CC BY
56
Е. В. Мозговая
Научно-исследовательский институт
акушерства и гинекологии
им. Д. О. Отта РАМН, Санкт-Петербург
■ Изучен полиморфизм генов, участвующих в регуляции функции эндотелия — PLAT, PAI-1, АСЕ, eNOS и TNF-a у 122 беременных с чистым и сочетанным гестозом различной степени тяжести и у 73 здоровых родильниц. Выявлено, что мутантные генотипы исследованных генов связаны с более выраженными клинико-лабораторными показателями тяжести гестоза
и наибольшим повышением уровня маркеров эндотелиальной дисфункции. Отмечено, что частота мутантных генов и аллелей варьирует в зависимости от степени тяжести гестоза и наличия фоновых заболеваний, характеризующихся наличием эндотелиальной дисфункции. Полученные данные подтверждают мнение, что гестоз является мультифакториальным заболеванием с несколькими, возможно самостоятельными, путями развития. Исследование полиморфизма генов, регулирующих функцию эндотелия, способствует заблаговременному выявлению группы риска по развитию гестоза.
■ Ключевые слова: полиморфизм генов, гестоз, эндотелиальная дисфункция
ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ГЕСТОЗУ: ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ
Несмотря на наблюдающееся в последнее десятилетие снижение в России абсолютного числа родов, частота гестоза из года в год увеличивается и достигает 16—21 %[1]. Это обусловлено в первую очередь отсутствием точных знаний о патогенезе заболевания и, как следствие, отсутствием ранних и достоверных диагностических критериев, без которых невозможно осуществить действенные меры по профилактике.
На сегодняшний день известно, что ключевым звеном патогенеза гестоза, определяющим его клинические проявления, является эндотелиальная дисфункция, в результате которой эндотелиальные клетки утрачивают свою ответную реакцию, продуцируют избыток прокоагулянтов и вазоконстрикторов [4, 8]. Предполагается, что существует две различных причины возникновения заболевания в пределах синдрома гестоза [18]. Эти две причины могут быть охарактеризованы как плацентарная, генез которой — результат прежде всего сниженной плацентарной перфузии, и материнская, при которой клинический синдром проявляется прежде всего вследствие существующих до беременности нарушений функции эндотелия у матери. Генетическая предрасположенность к гестозу отмечалась исследователями с давних времен, и на сегодняшний день очевидно, что гестоз является мультифакториальным заболеванием и имеет целый ряд генов предрасположенности [7]. Генетический полиморфизм, присущий человеку, приводит к определенным вариациям в структуре белков и тем самым формирует биохимическую индивидуальность каждой личности [2]. Особенность многих вариантных генов в том, что они могут долгое время никак себя не проявлять. Патологические симптомы могут возникнуть при неблагоприятных условиях, а также при беременности.
Исходя из современных представлений о патогенезе гестоза, высока вероятность наличия ассоциации с гестозом совокупности полиморфизмов генов, вовлеченных в сложный процесс регулирования многообразных функций эндотелия.
От состояния эндотелия зависит регулирование системы фибри-нолиза, определяемое в первую очередь балансом между активатором плазминогена тканевого типа (t-PA) и его основным ингибитором 1 (PAI-1), поскольку оба эти фермента продуцируются эндотелиальными клетками. Повреждение эндотелия проявляется торможением фибринолиза, поэтому t-PA и PAI-1 являются значимыми маркерами эндотелиальной дисфункции. Полиморфизм в гене t-PA — PLAT представляет собой делецию или инсерцию А1и-по-втора в интроне 8. Отмечены увеличение уровня t-PA при повышении частоты I-аллелей и положительная ассоциация между 1-аллелем и сердечно-сосудистыми заболеваниями [22].
Ген PAI-1 имеет базовый полиморфизм инсерция/делеция, обычно называемый 4G/5G [10]. Клинические исследования показали наличие связи между 4G/5G полиморфизмом и активностью PAI-1 плазмы; отмечено, что аллель 4G связан с более высокими уровнями PAI-1 [9]. Отмечено, что у беременных с акушерскими осложнениями (тяжелая преэклампсия, отслойка плаценты, СЗРП и мертворождение) генетические расстройства фибринолиза обусловлены геном PAI-1, при этом мутация 4G/4G связана с увеличен-
ным риском тромбоза [9,11]. Исследование 4G/ 5G полиморфизма гена РА1-1 у беременных с ге-стозом показало достоверное увеличение генотипа 4G/4G и аллеля 4G по сравнению с контролем и подтвердило мнение, что генотип 4G/4G является фактором риска для развития гестоза [24].
Ангиотензинпревращающий фермент (АСЕ) является одним из важнейших компонентов ре-нин-ангиотензиновой системы, осуществляющий конверсию ангиотензина I в ангиотензин И — сильнейший вазоконстриктор. Кроме того, АСЕ осуществляет инактивацию брадикинина, являющегося стимулятором выделения эндотелием N0. Поэтому его роль в прогрессировании эндотелиальной дисфункции и вазоконстрикции несомненна. Выявлена роль полиморфизма гена АСЕ в генезе артериальной гипертензии и других заболеваний сердечно-сосудистой системы [3]. В инт-роне 16 гена АСЕ либо присутствует (Insertion, 1), либо отсутствует (Deletion, D) фрагмент ДНК, состоящий из 287 пар оснований. Отмечается выраженная связь полиморфизма АСЕ с развитием гестоза, при этом генотип I/I является маркером сниженного риска, a D/D — повышенного для развития гестоза [26]. Однако другие исследователи выявили связь полиморфизма АСЕ с развитием холестатического гепатоза беременных, но не гестоза [12].
