ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ ТВЕРДОДИСПЕРСНОЙ И КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ ФОРМ АНТИВИРУЛЕНТНОГО СРЕДСТВА ФТОРТИАЗИНОН У КРЫС Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

@ CD

УДК 615.038

RESEARCH ARTICLE 3. Medical sciences

Corresponding Author: Mark V. Savitskii, Laboratory of Pharmacokinetics andMetabolomic Analysis, Sechenov

University

E-mail: savitsky. mark@gmail. com

© Samojlov V.M., Savitskii M.V., Romashkina A.G., Baskhanova S.N. Appolonova S.A. - 2023

| Accepted: 30.07.2023

http://dx.doi.org/A0.26787/nydha-2686-6838-2023-25-7-57-62

ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ ТВЕРДОДИСПЕРСНОЙ И КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ ФОРМ АНТИВИРУЛЕНТНОГО СРЕДСТВА ФТОРТИАЗИНОН У КРЫС

Самойлов1 В.М., Савицкий2 М.В., Ромашкина1 А.Г., Басханова2 С.Н., Апполонова2 С.А.

1 Сеченовский Университет, г. Москва, Российская федерация

2Лаборатория фармакокинетики и метаболомного анализа, Институт трансляционной медицины и биотехнологии, Сеченовский Университет, г. Москва, Российская федерация

Аннотация. Распространяющаяся устойчивость патогенных бактерий к антибиотикам представляется серьезной проблемой для здравоохранения. Снижение чувствительности возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикотерапии снижает эффективность лечения, подвергая жизни пациентов опасности. Для преодоления антибиотикорезистености в НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи был разработан новый антивирулентный препарат фтортиазинон (ФТ). Препарат ингибирует систему секреции третьего типа и подвижность жгутиков многих грамотрицательных бактерий. Препарат показал терапевтическую активность в отношении ряда патогенных микроорганизмов, таких как Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Chlamydia trachomatis, Salmonella enterica Typhimurium и др. Для поиска подходящей формы для последующей разработки препарата были изготовлены твердодисперсная и кристаллическая формы ФТ. Цель данного исследования - изучить фармакокинетику двух форм ФТ, чтобы найти форму, обеспечивающую наиболее высокую биодоступность. Для сравнительного изучения фармакокинетики крысам однократно ввели пероральную дозу 50 мг/кг препарата либо в твердой дисперсионной, либо в кристаллической форме. Определение ФТ и его метаболита проводили при помощи анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, сопряженной с тандемной масс-спектрометрией. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что твердая дисперсионная форма ФТ имеет более высокую пероральную биодоступность в 235,4% по сравнению с кристаллической формой у крыс. Таким образом, было показано, что на основании фармакокинетического исследования твердая дисперсная форма может считаться более подходящей для дальнейшей разработки лекарственной формы за счет повышенной биодоступности, что позволит повысить абсорбцию и терапевтический потенциал разработанного препарата.

Ключевые слова: ВЭЖХ-МС/МС, фтортиазинон, фармакокинетика, плазма, доклинические исследования, количественное определение, тандемная масс-спектрометрия.

PHARMACOKINETICS OF SOLID DISPERSION AND CRYSTALLINE FORMS OF THE ANTI-VIRULENCE DRUG FLUOROTHIAZINON IN RATS

Samojlov1 V.M., Savitskii2M. VRomashkina1 A.G., Baskhanova2 S.N. Appolonova2 S.A.

