Исследование экстракции флавоноидов из плодовых оболочек гречихи в различных условиях Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 547.814.5+

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСТРАКЦИИ ФЛАВОНОИДОВ ИЗ ПЛОДОВЫХ ОБОЛОЧЕК ГРЕЧИХИ В РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ

© А. В. Апаева*, Э. Т. Ямансарова, О. С. Куковинец

Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450078 г. Уфа, ул. Мингажева, 100.

Тел.:+7 (347) 228 62 10.

*ЕтаИ: a.apaeva-anastasia@mail. ги Изучен процесс извлечения фенольных соединений и флавоноидов из плодовых оболочек гречихи с применением индивидуальных экстрагентов и смеси гидрофильных и гидрофобных. Определены оптимальные условия экстракции флавоноидов двухфазной системой экстрагентов, заключающиеся в применениии смеси 70%-ного изопропилового спирта с хлороформом в соотношении 1:1. Исследован групповой состав фенольных соединений. С помощью ТСХ и качественных реакций установлено, что в экстракте, полученном при экстракции двухфазной системой экс-трагентов 70%-ный изопропанол-хлороформ присутствуют гликозиды и агликоны в гидрофильной фракции, агликоны и сильно метилированные флавоноиды - в гидрофобной, сходные по подвижности с рутином, кверцетином и хризофенолом. Сухие экстракты, получаемые с применением технологии двухфазной экстракции летучими растворителями, имеют наиболее широкий компонентный состав и получаются с высоким выходом, что позволяет эффективно использовать их в качестве активных ингредиентов твердых лекарственных форм и БАД к пище.

Ключевые слова: биологически активные вещества, двухфазная экстракция, шелуха гречихи, рутин, флавоноиды.

Введение

Лекарственные препараты, получаемые из растений, занимают важное место в современной медицине среди средств профилактики и лечения многих заболеваний. Это обусловлено их более мягким действием, малой токсичностью и почти полным отсутствием нежелательных побочных эффектов [1, 2]. Поиск новых видов растений, способных расширить сырьевую базу и номенклатуру лекарственного сырья, является актуальной задачей.

Основной стадией получения препаратов природных соединений является экстрагирование лекарственного растительного сырья, определяемое общими законами массообмена, свойствами растительной ткани, физико-химическим сродством экстрагента как по отношению к извлекаемому веществу, так и гидрофильной матрице клетки. Сродство экстрагента и извлекаемого вещества обычно характеризуется растворимостью вещества в экстрагенте, а сродство экстрагента и нерастворимой матрицы клетки - набуханием, энергией сольватации сырья.

Экстрагирование с применением одного экстра-гента позволяет извлечь комплекс биологически активных веществ (БАВ), растворимых в этом экстрагенте, тогда как в шроте остается значительное количество БАВ гидрофильного или липофильного характера, в зависимости от природы используемого экстрагента.

Для полного извлечения разнообразных БАВ из растительного сырья в последнее время используют экстракцию системой несмешивающихся растворителей различной полярности - двухфазной системой экс-трагентов. Наиболее важной особенностью так называемой «двухфазной экстракции», отличающей ее от других применяемых методов экстрагирования, является то, что за одну технологическую стадию из лекарственного растительного сырья извлекается комплекс липо-фильных и гидрофильных БАВ [3-8].

Смесь при экстрагировании двухфазным экстра-гентом представляет собой трехфазную систему - гидрофобный растворитель-вода-шрот. Но поскольку твердая фаза - шрот - присутствует при любом способе экс-

трагирования, а существенным отличием рассматриваемого способа является применение именно двухфазного жидкого экстрагента, то такой способ переработки сырья называют двухфазной экстракцией.

Чаще всего для экстракции используют смесь какого-либо полярного растворителя - вода, низшие спирты и их водные растворы и растительных масел. При этом в экстракт извлекается комплекс биологически активных веществ. Поэтому такой вариант экстракции удобен в технологии суммарных экстрактов. Однако при необходимости получения сухого экстракта из растительного сырья использование растительного масла в качестве гидрофобной фазы является препятствием, так как бывает сложно отделить спиртовую и масляную фазы из-за образования устойчивой эмульсии.