Оксид азота (N0) — эндотелиальный фактор релаксации — играет важную роль в регуляции тонуса кровеносных сосудов и тромбогенеза. Однако данные относительно продукции оксида азота при гестозе спорны; в различных исследованиях она отмечена как сниженная, нормальная или повышенная [19, 25]. Эндотелиальная N0-синтаза (eNOS) участвует в синтезе N0 эндотелием и, следовательно, в регуляции сосудистого тонуса, кровотока и артериального давления [14], что позволило предположить наличие связи полиморфизма гена eNOS с развитием гестоза. Полиморфизм в 4 интроне гена eNOS имеет два аллеля, 4а и 4Ь. Отмечено, что этот полиморфизм связан с повышенным риском гестоза [21]. Аллель 4а связан с высоким риском развития гестоза, среди пациентов с гестозом у носителей хотя бы одного аллеля 4а отмечалось более высокое АД [20]. У пациентов, имеющих оба мутантных аллеля, обнаружена связь с более ранним и более тяжелым гестозом. Этот эффект уменьшается по мере увеличения гестационного срока, и, возможно, данный полиморфизм играет максимальную роль в ранние сроки беременности [5].
Провоспалительные цитокины играют важную роль в процессе гиперкоагуляции [17], нарушениях регуляции сосудистого тонуса и формирова-
нии синдрома эндотелиальной дисфункции [13]. При эндотелиальной дисфункции многими авторами отмечается значительное повышение уровня TNF-a как одного из самых агрессивных провос-палительных цитокинов. TNF-a способствует повышению генерации свободных радикалов, может стать причиной интенсификации процессов инактивации оксида азота и апоптоза в эндотелии [6]. Данные о наличии связи полиморфизма гена TNF-a с уровнем TNF-a в крови и с развитием эндотелиальной дисфункции, в том числе при гестозе, — крайне немногочисленны [23]. В некоторых исследованиях не было обнаружено какой-либо значимой ассоциации частоты вариантных генотипов TNF-a с тяжелым гестозом [16]. Тем не менее другие авторы отмечают существенную связь между гаплотипом TNF-a, гестозом и HELLP-синдромом [15].
Цель данного исследования — изучение ассоциации полиморфизмов генов PLAT, PAI-1, eNOS, АСЕ и TNF-a, участвующих в регуляции функции эндотелия, с развитием гестоза.
Материалы и методы
Обследовано 122 беременных с гестозом и 73 нормотензивных родильницы, не имевших выявленной соматической патологии (контрольная группа), находившихся под наблюдением в Институте акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта.
Группа пациенток с гестозом была неоднородной как по степени тяжести гестоза, так и по наличию ранее предшествовавших фоновых заболеваний. У 46 беременных не было отмечено какой-либо сопутствующей патологии («чистый» гестоз), из них у 31 беременной имел место легкий гестоз (нефропатия I—II), у 15 — тяжелый гестоз (нефропатия III и преэклампсия). У 76 пациенток отмечен сочетанный гестоз различной степени тяжести: на фоне артериальной гипертензии (у 27 — на фоне ВСД по гипертоническому типу и у 22 — на фоне гипертонической болезни), на фоне заболеваний почек (у 15), на фоне сахарного диабета (у 19).
Помимо общепринятых клинико-лабораторных данных (данные анамнеза, клинические характеристики, клинический и биохимический анализы крови, коагулограмма, анализы мочи, УЗИ плода и допплерометрия и маточно-плацентарного кровотока) у пациенток исследована агрегационная активность тромбоцитов и уровень маркеров эндотелиальной дисфункции: t-AP и PAI-1, адгезивных молекул CDll(i/CD18 и провоспалительных цитокинов, фактора Вил-лебранда и десквамированных циркулирующих эндотелиоцитов. Произведено исследование по-
диморфизмов 6 вышеуказанных генов у всех обследованных женщин.
Молекулярно-биологическое исследование полиморфных аллелей генов производилось методом полимеразной цепной реакции. Образцы ДНК получены стандартным способом из лимфоцитов крови. Для амплификации использован программируемый термоциклер Perkin-Elmer Cetus (USA). После амплификации продукты ПЦР подвергались расщеплению с помощью специфических эндонуклеаз. Продукты реакции анализированы в 7,0 % полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в проходящем УФ свете.
Агрегация тромбоцитов проводилась методом фотометрирования плазмы с использованием АДФ в качестве индуктора агрегации. Определение количества (%) адгезивных молекул семейства ин-тегринов CD11P/CD18 на нейтрофилах, моноцитах и лимфоцитах проводилось методом проточной цитометрии. Определение количества цитокинов (TNF-a, IL-l(i, IL-lra, IL-8), t-AP и PAI-1, а также фВБ производилось методом им-муноферментного анализа. Количество эндотели-оцитов подсчитывалось в камере Горяева после центрифугирования плазмы и осаждения тромбоцитов с помощью АДФ.
Результаты исследования обработаны методом вариационной статистики с оценкой достоверности по критерию Стьюдента t. При сравнении частот генотипов использовали стандартный критерий х2. Относительный риск (OR — Relative Risk) развития заболевания при определенном
генотипе рассчитывали по стандартной формуле: OR = a/b—d/c, где а и b — количество больных, имеющих и не имеющих мутантный генотип соответственно; с и d — количество человек в контрольной группе, имеющих и не имеющих мутантный генотип соответственно. Рассматривали значения OR > 1 как фактор риска развития данной патологии, a OR < 1 как предохраняющий фактор.
Результаты исследования
1. Ассоциация полиморфизма гена PLAT с гес-тозом. У беременных с гестозом, гомозигот I/I по гену PLAT, отмечалось более раннее появление отеков и артериальной гипертензии, наибольшая прибавка веса за время беременности, повышение коагуляционного потенциала и агрегацион-ной активности тромбоцитов. Достоверно более низкий уровень t-PA у гомозигот I/I коррелировал с уровнями других маркеров эндотелиальной дисфункции — повышенным содержанием в плазме PAI-1, фактора Виллебранда, десквамированных эндотелиоцитов (табл.1).