1 Sechenov University, Moscow, Russian Federation

2Laboratory of Pharmacokinetics and Metabolomic Analysis, Institute of Translational Medicine and Biotechnology, Sechenov University, Moscow, Russian Federation

Abstract. Prevalent drug resistance of pathogenic bacteria is a major concern for healthcare. Decreased bacterial susceptibility to antibiotics reduces treatment efficiency, putting lives of patients at risk. To overcome this issue, a novel anti-virulence drug Fluorothiazinon (FT) was developed. The drug inhibits type three secretion system and flagella motility of many Gram-negative bacteria. It showed therapeutic activity against a number of pathogenic

2023. Vol. 25. № 7

Issue Doi: 10.26787/nydha-2686-6838-2023-25-7

E-ISSN 2686-6838

microorganisms, such as Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Chlamydia trachomatis and Salmonella enterica Typhimurium among others. To find appropriate form for subsequent drug development solid dispersion and crystalline forms of FT were manufactured. In this study we aimed to investigate pharmacokinetics of FT in two forms to find the formulation with higher bioavailability. For comparative pharmacokinetics study rats were allocated to receive a single oral dose 50 mg/kg of the drug in either solid dispersion or crystalline forms. Determination of FT and its metabolite was carried out by high-performance liquid chromatography - tandem mass-spectrometry analysis. Our results show that the solid dispersion form of Fluorothiazinon has a higher oral bioavailability of235.4% compared to the crystalline form in rats. Therefore, solid dispersion form was demonstrated to be more suitable for dug development to have enhanced bioavailability, leading to increased absorption and possible improved therapeutic potential of the developed drug based on pharmacokinetics data.

Keywords: HPLC-MS/MS fluorothiazinon, pharmacokinetics, plasma, preclinical studies, quantitative analysis, tandem mass spectrometry.

Введение. В настоящее время

антибиотикотерапия является «золотым стандартом» лечения инфекционных

заболеваний. Однако потенциальный риск развития антибиотикорезистентности к существующим лекарственным препаратам способен снизить эффективность

фармакотерапии [1, 2]. Для преодоления антибиотикорезистентности в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» был разработан новое антивирулентное средство Фтортиазинон (4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид) (ФТ). ФТ продемонстрировал свою активность в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Chlamydia trachomatis и Salmonella enterica Typhimurium [3, 4, 5, 6]. Механизм его действия, предположительно, связан с ингибированием системы секреции третьего типа и подвижности жгутиков грамотрицательных бактерий.

Создание твердых дисперсий позволяет повысить биодоступность вещества, особенно для тех соединений, которые плохо растворимы в воде. Процесс получения твердой дисперсии заключается в предварительном растворении вещества в смеси органических растворителей, которые затем выпариваются. Данный метод позволяет воспроизводимо получать

необходимую форму вещества при относительно малых затратах.

Для разработки лекарственного препарата были получены две формы ФТ: твердодисперсная и кристаллическая. Задачей данного исследования является выбор формы вещества ФТ для разработки лекарственной формы препарата с более высокой биодоступностью на основании исследования фармакокинетики у крыс.

Цель исследования. Экспериментальное изучение фармакокинетических параметров кристаллической и твердодисперсной форм фтортиазинона для поиска субстанции с большей биодоступностью.

Материалы и методы. В качестве стандартного образца использовался фтортиазинон (4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид) с содержанием вещества не менее 99,9%. В качестве внутреннего стандарта - CL-130 (4 -(3 -этокси-4 -гидроксибензил) -5-оксо- 5,6 -дигидро -4Н- [1,3,4] -тиадиазин-2 -(2, 4 -трифторфенил)-карбоксамид) с содержанием вещества не менее 99,9%. Для приготовления элюента использовались ацетонитрил (Reidel-DE Haen, Германия), муравьиная кислота (Sigma Aldrich, Германия), метанол (Sigma Aldrich, Германия) и деионизированная вода (установка Milli-Q plus, Millipore, Франция). Для проведения ферментативного гидролиза конъюгатов использовалась ß-глюкуронидаза E. Coli K12 (Roche Diagnostics GmbH, Германия) и фосфатный буфер (pH=6.2, SigmaAldrich, Германия). Применялись центрифуга

многофункциональная SL 16 (Thermo Fisher Scientific, США); шейкер с функцией нагрева для микропробирок TS-100C (SIA Biosan, Латвия), вакуумный центрифужный испаритель miVac Quattro Concentrator (SP Scientific, USA). Фармакокинетические параметры были рассчитаны с использованием программы Phoenix 64 v. 8.3.4.295 ®. Графики концентраций были построены с помощью программы Microsoft Excel.