Так как технология получения сухих экстрактов подразумевает полное удаление растворителей, использование масла при двухфазной системе экстрагентов нецелесообразно. Поэтому в качестве гидрофобной фазы были выбраны хлороформ, бензол и гексан, так как в них хорошо растворимы агликоны и метилированные флавоноиды, что будет способствовать более полному извлечению фенольных соединений.

Основываясь на результатах работы [9] и собственных исследованиях [10] нами предпринята попытка оптимизировать условия экстракции антиокси-дантных веществ из шелухи гречихи, применяя смесь растворителей разной полярности.

Экспериментальная часть

В качестве исходного растительного сырья использовали плодовые оболочки гречихи, выращенной в Чишминском районе Республики Башкортостан в 2013 году.

Экстракцию фенольных соединений спиртами осуществляли следующим образом: к 5 г измельченной до размера 3-5 мм шелухи гречихи добавляли 100 мл 70%-ного этилового спирта. Смесь кипятили 3 часа. Дали смеси остыть и затем отфильтровывали раствор через бумажный фильтр. От фильтрата растворитель отгоняли с помощью простой перегонки, а шрот высуши-

вали. Остаток после перегонки, переносили в фарфоровую чашку и упаривали досуха на водяной бане. Фарфоровую чашку с веществом термостатировали в сушильном шкафу до постоянной массы при температуре 60°С. Аналогично проводили экстракцию изопропило-вым спиртом и его 70%-ным водным раствором, также использовали 70% и 100%-ный бутиловый спирт.

Двухфазное экстрагирование осуществляли следующим образом: в сухую круглодонную термостойкую колбу, снабженную обратным холодильником, помещали 5 г измельченной до размера 3-5 мм шелухи гречихи, добавляли 50 мл соответствующего спирта и 50 мл гидрофобного растворителя. Смесь кипятили 3 часа. Далее выделяли как описано выше. В качестве спиртовой фазы использовали 70%-ный этанол, изопропанол, бутанол и их 70%-ные водные растворы.

Количественное определение фенольных соединений проводили с помощью фотоколориметрии по методике [2].

Содержание флавоноидов в пересчете на рутин и воздушно-сухое сырье в процентах (х) вычисляли по формуле:

ПК"

100

■* 100

т АД/ 100 - Ш

где D - оптическая плотность исследуемого раствора; DS - оптическая плотность ГСО рутина; m - масса сырья, г; mS - масса ГСО рутина, г; ^ - коэффициент разбавления исследуемого раствора (2500); ^^ коэффициент разбавления ГСО рутина (1250); W - потеря массы сырья после высушивания, %.

Групповой анализ полифенольных соединений проводили с помощью качественной тонкослойной хроматографии относительно стандартных образцов. В качестве стандартов использовали рутин, как образец гли-козидов, кверцетин - агликонов и хризофенол - образец сильнометилированных флавоноидов, в качестве проявителя использовали йод, в качестве элюента - систему растворителей н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (5:2:3).

Качественный анализ флавоноидов проводили с помощью качественных реакций на флавоноиды, описанных в [11].

Результаты и их обсуждение

С целью выбора наиболее эффективных условий экстракции извлечение проводилось в одинаковых условиях индивидуальными растворителями или их смесями в соотношении 1:1. В качестве спиртовой фазы использовали этанол, изопропанол, н-бутанол. В качестве гидрофобной фазы - хлороформ, бензол и гексан. Данные по количеству извлеченных при экстракции фе-нольных соединений и содержание в экстрактах флаво-ноидов приведены в табл. 1.