У беременных с чистым гестозом не отмечено увеличения частоты гомозигот I/I по сравнению с общим количеством беременных с гестозом и контролем, тогда как при сочетанном гестозе частота генотипа 1/1 возрастала. В группе беременных с сочетанным гестозом на фоне артериальной гипертензии, исследованных на полиморфизм гена PLAT, отмечено значительное возрастание частоты генотипа I/I (с 9,5 % в контроле до 17,7 %),
Таблица /
Ассоциация полиморфизма гена РА1-1 с клиническими показателями у беременных с гестозом
Показатель клинического обследования Вариант генотипа
I/I (п=14) D/D <п=57) I/O <п=48)
Прибавка веса, кг 13,7 + 3,9 11,7 ± 3,8* 12,0 ± 3,7
Срок появления отеков, нед 26,4 ± 5,2 30,1 ± 4,9* 30,0 + 5,4*
Срок появления гипертензии, нед 24,1 ± 6,9 26,6 ± 7,0* 28,6 ± 7,3*
Протромбиновый индекс, % 110,3 + 6,2 103 ± 6,5** 106,2 ± 8,9
Индекс АЧТВ, ед. 0,94 ± 0,09 1,04 + 0,1* 1,01 ± 0,14
Фибринолиз, мин 19,03 ± 3,77 14,53 ± 4,23* 16,15 + 4,6
Фибриноген, г/л 0,45 ± 0,87 3,71 ± 0,93** 3,63 ± 0,95*
Степень агрегации (АДФ 2 нг/мл), % 58,43 ± 10,3 49,0 ± 10,6** 53,19 ± 13,6
Степень агрегации (АДФ 0,2 нг/мл), % 20,37 ± 9,9 12,62 + 9,3* 12,51 ± 9,8**
Уровень ЬРА плазмы 1,64 ± 1,62 2,9 ± 1,61** 2,9 ± 1,59**
Уровень РА1-1 плазмы 261 ± 36,4 245 ± 36,0* 268 ± 32,0
Фактор Виллебранда, % 206,1 ± 66,2 140,1 ± 58,3* 160,0 ± 89,9
Количество эндотелиоцитов, 104/л 7,7 ± 4,59 14,0 ± 4,4* 11,0 ± 3,9*
* — р < 0,05; ~ р < 0,01 по сравнению с генотипом 1/1.
X2 = 1,76; OR = 1,76. В данной подгруппе у беременных, имевших гестоз на фоне артериальной гипертензии легкой степени (ВСД по гипертоническому типу), наблюдалась существенная тенденция к увеличению частоты генотипа I/I по мере увеличения степени тяжести гестоза. При тяжелом гестозе на фоне ВСД по гипертоническому типу (нефропатия II—III и преэклампсия, 12 пациенток), частота генотипа I/I составила 27,2 % (за счет снижения % гетерозигот), в два раза превышала таковую при сочетанном гестозе в целом и почти в три раза — по сравнению с контролем, однако достоверных различий нами не получено ввиду малочисленности подгруппы (х2 = 2,95; OR = 3,54; р = 0,5). У беременных с нарушением углеводного обмена не наблюдалось перераспределения частот генотипов и аллелей в полиморфизме гена PLAT по сравнению с контролем; наиболее выраженные отличия по сравнению с контролем наблюдались у беременных с гестозом на фоне гестационного сахарного диабета, при котором частота гомозигот I/I составила 33,3 % (%2 = 4,22; OR = 3,14; р = 0,25), а частота аллеля I — 58,3 % (X2 = 3,04; р = 0,25).
2. Ассоциация полиморфизма гена PAI-1 с гестозом. У беременных с генотипом 4G/4G отмечалась тенденция к более раннему появлению повышения артериального давления и к более высоким
Ассоциация полиморфизма гена PAI-1 с клиническими
цифрам АД, особенно в родах. Кроме того, у гомозигот 40/40 имело место значительное увеличение резистентности в маточно-плацентарном кровообращении и гипотрофии плода (по данным УЗИ). При наличии генотипа 40/4в у беременных с гестозом выявлена наибольшая гиперкоагуляция и агрегационная активность тромбоцитов, а также значительное снижение уровня 1.-РА и повышение РА1-1 по сравнению с гетерозиготами и гомозиготами 50/50. Выраженные различия наблюдались после проведения антикоагулянтной терапии: гомозиготы 40/40 более резистентны к корригирующему воздействию, имеют достоверно более низкий уровень 1:-РА и повышенный РА1-1 и фактора Виллебранда (табл. 2).
