CC BY
464
УДК 615.038-073:582.824
ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛАВОНОИДНОГО СОСТАВА ТРАВЫ ЗВЕРОБОЯ ПЯТНИСТОГО МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Л.Н. Зимина, В.А. Куркин, В.М. Рыжов,
ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»
Куркин Владимир Александрович - e-mail: vakur@samaramaii.ru
С использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) проведено исследование флавоноидного состава травы зверобоя пятнистого (Hypericum maculatum Crantz.). В водно-спиртовом извлечении из травы данного растения идентифицированы гиперозид, рутин и кверцетин. Установлено, что доминирующим флавоноидом травы зверобоя пятнистого является гиперозид, обладающий антидепрессантной активностью.
Ключевые слова: зверобой пятнистый, Hypericum maculatum Crantz., трава, флавоноиды, гиперозид,
высокоэффективная жидкостная хроматография, стандартизация.
With the using of high performance liquid chromatography the study of flavonoid composition of Hypericum macu-latum Crantz. herbs there was developed. In the water-ethanol extract hyperoside, rutin and quercetin there were identified. There was established, that the predominant flavonoid of Hypericum maculatum Crantz. herbs is hypero-side, which has the antidepressive activity.
Key words: Hypericum maculatum Crantz., herbs, flavonoids, hyperoside, high performance liquid chromatography, standardization.
Введение
В настоящее время в медицинской практике используются два фармакопейных вида рода Зверобой (Hypericum L.) -зверобой продырявленный (Hypericum perforatum L.) и зверобой пятнистый (Hypericum maculatum Crantz.) (синоним: зверобой четырехгранный - Hypericum quadrangulum L.), сырье которых служит источником противовоспалительных, бактерицидных, вяжущих и антидепрессантных лекарственных препаратов [1-8]. Известно, что действующими веществами травы зверобоя являются флавоноиды (гиперозид,
рутин, бисапигенин), антраценпроизводные (гиперицин), флорглюцины (гиперфорин) и дубильные вещества [9-14],
однако результаты ранее проведённых исследований свидетельствуют о том, что фармакопейные виды зверобоя имеют некоторые отличия в химическом составе [15-17]. С учетом недостаточной степени изученности химического состава травы зверобоя пятнистого, а также выявленной нами антидепрессантной активности для флавоноидных гликозидов -гиперозида и бисапигенина, представляло интерес углубленное изучение состава флавоноидов сырья данного растения.
Цель работы: изучение флавоноидного состава травы зверобоя пятнистого с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Материалы и методы
Исследовали воздушно-сухой образец травы зверобоя пятнистого, собранный в Республике Марий Эл (Медведевский район) в фазу цветения (июль 2008 г.).
В качестве веществ сравнения использованы рабочие стандартные образцы (РСО) гиперозида, рутина и кверцетина, полученные нами ранее из сырья зверобоя продырявленного [7].
В ходе качественного и количественного ВЭЖХ-анализа использовали водно-спиртовое извлечение, полученное из травы зверобоя пятнистого с использованием 70% этилового спирта.
ВЭЖХ-анализ осуществляли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе «Милихром-5» в изократическом режиме (колонка КАХ 6-80-4 № 6 25.01.99, стационарная фаза - «Берагоп С18»). Подвижной фазой в анализе служила смесь ацетонитрила и воды в различных соотношениях с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты. Скорость потока при анализе составляла 0,1 мл/мин. Детекцию флавонои-дов проводили при аналитической длине волны \тах 360 нм. Для обнаружения возможных сопутствующих веществ использовали дополнительные длины волн: 254; 270; 290; 330 нм.
Результаты и их обсуждение
На начальном этапе были проведены исследования по подбору оптимальных условий хроматографирования. В подобранных оптимальных условиях разделения на ВЭЖХ-хроматограмме водно-спиртового извлечения из травы зверобоя пятнистого четко видны четыре пика (рис. 1).
Для идентификации пиков веществ в аналогичных условиях были проанализированы РСО рутина, гиперозида и кверцетина (рис. 2-4). Достоверность идентификации пиков флавоноидов на хроматограмме извлечения из травы зверобоя пятнистого подтверждена также использованием в методике анализа соответствущего внутреннего стандартного вещества.
