CC BY
39
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 615.362
Исследование фармакодинамики препарата
на основе терапевтических гуманизированных моноклональных антител против интерлейкина-17 на модели антиген-индуцированного артрита на кроликах
А. А. Недорубов, А. В. Грачев, М. А. Варавко, Е. Л. Морозова
ЗАО «БИОНАД», п. Любучаны, Чеховский район, Московская область Поступила 25.02.2016. Принята к публикации 22.04.2016.
В настоящей статье представлен материал по оценке специфического действия препарата терапевтических гуманизированных моноклональных антител против интерлейкина-17 на модели антиген-индуцированного артрита на кроликах. Исследована фармакокинетика и иммуногенность препарата анти-И-17Д. Тяжесть развития артрита оценивали по степени повреждения суставов, уровню маркеров воспаления и гистологической шкале Мэнкина.
Ключевые слова: ревматоидный артрит; моноклональные антитела; интерлейкина-17 (IL-17A); CRP; TNF-a. Библиографическое описание: Недорубов АА, Грачев АВ, Варавко МА, Морозова ЕЛ. Исследование фармакодинамики препарата на основе терапевтических гуманизированных моноклональных антител против интерлейки-на-17 на модели антиген-индуцированного артрита на кроликах. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение 2016; 16 (2): 101-107.
Ревматоидный артрит (РА) является хроническим воспалительным заболеванием суставов, характеризуется воспалением синовиальной оболочки, что приводит к разрушению хряща и кости [1]. Этиология заболевания связана как с гуморальным, так и с клеточным иммунным ответом [2]. Повреждение хрящевой ткани является следствием инфильтрации главным образом Т-клетками памяти, макрофагами, плазматическими клетками, которые показывают признаки активации [3]. Инвазия данных клеточных элементов в синовиальную оболочку приводит в большинстве случаев к прогрессирующей деструкции хряща и кости. Деструкция ткани опосредуется цитокинами, увеличением количества фибробластов и избыточной пролиферации воспалительных клеток, в основном макрофагов и лимфоцитов. Важнейшей характеристикой воспаленных суставов являются: пролиферирующие синовиальные фибробласты, постепенно разрушающие сустав и хрящ, инфильтрация CD4+ Т-клеток и аутоантител, увеличение числа иммунных клеток [4].
IL-17A, в значительных количествах присутствующий в синовии и синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом, вызывает синтез IL-1, фактора некроза опухоли a (TNF-a), IL-6, IL-8, гранулоцитарного колоние-стимулирующего фактора (CSF), гранулоцитарно-макро-фагального CSF и других провоспалительных факторов, а также in vitro стимулирует макрофаги из фракции моно-нуклеаров периферической крови к синтезу TNF-a и IL-1 [5]. Считается, что при РАТ-клетки являются основным источником IL-17A в синовиальной оболочке [6]. При этом имеется прямая зависимость уровня IL-17A от тяжести заболевания. Было продемонстрировано, что ингибирова-ние IL-17A и IL-17RA имеет важные клинически терапевтические эффекты при псориазе и РА [7].
Доклинические исследования показали, что IL-17A является привлекательной терапевтической мишенью. На моделях артрита у животных было показано, что агенты, которые нейтрализуют IL-17A (например, анти-IL-17A антитела, IL17RA-IgG Fc fusion protein) уменьшают тяжесть
заболевания и предотвращают повреждение суставов у животных [8]. Исследования антител против IL-17A на мышиной модели коллаген-индуцированного артрита (CIA) показали значительное подавление воспаления сустава и предотвращение разрушения хряща и кости [9]. Несколько ингибиторов IL-17A продвинулись в клинических исследованиях, в том числе анти-^-17Д моноклональные антитела, secukinumab и ixekizumab и моноклональное антитело brodalumab анти-17ВД. Антитела показали положительный результат в доказательство правильности данной концепции [10].
Цель данной работы — исследовать специфическое действие препарата моноклональных антител против IL-17A, разработанного биотехнологической компанией ЗАО «БИОКАД» на модели антиген-индуцированного артрита на кроликах.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи: исследована фармакокинетика препарата моноклональных антител против IL-17A для расчета курса терапии. Отработана модель антиген-индуцирован-ного артрита на кроликах. Исследовано содержание нейтрализующих антител. Эффективность терапии препаратом моноклональных антител против IL-17A оценивали по маркерам воспаления и гистологической картине.
