 1. — P. 1-7.
6. Godoy, A. Detection of infectious laryngotracheitis virus antibodies by glycoprotein-specific ELISAs in chickens vaccinated with viral vector vaccines / A. Godoy, et al. // Avian Dis. — 2013. — Vol. 57. — No. 2. — P. 432-436.
7. Jonson, D.I. Protection against infectious laryngotracheitis by in ovo vaccination with commercially available viral vector recombinant vaccines / D.I. Jonson, et al. // Avian Dis. — 2010. — Vol. 54. — No. 4. — P. 1251-1259.
8. Menendez, K.R. Molecular epidemiology of infectious laryngotracheitis: a review / K.R. Menendez, et al. // Avian Path. — 2014. — Vol. 43. — No. 2. — P. 108-117.
9. Pavlova, S. Identification and functional analysis of membrane proteins gD, gE, gI, and pUS9 of infectious laryngotracheitis virus / S. Pavlova, et al. // Avian Dis. — 2013. — Vol. 57. — No. 2. — P. 416-426.
10. Vagnozzi, A. Protection induced by commercially available live-attenuated and recombinant viral vector vaccines against infectious laryngotracheitis virus in broiler chickens / A. Vagnozzi, et al. // Avian Path. — 2012. — Vol. 41. — No.1. — P. 21-31.
References
1. Kulakov V.Ju., Andrejchuk D.B., Pokhvalnyj S.A., Fedoseev K.Ju. Veterinarija segodnja, 2014, No. 1 (8), pp. 16-26.
2. Chin R.P., et al. Intervention strategies for laryngotracheitis: impact of extended downtime and enhanced biosecurity auditing, Avian Dis, 2009, Vol. 53, No.4, pp. 574-577.
3. Coppo M.J.C., et al. Challenges and recent advancements in infectious laryngotracheitis virus vaccines, Avian Path, 2013, Vol. 42, No. 3, pp. 195-205.
4. Davison S., et al. Evaluation of the efficacy of a live fowlpox-vectored infectious laryngotracheitis / avian encephalomyelitis vaccine against ILT viral challenge, Avian Dis, 2006, Vol. 50, No. 1, pp. 50-54.
5. Dufour-Zavala L. Epizootiology of infectious laryngotracheitis and presentation of an industry control program, Avian Dis, 2008, Vol. 52, No. 1, pp. 1-7.
6. Godoy A., et al. Detection of infectious laryngotracheitis virus antibodies by glycoprotein-specific ELISAs in chickens vaccinated with viral vector vaccines, Avian Dis, 2013, Vol. 57, No. 2, pp. 432-436.
7. Jonson D.I., et al. Protection against infectious laryngotracheitis by in ovo vaccination with commercially available viral vector recombinant vaccines, Avian Dis, 2010, Vol. 54, No. 4, pp. 1251-1259.
8. Menendez K.R., et al. Molecular epidemiology of infectious laryngotracheitis: a review, Avian Path, 2014, Vol. 43, No. 2, pp. 108-117.
9. Pavlova S., et al. Identification and functional analysis of membrane proteins gD, gE, gI, and pUS9 of infectious laryngotracheitis virus, Avian Dis, 2013, Vol. 57, No. 2, pp. 416-426.
10. Vagnozzi A., et al. Protection induced by commercially available live-attenuated and recombinant viral vector vaccines against infectious laryngotracheitis virus in broiler chickens, Avian Path, 2012, Vol. 41, No.1, P. 21-31.
ABSTRACT
S.A. Pokhvalnyi, V.Yu. Kulakov, V.N. Reshetnikova
Federal Centre for Animal Health (ARRIAH) (600901, Vladimir, microrayon Yur'evets).
Evaluation of Antibody Responses of Previously Recombinant Viral Vector Vaccine-Immunized Chickens to Live Attenuated Vaccine against Infectious Laryngotracheitis.
The mild form of ILT, which is more prevalent in Russia's poultry industry, is sometimes controlled by the use of a viral vectored recombinant vaccine and a following live attenuated vaccine. Gli-coprotein-specific ELISAs to detect ILTV antibodies in chickens vaccinated with viral vector vaccines are not commercially available. Purpose. The aim of the study was to determine antibody responses of previously recombinant viral vector vaccine-immunized the chickens to live attenuated vaccine against ILT by the commercial ILT ELISA test-kit in accordance with the manufacturer's instruction.
Materials and methods. Two groups of chickens were used. Chickens of group 1 were vaccinated at the age of one day with a viral vectored recombinant vaccine against infectious laryngotracheitis (ILT) on the poultry farm. Chickens of group 2 were hatched from SPF eggs and not anti-ILT immunized with the recombinant vaccine. Chickens of both groups were divided into subgroups at the age of 29 days (two subgroups per group: 1.1, 1.2 and 2.1, 2.2, respectively). Chickens of subgroups 1.1 and 2.1 were vaccinated with ILTV O strain-based chicken embryo vaccine at the age of 29 days. Chickens of subgroups 1.2 and 2.2 were not vaccinated. Antibodies were detected in the serum samples collected from chickens at different times post vaccination. Conclusion. It could be concluded that vaccination with the vector vaccine had no effect on antibody responses of chickens to live attenuated vaccine against ILT. Keywords: infectious laryngotracheitis, poultry, viral vectored recombinant vaccine, humoral response.