2.700--1--1--1--1-1--1--1--1-1--1--1--1-1--1--1--1- Н
2.500
2 . ООО
1.500 1.000 0.500 О. ООО
о
РИС. 1.
Хроматограмма извлечения из травы зверобоя пятнистого
(подвижная фаза: ацетонитрил: вода, 25:75 с добавлением 1%уксусной кислоты).
На основе результатов исследований идентифицированы три пика на ВЭЖХ-хроматограмме (рис. 1), среди которых пик № 3 со временем удерживания 3,496 мин. соответствует гиперозиду, пик № 4 со временем удерживания 14,237 мин. - кверцетину. В области, соответствующей времени удерживания РСО рутина (3,141 мин.), в аналогичных усло-
виях хроматографирования обнаружен незначительный пик рутина (рис. 1).
РИС. 2.
Хроматограмма РСО кверцетина.
РИС. 3.
Хроматограмма РСО гиперозида.
РИС. 4.
Хроматограмма РСО рутина.
С целью количественного определения содержания отдельных флавоноидов анализ извлечения из травы зверобоя проводили по нижеприведенной методике.
Методика количественного определения содержания
флавоноидов в траве зверобоя пятнистого. Около 1 г (точная навеска) воздушно-сухого образца измельченного сырья с размером частиц, проходящих через сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещали в колбу с притертой крышкой емкостью 100 мл, добавляли 40 мл 70% этилового спирта. Колбу взвешивали на тарирных весах с точностью до ±0,01 г и присоединяли к обратному холодильнику. Экстракцию осуществляли при нагревании на кипящей водяной бане в течение 60 мин. Извлечение охлаждали, доводили на тарирных весах до первоначальной массы 70% этиловым спиртом и фильтровали через бумажный фильтр с красной полосой.
5 мкл полученного извлечения вводили в хроматограф
«Милихром-5» и хроматографировали со скоростью потока
0,1 мл/мин. Детекцию анализируемых веществ проводили
при аналитической длине волны \тах 360 нм. Анализ осуществляют в трех повторностях.
Параллельно осуществляли анализ растворов РСО рутина, кверцетина, гиперозида при длине волны 360 нм.
Содержание флавоноидов в процентах (Х) в траве зверобоя пятнистого в пересчете на абсолютно сухое сырье и соответствующий стандарт вычисляли по формуле:
НхтрсохУкхУпх\0 0x100
■Л —--------------------------------- где
НРСОхтхГпхГкх(Ю0-Ж) , д
Н - значение высоты пика определяемого флавоноида на хроматограмме испытуемого раствора;
НРСО - высота пика на хроматограмме раствора соответствующего РСО;
УК - объём разведения пробы, мл;
УП - объём пробы раствора, вводимого в колонку, мкл;
т - масса сырья, г;
тРСО - масса РСО, г.
Установлено, что содержание доминирующего флавоноида - гиперозида - в траве зверобоя пятнистого составляет 6,50%, тогда как рутин содержится в сырье данного растения в следовых количествах. Содержание кверцетина в траве зверобоя пятнистого составляет 0,23%. Результаты данных исследований свидетельствуют о том, что в траве зверобоя пятнистого доминирующим флавоноидом является гиперо-зид и, следовательно, этот вид отличается от зверобоя продырявленного, в сырье которого преобладает рутин. Принимая во внимание то обстоятельство, что гиперозид в отличие от рутина обладает антидепрессантной активностью [7], актуальным является сравнительное фармакологическое изучение фармакопейных видов в плане обоснования их использования в качестве источника антидепрессантов. Кроме того, одним из путей совершенствования стандартизации сырья и препаратов зверобоя, с учетом видовой принадлежности, является использование ВЭЖХ, позволяющей объективно оценивать подлинность и качество ЛРС [18].