По реакции образования комплекса флавоноидов с хлористым алюминием установлено, что при экстракции водным раствором 70%-ного этанола содержание флавоноидов в экстракте составило 2.15%. Применение 100%-ного и 70%-ного бутилового спирта уменьшает количество извлекаемых флавоноидов (0.9-1%) из-за их меньшей растворимости в нем. Применение водного 70%-ного изопропилового спирта уменьшает извлечение фенольных соединений.

Оказалось, что для шелухи гречихи флавоноиды эффективнее оказалось извлекать двухфазной системой

Таблица 1

Зависимость выхода флавонодов от природы экстра-гента

Экстрагент Содержание флавоноидов в экстракте, %**

Гидрофильная фаза Гидрофобная фаза в.-спирт. ф. гидро-фоб.ф.

70%-ный

этанол 70%-ный изопропанол

100%-ный изопропанол 70%-ный бу-танол 100%-ный бутанол 70%-ный изопропанол

70%-ный изопропанол

70%-ный изопропанол 70%-ный бу-

танол 70%-ный бу-

танол 70%-ный бу-танол

бензол

хлороформ

бензол

хлороформ

гексан в пересчете на рутин.

2.15 2.63 0.98 0.98 0.11 2.32 2.81 0.24 0.01 0.01 0.56

0.02 0.33 0.01 2.12 0.02 0.11

экстрагентов 70%-ный изопропиловый спирт-хлороформ. В этом случае наблюдается разделение фаз и больший выход флавоноидов в спиртовой фазе (2.81%). В других случаях при использовании в качестве гидрофильной фазы 70%-ного изопропанола выход флавоно-идов в экстракте меньше (0.35-2.34%). Наименьшее содержание флавоноидов наблюдается при использование системы экстрагентов 70%-ный бутанол-хлоро-форм (0.03%). Замена хлороформа на гексан и бензол заметно позволяет увеличить выход фенольных соединений до 2%.

Для качественного анализа флавоноидных соединений наиболее широко применяется бумажная и тонкослойная хроматография с последующим проявлением пятен на хроматограммах различными хромогенными реактивами.

Подбор системы растворителей для хроматогра-фического разделения флавоноидов осуществляли с помощью пластинок SilufolUV 336.

Большинство флавоноидов на хроматограммах из-за малой концентрации бесцветны, либо слабо окрашены, поэтому пластинки выдерживали в парах йода. Разделение компонентов полифенольной фракции наблюдали в системе растворителей н-бутанол - ледяная уксусная кислота - вода (5:2:3).

Качественный анализ флавоноидных соединений показал, что для изопропанольной фракции характерно наличие только гликолизированных флавоноидов и агликонов, аналогичных по хроматографической подвижности с рутином и кверцетином, а в хлороформен-ной фракции присутствует смесь флавоноидных соединений - сильно метилированных фенолов и агликонов.

т

**

Таблица 2

Групповой состав флавоноидов, экстракта, полученного с помощью двухфазной системы экстрагентов (70% изопропанол - хлороформ (1:1))

Rf стандартных образцов Экспериментально установл. Rf

В гидрофильной фазе В гидрофобной фазе

Рутин 0.43 0.45

Кверцетин 0.76 0.76

Хризофенол 0.86 -

0.77 0.88

С помощью качественных реакций определено ориентировочное строение флавоноидов, входящих в состав экстрактов. Установлено, что из шелухи гречихи ДСЭ 70%-ного изопропанола с хлороформом извлекаются флавоны, флавонолы, ауроны, халконы, галлока-техины, 5 -окси-5 -метоксифлавоны.

Сухие экстракты, получаемые с применением технологии двухфазной экстракции летучими растворителями, имеют наиболее широкий компонентный состав и получаются с высоким выходом, что позволяет эффективно использовать их в качестве активных ингредиентов твердых лекарственных форм и БАД к пище.

Выводы

Изучен процесс извлечения биологически активных веществ из плодовых оболочек гречихи. Определены оптимальные условия экстракции флавоноидов двухфазной системой экстрагентов, заключающиеся в применении 70%-ного изопропилового спирта в смеси с хлороформом в соотношении 1:1.