Условия хроматографического и масс-спектрометрического анализа. Для

количественного определения использовался метод высокоэффективной жидкостной хроматографии Waters Aсquity I-Class CM-A в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

K-ISSN 2686-6838

Waters TQ-Smicro. Для хроматографического разделения использовалась аналитическая колонка Acquity UPLC BEH C18 с диаметром пор 1,7 мкм, разделение проводилось в режиме градиентного элюирования. Состав подвижной фазы включал в себя 0,1% раствор муравьиной кислоты (фаза A) и ацетонитрил (фаза B). В качестве детектора был выбран

высокочувствительный и селективный тандемный квадрупольный масс-спектрометр. Анализ проводился методом мониторинга множественных реакций (MRM) в положительной области. MRM переходы, применяемые для идентификации фтортиазинона и ВС CL-130: 422 — 151,1—> 123,1 и 440,2 — 151,1, соответственно.

Приготовление растворов стандартного образца и рабочих растворов. Для

приготовления раствора стандартного образца внутрь мерной колбы объемом 10 мл помещался 1 мг фтортиазинона, затем добавлялось 5 мл ацетонитрила. После доведения объема колбы до метки и встряхивания на шейкере 10 мкл полученного раствора переносилось в виалу, затем добавлялся ацетонитрил, чтобы общий объем раствора был равен 1 мл. Рабочие растворы готовились последовательным разведением стандартного раствора в соответствующем объеме растворителя.

Приготовление калибровочных растворов и образцов контроля качества измерений. Для

приготовления калибровочных растворов применялись холостые образцы плазмы крыс. Калибровочные растворы были приготовлены путем смешивания холостых образцов плазмы крыс с рабочими растворами ФТ для получения растворов с концентрациями 0,2; 30; 60; 90; 120; 150; нг/мл. Для получения образцов контроля качества были отдельно приготовлены независимые рабочие растворы с концентрациями 0,2, 0,6, 70 и 135 нг/мл. Пробоподготовка калибровочных растворов и растворов QC была проведена согласно общей методике для образцов.

Отбор проб. В ходе исследования животные были разделены на две группы по 30 особей. Первая группа получала кристаллическую лекарственную форму препарата, а вторая твердодисперсную. Лекарственные средства вводились животным в первой половине дня однократно в дозе 50 мг/кг в объеме 5 мл перорально. В качестве растворителя использовался 1% крахмальный гель. Для

определения концентрации фтортиазинона у крыс из яремной вены отбиралась кровь в следующие временные точки: 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48 часов после введения препарата.

Этические требования. Эксперименты проводились в соответствии с требованиями и инструкциями Первого МГМУ им. И.М. Сеченова по уходу и использованию лабораторных животных. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с 8-ым изданием "Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных" (Национальная Академия Наук, Вашингтон, О.К.). Протоколы экспериментов были одобрены Комитетом по биоэтике Первого МГМУ им. И. М. Сеченова.

Пробоподготовка. В микропробирку помещали 100 мкл плазмы крови, 10 мкл раствора внутреннего стандарта и 100 мкл 0,1 М фосфатного буфера (pH=6,2). Добавляли 400 мкл ацетонитрила для осаждения белков, перемешивали и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбирали и упаривали досуха. Сухой остаток перерастворяли в 100 мкл ацетонитрила, переносили в виалу и анализировали методом ВЭЖХ-МС/МС.

Для определения концентрации глюкуронида ФТ проводили ферментативный гидролиз с ß-глюкуронидазой E.coli K12 (Roche, Швейцария). Для этого готовили буфер для гидролиза, смешивая 1,0 мл раствора фермента с 33,0 мл фосфатного буфера. Подготовка пробы к анализу проводили следующим образом: к 100 мкл плазмы крови прибавляли 10 мкл раствора внутреннего стандарта и 100 мкл буфера для гидролиза, пробу инкубировали в термостате при 37 °С в течение 4 ч. Дальнейшую подготовку пробы проводили, как описано.