Материалы и методы
Животные
Исследование проведено на кроликах (самцах) породы «Шиншилла», приобретенных в питомнике ООО «КРОЛИНФО». Все манипуляции с животными выполнялись согласно национальному стандарт РФ ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики».
Фармакокинетика anti-IL-17A
В исследовании были использованы дозы 0,1 и 8 мг/кг. Препарат антител вводили однократно подкожно в зону холки. Содержание anti-IL17A исследовали в сыворотке
I, II — иммунизация ОВА1 мл, 5 мг/мл в ПАФ, в/к
III, IV — индукция артрита ОВА 0,5 мл, 10 мг/мл, внутрисуставно
Рис. 1. Схема индукции антиген-индуцированного артрита.
крови методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента.
Определение концентрации препарата anti-IL17A в сыворотке крови проводили в трех повторах. Полученные результаты использовали для построения кривой изменения концентрации препарата anti-IL17A во времени для каждого из животных.
AUC(0-460) — суммарная площадь под кривой концентрации препарата от момента его попадания в организм до 460 ч.
AUMC(0-460) — суммарная площадь под кривой произведения времени на концентрацию препарата в организме до 460 ч.
По вычисленным значениям площадей AUC(0-460) и AUMC(0-460) при дозе (D) введенного препарата определяли следующие фармакокинетические параметры препарата anti-IL17A:
• среднее время пребывания в организме молекулы препарата (MRT);
• продолжительность периода полувыведения (Thalf);
• константа скорости элиминации (Lz);
Эти данные использовали для планирования исследования специфической активности на модели АИА.
Иммуногенность anti-IL-17A
В исследовании были использованы дозы 10, 20 и 30 мг/кг. Препарат антител вводили подкожно в зону холки еженедельно, в течение трех месяцев, с последующим восстановительным периодом в один месяц. Для определения уровня антител к моноклональным антителам к IL17 в сыворотке крови кроликов была использована тест-система, разработанная в ЗАО «БИОКАД». Уровень антител к моноклональным антителам к IL17 в сыворотке крови оценивали с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Эти данные использовали для планирования исследования специфической активности на модели АИА.
Индунция антиген-индуцированного артрита
Животных сенсибилизировали овальбумином 5 мг/мл в 1 мл полного адъюванта Фрейнда внутрикожно в нескольких точках вдоль позвоночника. Через 14 суток проводили повторную сенсибилизацию по той же схеме. Через десять суток после повторной сенсибилизации, кроликов
тестировали на реакцию Артюса. Для этого, овальбумин 5 мг/мл в объеме 0,2 мл, вводили внутрикожно. У кроликов, которые положительно среагировали на антиген (раздражение в месте укола), индуцировали артрит путем введения 0,5 мл стерильного раствора овальбумина (10 мг/мл) в полости сустава. Повторную индуцирующую инъекцию проводили через десять суток по той же схеме. Контрольной группе животных вводили физиологический раствор. Через 24 ч после первой индукции начинали вводить исследуемый препарат антител против IL-17A. Препарат вводили подкожно один раз в неделю в течение пяти недель (рис. 1).
Тяжесть артрита
Тяжесть развития артрита оценивали по степени повреждения суставов (каждые трое суток с начала терапии). Для этого выбривали шерсть в области коленного сустава и проводили осмотр с регистрацией клинической картины [11]:
0 — норма;
1 — мягкая опухоль и краснота;
2 — умеренная припухлость и краснота;
3 — сильный отек, эритема, потеря функциональности двух лап;
4 — полная потеря функциональности трех лап. Определение уровня CRP, TNF-a
Маркеры тяжести воспаления смотрели в сыворотке крови через 7, 14, 21 и 28 суток после начала терапии антителами. Для этого забирали кровь из ушной вены, готовили сыворотку по стандартной методике. Для определения уровня TNF-a и CRP ^-реа^тивный белок) в сыворотке крови кроликов была использована тест-система, разработанная в ЗАО «БИОКАД». Уровень TNF-a и CRP в сыворотке крови оценивали с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента.
