CC BY
63
УДК 615.322
ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ УРОЛОГИЧЕСКОГО СБОРА МЕТОДОМ ВЭЖХ-МС
© Е.А. Лукша, Г.И. Калинкина , Н.Э. Коломиец
Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт,
2/7, Томск, 634050 (Россия) E-mail: galina_kalinkina@mail.ru
Методом ВЭЖХ-МС с последовательным УФ-детектированием изучен качественный состав флавоноидов и феноло-кислот нового урологического сбора. Идентификация фенольных соединений проведена путем сравнения с базой данных известных компонентов. Установлено наличие б-метокси-7-O-P-D- глюкопиранозилкумарина, гиперозида (кверце-тин-3-О-Р-Б-галактопиранозид), авикулярина (кверцетин-3-О-Р^-арабинозид), кверцитрина (кверцетин-3-O-a-L-рамнопиранозид), кверцетина (7,5,3,3',4'-тетраоксифлавон), О-гликозид лютеолина.
Ключевые слова: лекарственные растения, химический состав, высокоэффективная жидкостная хроматография, фенольные соединения, флавоноиды, гидрооксикоричные кислоты.
Введение
Нами предложен новый урологический сбор, в состав которого включены лекарственные растения научной и народной медицины: листья березы, трава спорыша, трава хвоща полевого, побеги курильского чая и другие [1]. Для разработки методик стандартизации сбора необходимо было изучить его химический состав и определить наиболее значимые биологически активные вещества (БАВ). Исследование показало, что доминирующим компонентом БАВ сбора являются фенольные соединения. Методами хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента в составе сбора идентифицированы флавоноиды: кверцетин, рутин, гиперо-зид, авикулярин, лютеолин, апигенин; фенолокислоты: хлорогеновая, феруловая, кофейная; арбутин.
Для уточнения и дополнения полученных результатов использовали метод высокоэффективной жидкостной хромато-масс-спектрометрии.
Экспериментальная часть
Извлечение суммы фенольных веществ из сбора проводили трехкратной экстракцией 70% этанолом (соотношение «сырье/экстрагент» - 1 : 5) в течение 60 мин с обратным холодильником на водяной бане при температуре 60-70 °С. Водно-спиртовый экстракт фракционировали по общепринятой схеме на хлороформную, этилацетатную и бутанольную фракции, которые использовали для изучения качественного состава фенольных соединений.
Хроматографический анализ проводили на жидкостном хроматографе с диодно-матричным УФ- и масс-селективным детекторами («Agilent 1100 Series LC/MSD»). Диодно-матричный детектор позволил провести детектирование и запись спектров поглощения в диапазоне длин волн (230-500 нм). Масс-селективный детектор позволяет определять молекулярную массу компонентов с точностью 0,1 а.е. Для масс-селективного детектора (модель G1946C) использовали метод химической ионизации при атмосферном давлении (APCI). Проводили сканирование положительных (positive scan) и отрицательных ионов (negative scan) с соотношением m/z от 100 до 1200. Напряжение на фрагментаторе для положительных ионов 40 вольт, для отрицательных - 70 вольт. Поток газа-осушителя (азота) - 7 л/мин при температуре 340 °С, давление на распыли-
* Автор, с которым следует вести переписку.
теле 60 psi (фунтов на квадратный дюйм), температура испарителя 400 °С. Детектирование выходящего из колонки элюента осуществляли одновременно на двух полосах поглощения: 270-310 нм (в этом диапазоне видны все ароматические соединения) и 320-360 нм (область более специфична для природных соединений типа ксантонов, флавонов и кумаринов). Во всех случаях поглощение фиксировалось относительно контрольной полосы 800-900 нм. Разделение проводили на колонке с обращенной фазой «Zorbax Rx-C18», 4,6 X 150 мм (наполнитель с диаметром частиц 5 мкм, размер пор 80 А). Элюент - смесь 2,3% НСООН-МеОН (линейный градиент от 20 до 90% МеОН с 5-й до 10-й минуты), 1 мл/мин.
Для идентификации фенольных соединений использовали известные вещества фенолокислот, кумаринов и флавоноидов. При выборе предполагаемой структуры веществ брали следующие параметры: время удерживания (tR) исследуемых веществ в сравнении с известными образцами, характеристические данные УФ- и масс-спектров веществ, соответствующих пикам на хроматограммах ВЭЖХ. Для подтверждения полученных результатов дополнительно использовали базы данных и обзорные статьи специальной литературы по основным спектральным и физико-химическим характеристикам природных соединений [2-5].
Обсуждение результатов
Полученные ВЭЖ-хроматограммы в режиме УФ-детектирования при длине волны 280 и 340 нм имели различный вид и разное число пиков (рис. 1-4).
Наиболее информативной является хроматограмма масс-селективного детектирования в двух режимах (APCI positive scan и APCI negative scan) При регистрации положительных ионов в режиме химической ионизации (ХИ) при атмосферном давлении (APCI) обычно фиксируется псевдомолекулярный ион - [М+Н]+ (APCI, Pos. Scan). В этом случае для вычисления молекулярной массы необходимо сделать поправку на «-1» от максимального значения m/z (из интенсивных пиков). При регистрации отрицательных ионов в режиме ХИ при атмосферном давлении (APCI) фиксируются депротонированные молекулы. В этом случае на масс-спектрах режима APCI, Neg. Scan для вычисления молекулярной массы вещества необходимо сделать поправку на «+1» к максимальному значению m/z (из интенсивных пиков).