Было отмечено, что при чистом гестозе частота генотипа 40/40 выше по сравнению с контролем (48,8 % по сравнению с 28,7 %), %2 — 5,25; 0R = 2,36; р < 0,25 — за счет уменьшения частоты гетерозигот и генотипа 50/50, тогда как при сочетанном гестозе частота генотипа 40/40 была выше, чем в контроле, но ниже, чем в общей группе беременных с гестозом. Наибольшее увеличение частоты генотипа 40/40 (до 50 %) наблюдалось при тяжелом гестозе на фоне гипертонической болезни 2—3 стадии (х2— 3,21; 0R = 1,44; р < 0,5). Значительное увеличение частоты гомозигот 40/4в наблюдалось при гестозе на фоне
Таблица 2
лями у беременных с гестозом
Показатель Вариант генотипа
4G/4G (п=51) 4G/5G (п=55) 5G/5G (п=15)
Срок гипертензии, нед 26,8 ± 8,4 27,6 ± 7,4 27,8 + 6,9
Максимальное АД в родах, мм рт. ст. 140,4/91,9 ± 13,1/8,3 137,8/87,5 ± 12,6/9,5 136,8/87,3 ± 10,0/6,7
СДО пуповины, ед. 3,23 + 0,33 2,84 ± 0,51 2,51 + 0,28**
СДО правой мат. артерии, ед. 2,82 ± 0,51 2,31 ± 0,46* 2,5 + 0,6
СДО левой мат. артерии, ед. 2,71 + 0,3 2,67 + 0,48 2,4 + 0,26*
Гипотрофия плода, нед 0,92 + 0,4 0,56 ± 0,32 0*
Протромбиновый индекс, % 106,0 + 7,2 103,9 + 8,0 103,3 + 7,5
Время образования сгустка, мин 4,41 ± 0,41 4,71 + 0,39* 4,50 ± 0,40
Степень агрегации (АДФ 2 нг/мл), % 61,91 ± 16,15 53,69 ± 15,85* 57,15 + 14,69
Скорость агрегации (АДФ 2 нг/мл), %/мин 47,03 ± 14,20 42,11 ± 13,99* 44,41 + 14,95
Степень агрегации (АДФ 0,2 нг/мл), % 21,92 ± 8,40 15,17 ± 7,93* 15,40 ± 8,67**
Скорость агрегации(АДФ 0,2 нг/мл), % 31,42 ± 14,05 26,13 ± 13,83* 20,20 + 14,21**
Уровень ЬРА плазмы 2,2 ± 2,05 3,25 ± 1,85 3,9 + 2,19*
Уровень 1-РА плазмы после лечения НМГ 4,84 ± 2,07 6,17 ± 2,15* 7,83 ± 2,4**
Уровень РА1-1 плазмы 244,5 ± 36,5 268,45 ± 38,1* 249,2 ± 41,2
Уровень РА1-1 плазмы после лечения НМГ 202,9 + 35,4 194 ± 35,6* 149,1 ± 31,6**
Фактор Виллебранда,% 189,27 + 74,07 123,03 ± 67,28* 81,83 ± 65,52**
Количество эндотелиоцитов, 104/л 15,7 ± 6,29 13,5 + 5,7 10,57 ± 4,1
* ~ р < 0,05; ** — р < 0,01 по сравнению с генотипом 4G/4G.
заболеваний почек, а при тяжелом гестозе на фоне заболеваний почек у всех беременных с гестозом (4 пациентки) имел место генотип 4G/4G (%2 = = 8,78; р < 0,05). Таким образом, делеция 4G в промоторе гена PAI-1 является предрасполагающим фактором к развитию гестоза у беременных, при этом наибольший риск наблюдается у беременных с чистым гестозом, а также с сочетанным гестозом на фоне заболеваний почек, несколько меньший — на фоне АГ и сахарного диабета беременных (см. рис. 1).
3. Ассоциация полиморфизма гена АСЕ с гестозом. При оценке анамнестических данных и клинических симптомов заболевания в общей группе беременных с гестозом — существенных различий в зависимости от полиморфизма гена АПФ не выявлено, кроме изменений в некоторых параметрах системы гемостаза. У пациенток с генотипом D/D отмечено достоверное увеличение скорости и степени агрегации тромбоцитов по сравнению с беременными, имеющими генотип I/I. Полиморфизм гена АСЕ не имеет ассоциации с показателями системы фибринолиза, тем не менее у гомозигот D/D значительно повышены уровень фактора Вил-лебранда, эндотелиоцитов и TNF-a. При чистых формах гестоза выявлена взаимосвязь полиморфизма АСЕ не только с агрегационной активностью тромбоцитов и вышеозначенными маркерами эндотелиальной дисфункции, но и с уровнем адгезивных молекул. У беременных с гестозом на фоне гипертонической болезни отмечено, что для генотипа D/D характерна большая масса тела и степень ожирения, большая прибавка веса за беременность. Уровни систолического и диастолического АД существенно не различались в зависимости от генотипа, но у гомозигот D/D отмечена достоверно большая потребность в клофелине. Беременные с генотипом D/D имели сниженную скорость и степень агрегации тромбоцитов и по-
вышенный уровень всех маркеров эндотелиальной дисфункции адгезивных молекул крови (табл. 3).
Выявлено, что при легком чистом гестозе (нефропатии I—II степени) имеется достоверное увеличение частоты генотипа D/D с 38,3 до 55,8 % (Х2 = 9,18; OR = 2,04; р < 0,05), тогда как при тяжелых формах чистого гестоза (нефропатия III — преэклампсия) отмечено уменьшение частоты гомозигот DD по сравнению с контролем.
У беременных с гестозом на фоне ВСД по гипертоническому типу отмечено значительное уменьшение гомозигот D/D (28,5 %) и гетерозигот I/D (42,8 %) по сравнению с контролем (Х2= 4,76; р < 0 ,25), что свидетельствует о снижении риска сосудистых осложнений со стороны полиморфизма гена АПФ (OR = 0,64). У беременных с выраженной артериальной гипертензией, соответствующей ГБ 2-3 степени, отмечено повышение частоты генотипа D/D (50 %) за счет уменьшения процента гетерозигот I/D (37,5 %) по сравнению с контролем (х2 = 1,29) с соответствующим повышением степени риска (OR = 1,6). Наиболее заметные различия отмечены при тяжелом гестозе, при степени тяжести, соответствующей нефропатии II и выше. При тяжелом гестозе на фоне ГБ протекторный генотип I/I отсутствует, а частота генотипа D/D достигает 54,5 % (х2 = 1,87; OR = 1,9). Заметное повышение частоты генотипа D/D отмечено и у беременных с гестозом на фоне сахарного диабета 2 типа (рис. 2).