Гистология
Гистологическую оценку проводили на сагиттальных срезах хряща из зоны поражения бедренного мыщелка и верхней суставной поверхности большеберцовой кости. Готовили серийные срезы (5 мкм) и окрашивали сафрани-ном-О. Два независимых наблюдателя оценивали тяжесть ОА-поражений по шкале от 0 до 14 (табл. 1), используя гистологическую-гистохимическую шкалу Мэнкина [12]. По этой шкале тяжесть ОА-поражений оценивают на осно-
Таблица 1. Гистологическая шкала повреждения при артрите
Оценка
Структура сустава:
норма 0
поврежденная поверхность 1
нарушение паннуса и поверхности 2
трещины в переходной зоне 3
трещины в радиальной зоне 4
трещина в зоне кальцификации 5
полная дезорганизация 6
Нлетки:
норма 0
диффузная гиперцеллюлярность 1
пролиферация 2
гипоцеллюлярность 3
Окрашивание Safranin-O:
норма 0
небольшое снижение 1
умеренное снижение 2
сильное снижение 3
нет окраски 4
Целостность Иёетагк: неповрежденные скрещенные кровеносными сосудами 0 1
вании потери окрашивания сафранином-О (шкала 0-4), клеточных изменений (шкала 0-3), уровня инвазии кровеносными сосудами (шкала 0-1) и структурных изменений (шкала 0-6). По последней шкале 0 означает нормальную хрящевую структуру, а 6 означает эрозию хряща в субхон-дральной кости. Система баллов базируется на наиболее глубоких гистологических изменениях во множественных срезах [13]. Рассчитывали средние величины и SEM и проводили статистический анализ с использованием U-крите-рия Манна-Уитни.
Результаты
Фармакокинетика anti-IL-17A
Результаты исследования фармакокинетики препарата anti-IL17A в дозах 0,1 и 8 мг/кг при однократном подкожном введении кроликам Шиншилла позволили рассчитать основные фармакокинетические параметры (табл. 2).
На рисунке 2 представлены экспериментальные данные по изменению концентрации препарата anti-IL17A во времени в образцах сыворотки крови кроликов Шиншилла после однократного подкожного введения в дозах 0,1 и 8 мг/кг.
Иммуногенность anti-IL17A
Оценку иммуногенности anti-IL17A определяли по уровню связывающих препарат антител. Определение концентрации антител к anti-IL17A в сыворотке крови проводили в двух повторах. Полученные результаты использовали для построения кривой изменения концентрации антител к anti-IL17A во времени для каждого из животных (табл. 3, рис. 3). Из представленных результатов следует, что мак-
< 100
О 100 200 300 400 500 600 Время после введения, ч
Рис.2. Усредненная кривая (п =10) изменения концентрации препарата атМ1_17Д в сыворотке крови при однократном подкожном введении кроликам в дозе 0,1 (-■-) и 8 мг/кг (-•-).
Таблица 2. Фармакокинетические параметры препарата апИ-!Ь17Д при однократном подкожном введении кроликам в дозе 0,1 и 8 мг/кг
Фармакокинетические параметры anti-IL17A
0,1 мг/кг 8 мг/кг
ХСр □ Хср □
Cmax, мкг/мл 0,47 0,05 41,86 9,57
Tmax, ч 43,20 26,29 52,80 26,29
AUC(0-460), мкг/(мл-ч) 89,78 5,27 7501,29 1048,72
Lz, 1/ч 0,006 0,001 0,010 0,002
Thalf, ч 111,40 16,63 73,07 14,13
MRT, ч 176,17 15,33 147,06 7,55
Таблица 3. Экспериментальные данные по определению концентрации антител к апИ-!Ь17Д в сыворотке крови кроликов
Время после введения № кролика п/п Концентрация антител к anti-IL17A, мкг/мл
10 мг/кг 20 мг/кг 30 мг/кг
1 месяц 1 0,000 0,000 0,000
2 0,000 0,000 0,000
3 0,000 0,000 0,000
4 0,000 0,000 0,000
2 месяц 1 0,000 2,129 2,514
2 0,248 1,251 3,655
3 0,000 0,000 0,000
4 0,699 0,000 0,000
3 месяц 1 0,000 24,359 30,370
2 31,082 26,514 60,380
3 10,337 0,000 0,000
4 21,518 0,000 0,000
Восстано- 1 0,000 16,578 28,104
вительный 2 26,713 22,915 39,052
период
(1 месяц) 3 1,794 0,000 10,497
4 13,055 0,000 0,000
Рис. 3. Изменение концентрации антител кап11-!Ь17А во времени в сыворотке крови кроликов после многократного подкожного введения.