Рис. 1. Хроматограмма этилацетатной фракции в Рис. 2. Хроматограмма этилацетатной фракции в
режиме УФ-детектирования при длине волны 280 нм режиме УФ-детектирования при длине волны 340 нм
Рис. 3. Хроматограмма этилацетатной фракции с Рис. 4. Хроматограмма этилацетатной фракции сбо-
масс-селективным детектором в режиме APCI, Neg. ра с масс-селективным детектором в режиме APCI,
Scan Pos. Scan
На хроматограмме этилацетатной фракции пик со временем удерживания 1,67 мин имеет УФ-спектр с тремя основными максимумами поглощения: 248, 298 и 324 нм (рис. 5). Предположительно мы идентифицировали это вещество как производное кумарина. В режиме ХИ APCI, Pos. Scan (рис. 7) в масс-спектре присутствует пик с m/z=355,1 (50%), а в режиме ХИ APCI, Neg. Scan - с m/z=353,1 (100%) (рис. 8), что отвечает пикам молекулярного иона+протон [М+Н]+ и [М-Н]+ соответственно.
Пик фрагмента молекулярного иона m/z 163,1 (100%) в режиме ХИ APCI, Pos. Scan доказывает глико-зидную природу вещества, а пик фрагмента молекулярного иона m/z 191,1 (18%) в режиме ХИ APCI, Neg. Scan подтверждает наличие агликонового остатка (рис. 6, 7). Таким образом, предполагаемое вещество можно отнести к 6-метокси-7-О-р-Б-глюкопиранозилкумарину.
Таким образом, опираясь на УФ- и масс-спектры, снятые в двух режимах химической ионизации, получена информация, позволяющая подтвердить качественный состав БАВ сбора. Результаты представлены в таблице.
m AU
600 500 400 300 200 100
Рис. 5. УФ-спектр веществ со временем удерживания 1,67 мин
СП
с Мах: 246292
СН2ОН + н3соч
н Л—°ч Т і
г/ н . JL X®
ФН СН2ОН Í
но 1 г н ) 0 Р
н он н \/ Н N. 1
1C пн н
m/z 163 [СбНц05]+ HoN_JZ Н Ln Li“.'
h Ьн п
Масс спектр, ХИ, m/z, I (%): 355 [М+Н]+ (50), 163 [СбНц05]+ (100)
N
о гч ГЧ -с— О
СП LO п о
СП СП 1 1
200 250 300 350 m/z
Рис. 6. Масс-спектр фрагментов молекулярного иона 6-метокси-7-0-Р-Э-глюкопиранозилкумарина в режиме ХИ APCI, Pos. Scan
Рис. 7. Масс-спектр фрагментов молекулярного иона 6-метокси-7-0^-Э-глюкопиранозилкумарина в режиме ХИ APCI, Neg. Scan
Результаты идентификации биологически активных веществ сбора методом ВЭЖХ-МС
Время удерживания Величина m/z (молекулярная масса) Вещество
1,67 354 6-метокси-7-О-Р-Б-глюкопиранозилкумарин
4,6 464 Гиперозид (кверцетин-З-О-Р-Б-галактопиранозид)
5,7 434 Авикулярин (кверцетин-З-О-Р-Б-арабинозид)
6,2 448 Кверцитрин (кверцетин-3-О-а-Ь-рамнопиранозид)
9,3 302 Кверцетин (7,5,3,3 ' ,4 ' -тетраоксифлавон)
10,2 446 О-гликозид лютеолина
Выводы
Таким образом, методом ВЭЖХ-МС в составе нового урологического сбора дополнительно установлено присутствие 6-метокси-7-О-Р-Э-глюкопиранозилкумарина, гиперозида (кверцетин-3-О-Р-Э-галактопи-ранозид), авикулярина (кверцетин-3-О-Р-Б-арабинозид), кверцитрина (кверцетин-3-О-а-Ь-рамнопиранозид), кверцетина (7,5,3,3',4'-тетраоксифлавон), О-гликозид лютеолина.
Список литературы
1. Патент №2314116 РФ. Лекарственное средство, обладающее комплексным диуретическим, противомикробным и противовоспалительным действием / Е.А. Лукша, Г.И. Калинкина, Н.Э. Коломиец / 26.06.2006.
2. Горохова В.Г., Тюкавкина Н.А., Бабкин В.А. Высокоэффективная жидкостная хроматография растительных фенольных соединений // Четвертый Всесоюзный симпозиум по фенольным соединениям: Тез. докл. Ташкент, 1982. 21 с.
3. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Браудэ Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М., 1986. 288 с.
4. Pietta P., Mauri P., Bruno A., Rava A., Manera E., Ceva P. Identification of flavonoids from Ginkgo biloba L., Anthemis nobilis L. and Equisetum arvense L. by high-performance liquid chromatography with diode-array UV detection // Journal of Chromatography A. 1991. V. 553. P. 223-231.
5. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B. The systematic identification of flavonoids. New York-Heidelberg-Berlin. 1970. 354 p.
Поступило в редакцию 10 декабря 2008 г.