4. Ассоциация полиморфизма гена eNOS с гестозом. У беременных с гестозом, имеющих генотип 4а/4а, отмечается достоверно более раннее появление отеков, протеинурии и гипертензии; отмечена достоверно наибольшая суточная доза клофелина — основного гипотензивного средства, используемого в акушерстве для длительной коррекции гипертензии. Кроме того, у беременных с гестозом и генотипом 4а/4а гена eNOS отмечен достоверно
12 3 4
Рис. 1. Распределение частоты генотипов и аллелей гена РА1-1 у беременных с гестозом
■ Генотип 40/40 □ Генотип 40/50 Н Генотип 50/50 ■ Аллель 40 Я Аллель 5в
1 — контроль; 2 — беременные с чистым тяжелым гестозом (нефропатия II и выше); 3 — беременные с тяжелым гестозом на фоне заболевания почек; 4 — беременные с гестозом на фоне инфекции нижних МВП; 5 — беременные с тяжелым гестозом на фоне ГБ: * — р < 0,05 по сравнению с контролем
Таблица 3
Ассоциация полиморфизма гена АСЕ с клиническими показателями у беременных с гестозом
Показатель Вариант генотипа
1/1 (п = 25) i/o (п = 51) D/D (п = 46)
Время образования сгустка, мин 5,03 ± 0,43 4,44 ± 0,87 4,43 ± 0,54*
Фибриноген, г/л 3,52 ± 0,54 4,08 ± 0,96 3,86 ± 0,85
Степень агрегации (АДФ2 нг/мл), % 50,07 ± 6,28 50,53 ± 9,97 53,66 ± 6,4*
Степень агрегации (АДФ0, нг/мл), % 11,3 ± 2,77 15,11 ± 2,24* 13,02 ± 2,6
Скорость агрегации (АДФ2 нг/мл), % 30,2 ± 8,9 34,71 ± 9,34 37,77 ± 9,6*
Фактор Виллебранда, % 82,21 ± 30,97 144,65 ± 45,39 180,9 ± 56,29*
Количество эндотелиоцитов, 104/л 7,0 ± 3,9 12,17 ± 4,9 12,2 ± 4,6*
Уровень ТЫР-а плазмы 98,75 ± 52,5 277,1 ± 79,42** 403,0 ± 183,71**> ***
Чистый гестоз (п = 10) (п = 14) (п = 21)
Адгезивные молекулы:
нейтрофилов 90,6 ± 1,8 38,16 ± 12,08** 38,0 ± 2,2**
моноцитов 94,8 + 1,7 55,5 ± 7,1** 54,1 ± 1,8**
лимфоцитов 9,1 + 2,5 4,6 ± 1,3* 4,7 + 1,4*
Г?стоз на <]юне ГБ (п — 4) (п = 8) (п= 11)
Вес тела, кг 71,9 ± 9,1 93,1 ± 10,О** 100,5 ± 12,4*
Суточная потребность клофелина, мкг 0,16 ± 0,13 0,29 ± 0,17 0,34 ± 0,15*
Прибавка веса, кг 8,3 + 4,7 10,3 ± 5,6 12,3 + 4,4*
Степень агрегации и. (АДФ2 нг/мл), % 78,0 + 5,9 49,4 ± 9,6** 53,15 + 8,8**
Степень агрегации и. (0,2 нг/мл), % 22,1 ± 4,3 22,8 ± 6,7 8,7 ± 2,9**’ ***
Скорость агрегации 1г. (2 нг/мл), % 65,0 ± 12,5 33,27 + 10,4** 41,5 ± 10,7**’ ***
Скорость агрегации 1г. (0,2 нг/мл), % 48,1 ± 11,2 22,6 ± 9,9** 17,4 + 7,6**
Адгезивные молекулы:
нейтрофилов 28,36 ± 2,73 41,4 + 2,0** 55,87 ± 8,95**
моноцитов 55,8 ± 10,92 55,65 ± 5,55 68,0 ± 10,68**
лимфоцитов 4,73 ± 0,70 4,25 ± 0,55 5,5 ± 0,61*’ ***
- р < 0,05 по сравнению с генотипом 1/1; **—/>< 0,01 по сравнению с генотипом 1/1; *** — р < 0,01 по сравнению с генотипом I/D.
более низкий уровень общего белка крови и количества тромбоцитов. Гомозиготы 4а/4а имеют резистентность показателей ьРА и РАМ к анти-коагулянтной терапии, более высокое содержание десквамированных эндотелиоцитов, худший исход
родов для новорожденного. В то же время у гетерозигот 4а/4Ь также определяется более выраженная эндотелиальная дисфункция по целому ряду показателей по сравнению с гомозиготами 4Ь/4Ь (табл. 4).
В нашем исследовании не выявлено ассоциа-
. 40
85 60
Рис. 2. Наиболее значимые проявления І/D полиморфизма гена АПФ при гестозе
Генотип І/І О Генотип І/D □ Генотип D/D ■ Аллель I □ Аллель D
1 — контроль; 2 — H І-ІІ чистая; 3 — Н I—II на фоне ГБ; 4 — гестоз на фоне
Таблица 4
Ассоциация полиморфизма гена еІЧОБ с клиническими показателями у беременных с гестозом
Показатель Вариант генотипа
4Ь/4Ь (п=46) 4Ь/4а (п=24) 4а/4а (п=3)
Срок появления отеков, нед 30,67 ± 4,9 28,7 ± 4,6 22,3 ± 4,2*’ ***
Срок протеинурии, нед 32,2 ± 5,8 31,7 ± 6,2 23,0 ± 6,4*’ ***
Протеинурия, г/л 0,66 ± 1,61 0,46 ± 1,58 2,28 ± 1,65*’ ***
Срок гипертензии, нед 28,1 ± 5,3 26,4 ± 4,8* 14,7 ± 3,7*’ ***
Суточная доза клофелина, мкг 0,24 ± 0,16 0,23 ± 0,14 0,45 ± 0,15*’ ***
Общий белок крови, г /л 64,34 + 4,99 64,54 ± 5,39 58,53 ± 5,15*’ ***
Количество тромбоцитов, 109/л 277,1 ± 82,7 252,3 ± 71,2 132,0 ± 76,3*’ ***
Фибриноген, г/л 4,05 ± 0,85 3,68 ± 0,67 4,62 ± 0,73***
Уровень Г-РА плазмы 3,17 ± 2,06 2,21 ± 1,89 2,08 ± 1,94
Уровень 1-РА плазмы после лечения НМГ 7,09 ± 1,56**** 4,85 ± 1,85*’ **** 3,35 ± 1,82*> ***
Уровень РА1-1 плазмы 250,4 ± 42,1 271,3 ± 33,4 268,4 ± 42,4
Уровень РАМ плазмы после лечения НМГ 159,4 ± 35,4**** 217,2 ± 36,6**< **** 229,1 + 31,6*’ ***
Фактор Виллебранда, % 156,97 ± 66,59 168,76 ± 75,9 173,88 ± 67,2
Количество эндотелиоцитов, 104/л 10,7 ± 3,5 14,4 ± 6,4 17,6 ± 4,1*
Срок родоразрешения, нед 36,99 ± 2,6 37,35 + 2,7 32,65 ± 2,9*’ ***
* — р < 0,05по сравнению с генотипом 4Ь/4Ь; ** — р < 0,01 по сравнению с генотипом 4Ь/4Ь; *** - ■ р < 0,05 по сравнению с генотипом 4а/4Ь; »*** р < () ()1 п0 сравнению с показателями до лечения.