о.
а. и
Рис. 4. Изменение концентрации С-реактивного белка во времени в сыворотке кроликов на модели АИА (среднее; 0,95 доверительный интервал).
симальный уровень антител против ап1М1_17А наблюдался на третий месяц после начала введения препарата, достигая значения 60 мкг/мл (доза 30 мг/кг) и падает во время восстановительного периода.
Полученные результаты (табл. 3) использовали для построения кривой изменения концентрации антител к
атМ1_17А во времени в сыворотке крови кроликов (рис. 3).
Результаты, полученные в ходе исследования фарма-кокинетики и иммуногенности атМ1_17А, использовали для корректного планирования исследования специфической активности препарата атМ1_17А на модели анти-ген-индуцированного артрита.
Рис. 5. Изменение концентрации TNF-a во времени в сыворотке крови кроликов на модели АИА (среднее; 0,95 доверительный интервал).
Определение уровня CRP, TNF-a
Протективные свойства препарата anti-IL17A анализировали по уровню маркеров воспаления: CRP и TNF-a. Уровень маркеров определяли в сыворотке крови еженедельно в течение четырех недель после индукции АИА. Анализ полученных данных показывает, что препарат anti-IL-17A в дозе 20 мг/кг максимально эффективно снижает уровни CRP и TNF-a в течение всего срока исследования (рис. 4 и 5). Так же хочется отметить, что уровень TNF-a и CRP максимально возрастают на первую и вторую неделю после индукции артрита. Что важно иметь в виду для использования данных маркеров воспаления для скрининга.
Гистология
Важным параметром эффективности препаратов, направленных на лечение ревматоидного артрита, является гистологическая оценка целостности суставов и прилегающих тканей. В ходе гистологического исследования коленных суставов кроликов на модели антиген-индуци-рованного артрита в группе с артритом выявили следующие изменения.
Суставная поверхность костей покрыта гиалиновым хрящом, имеющим нечеткое зональное строение. В наружной зоне наблюдается или исчезновение бесклеточной пластинки (laminasplendens) или ее набухание с раз-волокнением, а так же появление узур и трещин вплоть до радиальной и кальцинированной зоны хряща. Глубокая зона гиалинового хряща без четкой границы переходит в обызвествленную, линия обызвествления контурируется. Определяются поля лишенные клеток, чередующиеся с полями активного размножения.
Синовиальные оболочки ареолярного типа выступают в суставную полость в виде клинообразных складок, где выражен фибриноидный некроз ворсин. Определяется развитие клеточного паннуса с формированием зон краевых эрозий. Синовиоциты в большинстве полей зрения некротизированы и десквамированы. Сохранившиеся клетки разряжены или группируются близко друг к другу,
Таблица 4. Гистологическая оценка по системе оценки Мэнкина в баллах
Группа Суммарная оценка (max = 14)
2 мг/кг 6,25
8 мг/кг 5,2
20 мг/кг 4,0
Артрит 9,0
Контроль 2,75
в несколько слоев. Ворсины синовиальной оболочки отечные, в их строме — участки фибририноидного некроза. Экссудативная воспалительная реакция представлена отеком, фибриноидными изменениями, появлением полиморфно-ядерных лейкоцитов, макрофагов. Среди клеток воспаления встречаются гистиоциты. В субсиновиальном слое пролиферируют фибробласты с последующим разрастанием грануляционной ткани. Во всех случаях преобладают экссудативные процессы. При окрашивании Сафранином наблюдается снижение интенсивности окрашивания.
По оценке уровня повреждения суставов и окружающих тканей по шкале Мэнкина максимально протектив-ный эффект наблюдается в группе 20 мг/кг (табл. 4).