Методом ТСХ и качественных реакций установлено, что в экстракте, полученном при экстракции двухфазной системой экстрагентов 70%-ный изопропанол-

хлороформ присутствуют гликозиды и агликоны в гидрофильной фракции, агликоны и сильно метилированные флавоноиды - в гидрофобной, сходные по подвижности с рутином, кверцетином и хризофенолом. ЛИТЕРАТУРА

1. Ребане Л. Целебные свойства пищевых растений. Таллин: Природа, 1990. 45с.

2. Растения для нас: Справочное издание / Под ред. Г. П. Яковлева и К. Ф. Блинова. СПб.: Учебная книга, 1996. 653 с.

3. Каухова И. Е. Новая методика получения растительных препаратов // Фармация. 2006. №1. С. 37-39.

4. Каухова И. Е. Теоретические и экспериментальные основы разработки эффективных ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения: ав-тореф. дис. д-ра фармац. наук. СПб., 2007. 48 с.

5. Вайнштейн В. А., Хаззаа И. Х., Чибиляев Т. Х., Каухова И. Е. Экстрагирование полярных БАВ из травы зверобоя двухфазной системой экстрагентов в присутствии ПАВ // Хи-мико-фармацевт. журн. 2004. Т. 38. №5. С. 25-27.

6. В. В. Сорокин, В. А. Вайнштейн, И. Е. Каухова, Т. Х. Чиби-ляев. Изучение экстрагирующей способности одно- и двухфазных систем экстрагентов для извлечения флавоноидов из травы клевера лугового // Химико-фармацевт. журн. 2008. Т.42. №8. С.23-25.

7. В. А. Вайнштейн, И. Е. Каухова. Экстрагирование лекарственного растительного сырья двухфазной системой экс-трагентов // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2014. №8. С. 82-87.

8. Л. В. Наймушина. Изучение накопления флавоноидов имбирного корня при двухфазной экстракции // Вестник Крас-ГАУ. 2 012. №9. С. 201-214.

9. Ботиров Э. Х., Дренин А. А., Макарова А. В. Химическое исследование флавоноидов лекарственных и пищевых растений // Химия растительного сырья. 2006. №1. С. 45-48.

10. Каримова Э. Р., Ямансарова Э. Т., Куковинец О. С., Абдул-лин М. И. Групповой состав фенольных соединений, извлекаемых из плодовых оболочек гречихи посевной // Вестник башкирского университета. 2011. Т.16. №4. С. 1167-1169.

11. Корулькин Д. Ю., Абилов Ж. А., Музычкина Р. А. Природные флавоноиды. Новосибирск: Академическое издательство «ГЕО». 2007. С. 43-66.

Поступила в редакцию 03.10.2015 г.

STUDING OF EXTRACTION OF FLAVONOIDS FROM BUCKWHEAT HUSKS © A. V. Apaeva*, E. T. Yamansarova, O. S. Kukovinets

Bashkir State University 100 Mingazhev St., 450014 Ufa, Republic of Bashkortostan, Russia.

Phone: +7 (347) 228 62 10.