Результаты и обсуждения. Было проведено исследование сравнительной фармакокинетики двух форм ФТ (твердодисперсной и мелкокристаллической) после однократного перорального введения препарата крысам в дозе 50 мг/кг. Попадая в организм ФТ в значительной степени связывается с глюкуроновой кислотой, поэтому также была проведена оценка глюкуронида ФТ, полученная после инкубации образцов с ß-глюкуронидазой. В результате были получены фармакокинетические профили исследуемого препарата и его метаболита (Рис. 1, Рис. 2). Рассчитанные фармакокинетические параметры представлены в Таблице 1. Фармакокинетика кристаллической формы

характеризуется максимальном концентрацией 4,97 нг/мл для ФТ и 30,92 нг/мл для глюкуронида,

12

которые наблюдались через 30 минут после введения препарата.

80 70

I с

ш ш 4

J о

I с

о о

^ и 2

0 20 40 60

время, ч

time, h

• кристаллическая форма (crystalline form)

• твердодисперсная форма (solid dispersion)

Рис. 1. Усредненные концентрации свободного фтортиазинона в крови крыс после введения кристаллической и твердодисперсной формы.

Fig.1. Averaged concentrations of free fluorothiazinone in the blood of rats after administration of crystalline and solid-dispersed forms.

я

s J

ш a

J и

I С

о о

^ и

60 50 40 30 20 10 0

-10

60

20 40

время, ч time, h

кристаллическая форма (crystalline form)

—•—твердодисперсная форма (solid dispersion)

Рис. 2. Усредненные концентрации глюкуронида фтортиазинона в крови крыс после введения кристаллической и твердодисперсной формы.

Fig.2. Averaged concentrations of fluorothiazinone glucuronide in rat blood after administration of crystalline and solid-dispersed form.

После введения твердодисперсной формы максимальная концентрация препарата составила 8,65 нг/мл при концентрации глюкуронида 67,20 нг/мл.

Таблица 1

Усредненные фармакокинетические параметры свободного фтортиазинона и глюкуронида

фтортиазинона в крови крыс (п=60)

Параметр Кристаллическая форма Твердая дисперсия

Свободный фтортиазинон Глюкуронид фтортиазинона Свободный фтортиазинон Глюкуронид фтортиазинона

Т1/2, Ч 45,50 6,05 51,58 4,54

Tmax, ч 0,50 0,50 8,00 8,00

Cmax, нг/мл 4,97 30,92 8,95 67,20

AUC0-t, нг/мл*ч 47,94 198,21 112,86 701,02

AUCo-œ, нг/мл*ч 89,94 198,74 184,54 701,53

MRTo-t , ч 19,64 9,40 14,56 9,05

MRTo-œ , ч 63,53 9,53 56,45 9,09

Примечание: Т1/2 - Период полувыведения препарата из организма;

Тпшх - время достижения максимальной концентрации препарата в крови; Спшх - максимальная концентрация препарата в крови;

А иСо-г - площадь под фармакокинетической кривой от момента приема ЛП до времени последнего отбора крови;

А иСо-ю - площадь под фармакокинетической кривой от момента приема ЛП до бесконечности;

MRT0-t - среднее время нахождения молекулы ЛП в организме от момента приема ЛП до времени последнего

отбора крови;

МКТ0-Г - среднее время нахождения молекулы ЛП в организме человека от момента приема ЛП до бесконечности.