В группе с дозой препарата 20 мг/кг отмечалось максимальное сокращение альтеративных процессов, уменьшение экссудативных и появление пролиферативных реакций, наблюдалось сокращение отека, уменьшалось выраженность некротических процессов.
Заключение
В ходе исследования фармакокинетики препарата антител против !1_-17А рассчитали основные фармакокинетические параметры. Полученные данные использовали для плани-
рования исследования специфической активности препарата антител против IL-17A на модели антиген-индуциро-ванного артрита. Исследование иммуногенности в течение трех месяцев показало, что связывающие антитела на anti-IL17A начинают образовываться на третий месяц еженедельного введения. Эти данные указывает на отсутствие потенциального блокирования антител против IL-17A в выбранной модели исследования.
В результате проведенного исследования специфической активности препарата anti-IL17A на модели анти-ген-индуцированного артрита была показана его эффективность по параметрам содержания уровня маркеров воспаления: С-реактивного белка и TNF-a, а также по данным гистологического исследования суставов и оценке по шкале Мэнкина.
Литература
1. Chew MWK, Hendersont B, Edwards JCW. Antigen-induced arthritis in the rabbit: ultrastructural changes at the chondrosynovial junction. Int J Exp Path. I990; 71: 879-94.
2. Lee DM, Weinblatt ME. Rheumatoid arthritis. Lancet 2001; 358: 903-11.
3. Feldmann M, Brennan FM, Maini RN. Rheumatoid arthritis. Cell 1996; 85(3): 307-10.
4. Shabgah AG, Fattahi E, Shahneh FZ. Interleukin-17 in human inflammatory diseases. Postepy Dermatol Alergol. 2014; 31(4): 256-61.
5. Иологривова ИВ, Иологривова EH, Суслова ТЕ. Молекулярные аспекты функционирования T-хелперов 17-го типа. Бюллетень сибирской медицины 2011; 10(4): 93-8.
6. Isailovic N, Daigo K, Mantovani A, Selmi C. Interleukin-17 and innate immunity in infections and chronic inflammation. J Autoim-mun.2015;60: 1-11.
7. Mease PJ. Inhibition of interleukin-17, interleukin-23 and the TH17 cell pathway in the treatment of psoriatic arthritis and psoriasis. CurrOpin Rheumatology 2015; 27(2): 127-33.
8. van den Berg WB, MclnneslB. Th17 cells and IL-17a-focus on im-munopathogenesis and immunotherapeutics. Semin Arthritis Rheum. 2013; 43(2): 158-70.
9. Khan D, Ahmed SA. Regulation ofIL-17 in autoimmune diseases by transcriptional factors and microRNAs. Front Genet. 2015; (6): 236.
10. Lubberts E, Joosten LA, Oppers B, van den Bersselaar L, Coe-nen-de Roo CJ, Kolls JK, et al. IL-1-independent role of IL-17 in synovial inflammation and joint destruction during collagen-induced arthritis. J Immunol. 2001; 167(2): 1004-13.
11. Oliveira PG, Grespan R, Pinto LG, MeurerL, BrenolJCT, Roesler R, Schwartsmann G, Cunha FQ, Xavier RM. Protective Effect of RC-3095, an Antagonist of the Gastrin-Releasing Peptide Receptor, in Experimental Arthritis. Arthritis & Rheumatism 2011; 63(10): 2956-65.
12. Link TM, ed. Cartilage Imaging. Significance, Techniques, and New Developments. New York: SpringerScience+Business Media; 2011.
13. VanderSluijsJA, GeesinkRG, van der Linden AJ, BulstraSK, Kuyer R, Drukker J. The reliability of the Mankin score for osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research 1992; 10(1): 58-61.
Об авторах
ЗАО «Биокад». Российская Федерация, 142380, Московская область, Чеховский район, п. Любучаны.
Недорубов Андрей Анатольевич. Старший научный сотрудник отдела доклинических испытаний лекарственных средств.
Грачев Александр Владимирович. Старший научный сотрудник отдела иммунохимии.