*Email: a.apaeva-anastasia@mail. ru

The process of extraction of phenolic compounds and flavonoids from buckwheat husks was studied using individual solvents and their mixtures. As a source of vegetable raw materials, fruit shell of buckwheat grown in Chishminsky District of Republic of Bashkortostan in 2013 was used. In order to select the most efficient extraction conditions, the extraction was carried out under the same individual solvents or mixtures thereof in the ratio of 1:1. As the alcohol phase, ethanol, isopropanol and n-butanol were used. Chloroform, benzene and hexane were used as the hydrophobic phase. The optimal conditions for the extraction of flavonoids by biphasic extractant system is the use of 70% isopropyl alcohol in chloroform mixture in the ratio of 1:1. The approximate structure of flavonoids included in the extracts was determined with the help of qualitative reactions. Group analysis of polyphenolic compounds was carried out by qualitative TLC on standard samples. We used rutin as standard sample for glycosides, quercetin for aglycones and hrizofenole as a pattern of permetyl flavonoids; as a developer iodine was used; the eluent was the following solvent system: n-butanol - glacial acetic acid - water (5:2:3). Qualitative analysis was performed using flavonoids qualitative reactions to flavonoids. It was found that extract of the buckwheat hulls by DFE of 70% isopropanol-chloroform contains flavones, flavonols, auron, chalcones, gallocatechin, 5-hydroxy-5 -metoksiflavony. Dried extracts obtained the use of two-phase extraction technology with volatile solvents have the widest component composition and obtain a high yield, which allows to effectively use them as active ingredients, solid dosage forms and food supplements. The groups of flavonoids were studied with analytical thin layer chromatography and qualitative reactions. TLC reactions value found that an extract obtained by extracting with the two-phase extractant system of 70% isopropanol-chloroform glycosides and aglycones are present in the hydrophilic fraction, and aglucone strongly methylated flavonoids - a hydrophobic similar mobilities with rutin, quer-cetin and hrizofenolom.

Keywords: biologically active substances, double-phase extraction (DFE), husks of buckwheat, rutin, flavonoids.

Published in Russian. Do not hesitate to contact us at [email protected] if you need translation of the article.

REFERENCES

1. Rebane L. Tselebnye svoistva pishchevykh rastenii [Healing properties of food plants]. Tallin: Priroda, 1990. 45s.

2. Rasteniya dlya nas: Spravochnoe izdanie [Plants for us: Reference book]. Ed. G. P. Yakovleva i K. F. Blinova. Saint Petersburg: Uchebnaya kniga, 1996.

3. Kaukhova I. E. Farmatsiya. 2006. No. 1. Pp. 37-39.

4. Kaukhova I. E. Teoreticheskie i eksperimental'nye osnovy razrabotki effektivnykh resursosberegayushchikh tekhnologii lekarstvennykh sredstv rastitel'nogo proiskhozhdeniya: avtoref. dis. d-ra farmats. nauk. Saint Petersburg, 2007.

5. Vainshtein V. A., Khazzaa I. Kh., Chibilyaev T. Kh., Kaukhova I. E. Khimiko-farmatsevt. zhurn. 2004. Vol. 38. No. 5. Pp. 25-27.

6. V. V. Sorokin, V. A. Vainshtein, I. E. Kaukhova, T. Kh. Chibilyaev. Izuchenie ekstragiruyushchei sposobnosti odno- i dvukhfaznykh sistem ekstragentov dlya izvlecheniya flavonoidov iz travy klevera lugovogo. Khimiko-farmatsevt. zhurn. 2008. Vol. 42. No. 8. Pp. 23-25.

7. V. A. Vainshtein, I. E. Kaukhova. Ekstragirovanie lekarstvennogo rastitel'nogo syr'ya dvukhfaznoi sistemoi ekstragentov. Razrabotka i registratsiya lekarstvennykh sredstv. 2014. No. 8. Pp. 82-87.

8. L. V. Naimushina. Izuchenie nakopleniya flavonoidov imbirnogo kornya pri dvukhfaznoi ekstraktsii. Vestnik KrasGAU. 2 012. No. 9. Pp. 201-214.

9. Botirov E. Kh., Drenin A. A., Makarova A. V. Khimiya rastitel'nogo syr'ya. 2006. No. 1. Pp. 45-48.

10. Karimova E. R., Yamansarova E. T., Kukovinets O. S., Abdullin M. I. Vestnik bashkirskogo universiteta. 2011. Vol. 16. No. 4. Pp. 11671169.

11. Korul'kin D. Yu., Abilov Zh. A., Muzychkina R. A. Prirodnye flavonoidy [Natural flavonoids]. Novosibirsk: Akademicheskoe izdatel'stvo «GEO». 2007. Pp. 43-66.

Received 03.10.2015.