Table 1

Averaged pharmacokinetic parameters of free fluorothiazinone and fluorothiazinone glucuronide in rat blood

(n=60)

Note: T1/2 is the half-life;

Parameters Crystalline form Solid dispersion

Free fluorothiazinone Fluorothiazinone glucuronide Free fluorothiazinone Fluorothiazinone glucuronide

Т1/2, h 45,50 6,05 51,58 4,54

Tmax,) h 0,50 0,50 8,00 8,00

Cmax, ng/ml 4,97 30,92 8,95 67,20

AUCo-t, ng/ml*h 47,94 198,21 112,86 701,02

AUCo-œ, ng/ml*h 89,94 198,74 184,54 701,53

MRTo-t , h 19,64 9,40 14,56 9,05

MRTo-œ , h 63,53 9,53 56,45 9,09

Tmax is the time to reach the maximum concentration; Cmax is the maximum concentration;

AUCo-t is the area under the pharmacokinetic curve from the moment of drug administration to the moment of the last blood sampling;

AUCo-w is the area under the pharmacokinetic curve from the moment of drug administration approximated to infinity;

MRTo-t is the average residence time from the moment of drug administration to the moment of the last blood sampling;

MRTo-w is the average residence time from the moment of drug administration approximated to infinity.

Заключение. Выбор лекарственной формы препарата является одним из важных этапов разработки лекарственного средства, поскольку он будет влиять на фармакокинетику активной молекулы. В ходе исследования были изучены основные фармакокинетические параметры препарата фтортиазинон и его глюкуронидной формы, включающие в себя период полувыведения (Т1/2 ), время достижения максимальной концентрации препарата и его метаболита(Ттах), максимальную концентрацию соединений в плазме крови (Стах), площади под фармакокинетическими кривыми (АиС04,

АиС0-да) и среднее время нахождения молекул в организме (MRT0-t, MRT0-да ). Для этого было проведено сравнительное экспериментальное исследование двух лекарственных форм фтортиазинона с использованием крыс в качестве модельных животных. Было установлено, что твердодисперсная форма фтортиазинона обладает более высокой биодоступностью (235,4%) по сравнению с кристаллической формой препарата, что делает её более перспективной для дальнейшей разработки лекарственного препарата.

REFERENCES

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК

[1]. Julian Davies, Dorothy Davies. Origins and Evolution of Antibiotic Resistance. ASM Journals Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2010. Vol. 74, No. 3 P. 417433

[2]. Jose. L. Martinez. General Principals of antibiotic resistance in bacteria. Drug Discovery Today: Technologies. 2014 Vol. 11, P. 33-39

[3]. Zigangirova NA, Nesterenko LN, Sheremet AB, Soloveva AV, Luyksaar SI, Zayakin ES, Balunets DV. Fluorothiazinon, a small-molecular inhibitor of T3SS, suppresses salmonella oral infection in mice. The Journal of Antibiotics, 2021 Vol. 74, P. 244-254

[4]. Anna B Sheremet, Naylia A Zigangirova, Egor S Zayakin, Sergei I Luyksaar, Lydia N Kapotina, Ludmila N Nesterenko, Natalie V Kobets, Alexander L Gintsburg. Small Molecule Inhibitor of Type Three Secretion System Belonging to a Class 2,4-disubstituted-4H-[1,3,4]-thiadiazine-5-ones Improves Survival and Decreases Bacterial Loads in an Airway Pseudomonas aeruginosa Infection in Mice. Biomed Research International 2018;

[1]. Julian Davies, Dorothy Davies. Origins and Evolution of Antibiotic Resistance. ASM Journals Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2010. Vol. 74, No. 3 P. 417433

[2]. Jose. L. Martinez. General Principals of antibiotic resistance in bacteria. Drug Discovery Today: Technologies. 2014 Vol. 11, P. 33-39

[3]. Zigangirova NA, Nesterenko LN, Sheremet AB, Soloveva AV, Luyksaar SI, Zayakin ES, Balunets DV. Fluorothiazinon, a small-molecular inhibitor of T3SS, suppresses salmonella oral infection in mice. The Journal of Antibiotics, 2021 Vol. 74, P. 244-254

[4]. Anna B Sheremet, Naylia A Zigangirova, Egor S Zayakin, Sergei I Luyksaar, Lydia N Kapotina, Ludmila N Nesterenko, Natalie V Kobets, Alexander L Gintsburg. Small Molecule Inhibitor of Type Three Secretion System Belonging to a Class 2,4-disubstituted-4H-[1,3,4]-thiadiazine-5-ones Improves Survival and Decreases Bacterial Loads in an Airway Pseudomonas aeruginosa Infection in Mice. Biomed Research International 2018;