Таким образом, проведено ВЭЖХ исследование компонентного состава травы зверобоя пятнистого. Установлено наличие и определены концентрации двух фармакологически активных компонентов - гиперозида и кверцетина. Показана перспективность использования метода ВЭЖХ в анализе сырья и препаратов зверобоя пятнистого.
Выводы
1. Изучен флавоноидный состав травы зверобоя пятнистого методом ВЭЖХ.
2. На хроматограмме водно-спиртового извлечения травы зверобоя пятнистого идентифицированы кверцетин, рутин и гиперозид, причем последний является доминирующим флавоноидом, и его содержание в сырье составляет 6,50%.
3. Показана перспективность использования метода ВЭЖХ для стандартизации травы зверобоя пятнистого и препаратов на основе сырья данного растения.
ш
ЛИТЕРАТУРА
1. Государственный реестр лекарственных средств. Том I. Официальное издание. Москва. 2008. 1398 с.
2.Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Дубищев А.В., Кадацкая Д.В., Запесочная Г.Г., Жданов И.П. Исследование сырья и препаратов зверобоя. Фармация. 2005. Т. 53. № 3. С. 23-25.
3. Куркин В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов). 2-е изд., перераб. и доп. Самара: ООО «Офорт»; ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава», 2007. 1239 с.
4. Куркин В.А., Дубищев А.В., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н. Изучение нейротропной активности новых лекарственных препаратов из травы зверобоя. Медицинский альманах. 2009. № 4. С. 33-36.
5.Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н., Дубищев А.В., Буланкин Д.Г., Корчагина Д.В. Актуальные аспекты создания нейротропных фитопрепаратов. Медицинский альманах. 2009. № 1. С. 46-49.
6.Куркин В.А., Правдивцева. О.Е., Зимина Л.Н. Антидепрессантная активность препаратов травы зверобоя. Фармация. 2010. Т. 58. № 5. С. 40-41.
7. Куркин В.А., Правдивцева О.Е. Зверобой: итоги и перспективы создания лекарственных средств: Монография. Самара: ГОУ ВПО «СамГМУ»; ООО «Офорт», 2008. 127 с.
8. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Pаeoniaceae - Thymaeleaceae. Л.: Наука, 1985. С. 11-19.
9.Беленовская Л.М., Буданцев А.Л. Продукты вторичного метаболизма Hypericum perforatum L. и их метаболическая активность. Растительные ресурсы. 2004. Т. 40. Вып. 3. С. 131-153.
10. Китанов Г.М., Блинова К.Ф. Современное состояние химического изучения видов рода Hypericum. Химия природных соединений. 1987. № 2. C. 185203.
11. Куркин В.А., Правдивцева О.Е. Флавоноиды надземной части Hypericum perforatum L. Химия природных соединений. 2007. № 5. С. 512-513.
12. Куркин В.А., Правдивцева О.Е., Зимина Л.Н. Вопросы стандартизации сырья и препаратов зверобоя. Фармация. 2007. Т. 55. № 4. С. 12-14.
13. Куркин В.А., Правдивцева О.Е. Флавоноиды надземной части Hypericum perforatum. Химия природных соединений. 2007. № 5. С. 512-513.
14. Куркин В.А., Правдивцева О.Е. Сравнительное исследование содержания суммы флавоноидов и антраценпроизводных в препаратах травы зверобоя. Химико-фармацевтический журнал. 2008. Т. 42. № 10. С. 39-42.
15. Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Исследования по обоснованию новых подходов к стандартизации сырья и препаратов зверобоя продырявленного. Химия растительного сырья. 2008. № 1. С. 81-86.
16. Правдивцева О.Е., Куркин В.А., Зимина Л.Н. Обоснование ресурсосберегающих технологий производства и переработки сырья зверобоя. Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2008. Т. 2. С. 156-158.
17. Правдивцева О.Е., Куркин В.А. Сравнительное исследование химического состава надземной части некоторых видов рода Hypericum L. Химия растительного сырья. 2009. № 1. С. 79-82.
18. Самылина И.А., Баландина И.А. Пути использования лекарственного растительного сырья и его стандартизация. Фармация. 2004. Т. 52. № 2. С. 39-41.