ции полиморфизма 4а/4Ь гена еІЧОБ с чистым гестозом. При сочетанном гестозе отмечалось перераспределение генотипов в сторону увеличения частоты гомозигот аллеля 4а (3,9 %) и гетерозигот 4а/4Ь (38,1 %) за счет снижения гомозигот 4Ь (57,8 %), х2 = 0,6; (Ж для генотипа 4а/4а = 1,46; (Ж для генотипа 4а/4Ь = 1,26. Наибольшая частота генотипа 4а/4а отмечена у беременных с нефропатией I на фоне ВСД по гипертоническому типу - 11,1 % (х2= 4,87; (Ж = 4,38; р < 0,25), в меньшей степени — при сахарном диабете 1 типа. При нефропатии II степени и выше на фоне ВСД по гипертоническому типу генотип 4а/4а отсутствовал, однако имелось значительное увеличение частоты гетерозигот 4а/4Ь по сравнению с контро-
лем — до 58,3 % (х2 = 2,9 (Ж1 = 2,8 р < 0,5). Повышение частоты генотипа 4а/4Ь отмечено при сочетанном гестозе на фоне сахарного диабета беременных, тяжелом гестозе на фоне ВСД по гипертоническому типу и легком гестозе на фоне ГБ. У беременных с гестозом на фоне заболеваний почек и тяжелым гестозом на фоне ГБ — присутствует только генотип 4Ь/4Ь (рис. 3).
5. Ассоциация полиморфизма гена ЮТ-а с гестозом. При гестозе у гетерозигот (-238)АД]г отмечалась наибольшая прибавка веса, более раннее появление гипертензии, повышенная агрегацион-ная активность тромбоцитов и увеличение уровня многих маркеров эндотелиальной дисфункции по сравнению с гомозиготами (-238)0/0; (гомозиго-
С
S
н
0
1
60
40
g 20
о
н
о
1
Jj
100
80
60
40
20
0
Рис. 3. Проявление 4а/4Ь полиморфизма гена €N08 при гестозе в зависимости от фоновых заболеваний
Генотип 4а/4а □ Генотип 4а/4Ь □ Генотип 4Ь/4Ь ■ Аллель 4а □ Аллель 4Ь
1 — контроль; 2 — Н І—II на фоне ВСД; 3 — гестоз на фоне СЛ1; 4 — гестоз на фоне болезни почек
Таблица 5
Ассоциация полиморфизма гена ПЧГ-а с клиническими показателями у беременных с гестозом
Показатель Вариант генотипа
Генотип (-238)G/G (п=101) Генотип (-238)АД5 (п=16)
Прибавка веса, 10- 11,6714,15 14,5314,36*
Срок появления гипертензии, нед 27,95110,21 22,1919,88*
Время образования сгустка, мин 4,65±0,58 3,18+0,75**
Степень агрегации 1г. (АДФ2 нг/мл), % 56,45117,85 69,85118,65*
Степень агрегации (АДФ2 нг/мл), % после терапии НМГ 49,97117,82*** 65,67119,04*
Уровень ьРА плазмы 2,9412,13 2,0311,91
Уровень РА1-1 плазмы 188,2+44,9 235,7139,8*
Фактор Виллебранда, % 148,96172,15 198,78169,33*
Количество эндотелиоцитов, 104/л 10,415,13 14,514,79*
Адгезивные молекулы:
нейтрофилов 54,49117,2 67,92111,04
моноцитов 66,8118,74 73,5519,31*
лимфоцитов 5,110,83 5,7810,79*
Уровень ТОТ-а плазмы 220,27183,7 233,43 + 88,17
Уровень П-8 плазмы 94,17147,85 113,28159,44
— р < 0,01 по сравнению с данными до лечения.
* — р < 0,05; ** — р < 0,01 по сравнению с генотипом (-23Н)С/С; ***
ты (-238)А/А в исследуемых группах не отмечены). Результаты представлены в табл. 5.
При оценке взаимосвязи данного полиморфизма со степенью тяжести чистого гестоза выявлено, что у беременных с нефропатией I степени частота гетерозигот выше, чем в контрольной группе — соответственно 11,2 % по сравнению с 7,5 % (ОЙ. = = 1,46; %2 = 0,011), а при тяжелом гестозе (нефропатии II и выше) гетерозиготы (-238)А/С полностью отсутствуют. При сочетанном гестозе на фоне артериальной гипертензии отмечено значительное возрастание частоты гетерозигот на фоне ВСД по гипертоническому типу, при этом для легкого гестоза (нефропатия I степени) было характерно более значимое, достоверное увеличение частоты генотипа (-238)АД} до 36,3 % (%2 =
= 8,53; (Ж = 6,38; р < 0,05) по сравнению с более тяжелыми формами гестоза. У беременных с сочетанным гестозом на фоне заболевания почек отмечено значительное увеличение частоты генотипа (-238)АД}, причем достоверное, до 50 %, — в случаях легкого гестоза (х2 = 9,97; (Ж = 11,2 р < 0,05), тогда как все 4 беременные с тяжелым гестозом (более нефропатии II степени) на фоне почечной патологии имели генотип (-238)0/0. Наиболее значимые из полученных результатов представлены в рис. 4.