E-ISSN 2686-6838

26.02.2018

https://www.hindawi.com/journals/bmri/2018/5810767/

[5]. Ludmila N Nesterenko, Nailya A Zigangirova, Egor S Zayakin, Sergey I Luyksaar, Natalie V Kobets, Denis V Balunets, Ludmila A Shabalina, Tatiana N Bolshakova, Olga Y Dobrynina, Alexander L Gintsburg. A small-molecule compound belonging to a class of 2,4-disubstituted 1,3,4-thiadiazine-5-ones suppresses Salmonella infection in vivo. The Journal of Antibiotics. 2016 Vol. 69, P. 422-427

[6]. Mironov. Guidelines for conducting preclinical studies part 1. — М.: Гриф и К, 2012. — 944 с. c.57 p.853

26.02.2018

https://www.hindawi.com/journals/bmri/2018/5810767/

[5]. Ludmila N Nesterenko, Nailya A Zigangirova, Egor S Zayakin, Sergey I Luyksaar, Natalie V Kobets, Denis V Balunets, Ludmila A Shabalina, Tatiana N Bolshakova, Olga Y Dobrynina, Alexander L Gintsburg. A small-molecule compound belonging to a class of 2,4-disubstituted 1,3,4-thiadiazine-5-ones suppresses Salmonella infection in vivo. The Journal of Antibiotics. 2016 Vol. 69, P. 422-427

[6]. Миронов Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. — М.: Гриф и К, 2012. — 944 с. Глава 57 c. 853

Author Contributions. Samojlov V.M. - investigation and writing original draft; Savitskii M.V. - conducting formal analysis; Romashkina A.G. - collection and processing of materials; Baskhanova S.N. - conductingformal analysis; Appolonova S.A. - project administration.

Conflict of Interest Statement. The authors declare no conflict of interest.

Samoilov V.M.- ORCID ID: 0009-000905460-011X

Savitskii M.V. - SPIN ID: 1959-6040; ORCID ID: 0000-0003-3447-1823

Baskhanova S.N.- ORCID ID: 0000-0001-8716-1672

Appolonova S.A.- ORCID ID: 0000-0002-9032-1558

For citation: Samojlov V.M., Savitskii M.V., Romashkina A.G., Baskhanova S.N. Appolonova S.A. PHARMACOKINETICS OF SOLID DISPERSION AND CRYSTALLINE FORMS OF THE ANTI-VIRULENCE DRUG FLUOROTHIAZINON IN RATS // Medical & pharmaceutical journal "Pulse". - 2023;25(7):57-62. http://dx.doi.org//10.26787/nydha-2686-6838-2Q23-25-7-57-62.

Вклад авторов. Самойлов В.М. - обработка результатов; Савицкий М.В. анализа; Ромашкина А.Г. - сбор и обработка материалов; Басханова С.Н. анализа; Апполонова С.А. - утверждение концепции исследования.

проведение экспериментального проведение экспериментального

Заявление о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Самойлов В.М.- ORCID Ю: 0009-000905460-011Х

Савицкий М.В. - SPINЮ: 1959-6040; ORCID Ю: 0000-0003-3447-1823

Басханова С.Н. - ORCID Ю: 0000-0001-8716-1672

Апполонова С.А.- ORCID Ю: 0000-0002-9032-1558

Для цитирования: Самойлов В.М., Савицкий М.В., Ромашкина А.Г., Басханова С.Н., Апполонова С.А. ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ ТВЕРДОДИСПЕРСНОЙ И КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ ФОРМ АНТИВИРУЛЕНТНОГО СРЕДСТВА ФТОРТИАЗИНОН У КРЫС // Медико-фармацевтический журнал "Пульс". 2023;25(7):57-62. http://dx.doi.Org//10.26787/nydha-2686-6838-2023-25-7-57-62.