Варавко Мария Александровна. Старший научный сотрудник отдела доклинических испытаний лекарственных средств. Морозова Елена Леонидовна. Руководитель отдела доклинических испытаний лекарственных средств. Адрес для переписки: Недорубов Андрей Анатольевич; [email protected]
The study of pharmacodynamics of a medicine based on humanized monoclonal antibodies against IL-17 in rabbit model of antigen-induced arthritis
A. A. Nedorubov, A. V. Grachev, M. A. Varavko, E. L. Morozova
CJSC «BIOCAD», village Lyubuchany, Chekhov district, Moscow region, Russia
The present article contains scientific data on the assessment of specific activity of therapeutic humanized monoclonal antibodies against IL-17 in rabbit model of antigen-induced arthritis. Pharmacokinetics and immunogenicity of anti-IL-17A preparation have been studied. The severity of rheumatoid arthritis progression has been assessed by the levels of joint damage, the levels of inflammatory markers and according to Menkin histological grade.
Key words: rheumatoid arthritis; monoclonal antibodies; interleukin-17 (IL-17A); CRP; TNF-a.
For citation: Nedorubov AA, Grachev AV, Varavko MA, Morozova EL. The study of pharmacodynamics of a medicine based on humanized monoclonal antibodies against IL-17 in rabbit model of antigen-induced arthritis. BlOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment 2016; 16 (2): 101-107.
References
1. Chew MWK, Hendersont B, Edwards JCW. Antigen-induced arthritis in the rabbit: ultrastructural changes at the chondrosynovial junction. Int J Exp Path. I990; 71:879-94.
2. Lee DM, Weinblatt ME. Rheumatoid arthritis. Lancet 200I; 358: 903-II.
3. Feldmann M, Brennan FM, Maini RN. Rheumatoid arthritis. Cell I996; 85(3): 307-I0.
4. Shabgah AG, Fattahi E, Shahneh FZ. Interleukin-17 in human inflammatory diseases. Postepy Dermatol Alergol. 2014; 31(4): 256-61.
5. Kologrivova IV, Kologrivov EN, Suslova TE. Molecular aspects of the functioning of T-helper 17-type. Bulleten sibirskoy meditsiny 2011; 10(4): 93-98 (in Russian).
6. Isailovic N, Daigo K, Mantovani A, Selmi C. Interleukin-17 and innate immunity in infections and chronic inflammation. J Autoim-mun.2015;60: 1-11.
7. Mease PJ. Inhibition of interleukin-17, interleukin-23 and the TH17 cell pathway in the treatment of psoriatic arthritis and psoriasis. CurrOpin Rheumatology 2015; 27(2): 127-33.
8. van den Berg WB, MclnneslB. Th17 cells and IL-17a-focus on im-munopathogenesis and immunotherapeutics. Semin Arthritis Rheum. 2013; 43(2): 158-70.
9. Khan D, Ahmed SA. Regulation of IL-17 in autoimmune diseases by transcriptional factors and microRNAs. Front Genet. 2015; (6): 236.
10. Lubberts E, Joosten LA, Oppers B, van den Bersselaar L, Coe-nen-de Roo CJ, Kolls JK, et al. IL-1-independent role of IL-17 in sy-
novial inflammation and joint destruction during collagen-induced arthritis. J Immunol. 2001; 167(2): 1004-13.
11. Oliveira PG, Grespan R, Pinto LG, MeurerL, BrenolJCT, Roesler R, Schwartsmann G, Cunha FQ, Xavier RM. Protective Effect of RC-3095, an Antagonist of the Gastrin-Releasing Peptide Receptor, in Experimental Arthritis. Arthritis & Rheumatism 2011; 63(10): 2956-65.
12. Link TM, ed. Cartilage Imaging. Significance, Techniques, and New Developments. New York: SpringerScience+Business Media; 2011.
13. VanderSluijsJA, GeesinkRG, van der Linden AJ, BulstraSK, Kuyer R, Drukker J. The reliability of the Mankin score for osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research 1992; 10(1): 58-61.
Authors
CJSC «BIOCAD», Lyubuchany village, Chekhov district, Moscow region, 142380, Russian Federation.
NedorubovAA. Senior researcher of the Department of preclinical trials of medicines.
GrachevAV. Senior researcher of the Department of immunochemistry.
Varavko MA. Senior researcher of the Department of preclinical trials of medicines.
Morozova EL. Head of the Department of preclinical trials of medicines.