Обсуждение результатов
Изучение полиморфизма генов — кандидатов, предрасполагающих к развитию эндотелиальной
100
п
S
н
о
X
£
80
60
40
20
Рис. 4. Достоверное перераспределение полиморфизма (-238) А/Є гена ТОТ-а у беременных с гестозом
■ Генотип (-238)АДї □ Генотип (-238)0/0 в Аллель (-238)А О Аллель (-238)0
1 — контроль; 2 — Н I и ВСД по гипертоническому типу; 3 — гестоз и болезни почек; 4 — гестоз и СД беременных; * — р < 0,05
дисфункции и в частности к развитию гестоза, выявило взаимосвязь клинико-лабораторных показателей, характеризующих тяжесть гестоза, с увеличением уровня маркеров эндотелиальной дисфункции и наличием мутантных генотипов. При этом нами отмечено перераспределение частоты мутантных аллелей и генотипов у беременных с гестозом в зависимости от тяжести самого гестоза, а также от наличия и выраженности сочетанной патологии.
В целом при гестозе имеется незначительное увеличение мутантных генотипов I/I гена PLAT, (-238)A/G гена TNF-a, 4а/4Ь гена eNOS. Более выраженное перераспределение в сторону увеличения частоты мутантных генов отмечено для генотипа 4G/4G гена PAI-1.
При сочетанном гестозе отмечена гораздо большая частота мутантных генотипов — I/I гена PLAT, (-238)A/G гена TNF-a и 4а/4Ь гена eNOS. Отмечено также повышение частоты генотипа 4а/4а гена eNOS.
Частота мутантных генотипов PLAT, PAI-], eNOS и TNF-a еще более высока у беременных с тяжелым гестозом на фоне ВСД по гипертоническому типу. Однако максимальная частота этих генотипов наблюдается у беременных с легким гестозом на фоне ВСД по гипертоническому типу. Таким образом, можно заключить, что у беременных с сочетанным нетяжелым гестозом на фоне функциональных фоновых нарушений гемодинамики полиморфизм генов, принимающих участие в регуляции функции эндотелия, играет значительную роль.
Аналогичная картина наблюдается и у беременных с гестозом на фоне почечной патологии, однако для сочетанного гестоза на фоне заболеваний почек характерно в первую очередь достоверное увеличение мутантного генотипа renaTNF-а. Наличие такого генотипа очевидно указывает на выраженную предрасположенность к развитию воспалительных нарушений в мочеполовой системе и, как следствие, — увеличенный риск развития сочетанного гестоза.
При гестозе на фоне гипертонической болезни отмечена возрастающая частота мутантного генотипа D/D гена АСЕ. При этом для легкого гестоза характерна также значительная частота генотипа 4а/ 4а гена eNOS. Очевидно, для сочетанного легкого гестоза на фоне ранее имевшихся выраженных нарушений микроциркуляции характерны как патогенетические черты, общие с предыдущими подгруппами, так и дополнительные факторы, в частности, более значимые изменения в ренин-ан-гиотензиновой системе и дисбалансе оксида азота, обусловленные полиморфизмом генов АСЕ и eNOS. При тяжелом гестозе на фоне ГБ достаточно высокая частота мутантных генотипов генов PAI-1 и АСЕ
позволяет их считать серьезными кандидатами в гены предрасположенности к тяжелому гестозу.
При чистом гестозе, без выявленных фоновых заболеваний, картина распределения мутантных генотипов выглядит иначе. При легком гестозе (нефропатия I степени) наблюдается увеличение частоты полиморфизмов всех исследованных генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, в том числе увеличенная частота D/D генотипа гена АПФ, не проявляющаяся при легком сочетанном гестозе. Для чистого тяжелого гестоза характерно достаточно значимое увеличение частоты генотипов 4G/4G гена PAI-1 и D/I гена АСЕ.
Наши данные о распределении частоты мутантных генотипов при гестозе убедительно показывают, что гестоз представляет собой синдром, в состав которого входят различные патологические состояния, объединенные сходными клиническими проявлениями, но имеющими различные пути развития. Очевидно, что имеется отчетливая взаимосвязь полиморфизма генов PLAT, PAI и особенно TNF-a с предшествующей беременности эндотелиальной дисфункцией фоновых заболеваний, а также с нарушением функции эндотелия при «чистой» нефропатии 1 степени. Возможно, нефропатия 1 служит первым клиническим проявлением той хронической эндотелиальной дисфункции, которая возникает у большой части пациенток впоследствии, и которая сохраняется даже через несколько лет после родоразрешения [18].
При чистом тяжелом гестозе количество и частота мутантных генотипов генов, регулирующих функцию эндотелия, значительно меньше, чем при гестозе в целом. По-видимому, генетическая предрасположенность к чистым тяжелым гесто-зам в первую очередь связана (помимо предрасположенности к эндотелиальной дисфункции) с особенностями материнско-эмбриональных взаимодействий генов, что требует дальнейшего изучения.
Тем не менее очевидно, что генетическое тестирование пациенток для определения совокупности полиморфизмов генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, уже сейчас позволяет выявить повышенную степень риска развития гестоза у будущей матери.
Литература
1. Аипамазян Э. К. Неотложная помощь при
экстремальных состояниях в акушерской практике. —
3-е изд. — СПб., «Издательство Н-Л» 2002. — 281 с. с ил.
2. Баранов В. С., Баранова Е. В., Иващенко Т. Э. и др.
Геном человека и гены «предрасположенности».
(Введение в предиктивную медицину). — СПб.,
«Интермедика», 2000 — 272 с.
3. Елисеева Ю. Е. Ангиотензин-превращающий фермент, его физиологическая роль//В-сы мед. химии. — 2001. — № 1. — С. 43-54.
4. Супряга О. М. Роль эндотелиальной дисфункции в генезе гипертензивных состояний у беременных// Акуш. Гин. — 1995. — № 6. — С. 5-9.
5. Bashford М. Т., Michael Т., Hefler L. et al. Angiotensinogen and endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms among Hispanic patients with preeclampsia//Am J. Obstet Gynecol. — 2001; 184. —
P. 1345-51.
6. Buttke Т. М., Sandstrom P. A. Oxidative stress as a mediator of apoptosis//Immunol. Today. — 15 (1994). —
P. 7-10.
7. Cooper D. W, Brennecke S. P., Wilton A. N. Genetics of preeclampsia//Hypertens Pregn. — 1993; 12. — P. 1—23.
8. Dekker G. A., Sibai В. M. Etiology and pathogenesis of preeclampsia: Current concepts.//Am J Obstet Gynecol. — 1998; 179. - P. 1359-75.
9. Eriksson P., Kallin B., van’t Hooft F. M. et al. Allele-specific increase in basal transcription of the plasminogen-activator inhivitor 1 gene is associated with myocardial infarction//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1995.— Vol. 92. — P. 1851-1855.
10. Folio M, Ginsburg D. Structure and expression of the human gene encoding plasminogen activator inhibitor, PAI-1//Gene. — 1989; 84. - P. 447-453.
11. Glueck C. J., Phillips H., Cameron D. et al. The 4G/4G polymorphism of the hypofibrinolytic PAI-1 gene: An independent risk factor for serious pregnancy complications//Metabolism. — 49 (2000). — P. 845—852.
12. Jaana Т. М., Heiskanen М. М., Pirskanen M. J. et al. Insertion-deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converting enzyme is associated with obstetric cholestasis but not with preeclampsia//Am J Obstet Gynecol. - 2001; 185. - P. 600-3.
13. Katz S. D., Rao R., Berman J. et al. Pathophysiological correlates of increased serum tumor necrosis factor in patients with cingestive heart failure. Relation to nitric oxidedependent vasodilation in the forearm circulation// Circulation. - 90 (1994). - P. 12-16.
14. Knowles R. G., Moncada S. Nitric oxide synthases in mammals// Biochem J. — 1994; 298. — P. 249—58.
15. Lachmeijer A. М., Crusius J. B., Pats G, Dekker G. A., Arngtfmsson R, ten Kate L. P. Polymorphisms in the tumor necrosis factor and lymphotoxin-alpha gene region and preeclampsia//Obstet Gynecol. — 2001; 98. —
P. 612-9.
16. Livingston J. C., Park V, Barton J. R., Elfering S., Haddad B., Mabie W. C., et al. Lack of association of severe preeclampsia with maternal and fetal mutant alleles
for tumor necrosis factor alpha and lymphotoxin alpha genes and plasma tumor necrosis factor alpha levels//Am J. Obstet Gynecol. — 2001 ;184. — P. 1273—7.
17. Matsumori A., Yamada T., Suzuki H. et al. Increased circulating cytokines in patients with myocarditis and cardiomyopathy//Brit. Heart J. — 72 (1994). — P. 561-566.
18. Ness R. B., Roberts J. M. Heterogeneous causes constituting the single syndrome of preeclampsia: A hypothesis and its implications//Am J. Obstet Gynecol. — 1996; 175. - P. 1365-70.
19. Nishikawa S, Miyamoto A, Yamamoto H, Ohshika H, Kudo R The relationship between serum nitrate and endothelin-1 concentrations in preeclampsia//Life Sci. — 2000, Aug 11; 67( 12). - P. 1447-54.
20. Soebbing D, Dorman K, Gregg A. R. A NOS3 polymorphism is associated with preeclampsia//Am J. Obstet Gynecol. — 1999; 180 (1 Pt 2): S18.
21. Tempfer C., Soebbing D., Dorman K., Gregg A. R.
A NOS3 polymorphism is associated with preeclampsia// Am J. Obstet Gynecol. — 1999; 180 (1 Pt 2): S18.
22. Tuddenham E. G. D., Cooper D.N. The Molecular Genetics of Haemostasis and its Inherited Disorders. — Oxford Monographs on Medical Genetics N 25. «Oxford University Press». 1994. — 585 p.
23. Wilson A. G., Symons J. A. et al. Effects of a polymorphism in the human TNF-a promoter on transcriptional activation//PNAS. — 1997. — Vol. 94. —
P. 3195-3199.
24. Yamada N., Arinami T., Yamakawa-Kobayashi K. et al. The 4G/5G polymorphism of the plasminogen activator inhibitor-1 gene is assotiated with severe preeclampsia// J. Hum. Genet. - 45 (3), 2000. - P. 138-41.
25. Zhao Y., Zhang W., Wang L. [Changes of plasma nitric oxide and endothelin levels in normal pregnant women and pregnancy induced hypertension]// Zhonghua Yi Xue Za Zhi. - 1998 Jun; 78 (6). - P. 457-9 .
26. Zhou N., Yu P., Chen J. et al. [Detection of insertion/ deletion polymorphism of angiotensin converting enzymegene in preeclampsia]//Chinese. — Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. — 1999, Feb 10; 16 (1). —
P. 29-31.
RESEARCH OF GENETIC PREDISPOSITION TO GESTOSIS:
POLYMORPHISM OF GENES, PARTICIPATING
IN VASOREGULATION OF FUNCTIONS ENDOTHELIUM
Mozgovaja E. V.
■ Key words: pregnancy, polymorphism of genes, endothelium
dysfunction, gestosis
