CC BY
20
УДК 615.014.67:577.722:615.038 В.П. Кал1ман
ДОСЛ1ДЖЕННЯ Г1П0ГЛ1КЕМ1ЧН01 Д11 ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО НЕ1Н'€КЦ1ЙНОГО 1НСУЛ1НУ, СТВОРЕНОГО МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОГО М1КРОКАПСУЛЮВАННЯ
Харювський нац!ональний медичний ун!верситет, Харюв
ВСТУП
Цукровий д1абет е одшею з визначальних проблем сучасноТ ендокринологп. 2000 року у свт було зарее-стровано 150 млн. хворих на цю патолопю. За прогнозами Всесв1тньоТ' органваци охорони здоров'я (ВООЗ), до 2025 року оч1куеться збтьшення числа хворих на цукровий д1абет до 300 млн., тобто вдвМ бтьше. Щортний приркт хворих на цукровий д1абет, за даними ВООЗ, складае вщ 3,6 до 5 млн. Нескладн математичн розра-хунки дозволяють припустити, що кожн п'ять хвилин у свт рееструеться новий випадок цукрового дебету [18]. Отже, сьогодн можна говорити про ешдем1ю цього захворювання у свтовому масштаб!. За даними Мши стерства охорони здоров'я, в УкраТ'ш зареестровано понад 1 млн. хворих на цукровий д^бет, причому цей показник ¡з кожним роком прогресивно збтьшуеться.
На даний час ¡снуе единий метод л!кування ¡нсулшо-залежного цукрового д!абету — це зам!сне парентераль-не введення ¡нсулшу з метою досягнення метабол!чноТ' адаптаци вуглеводного та лтщного обмшт [1]. Сьогодн у галуз! практично''' охорони здоров'я використовують р!зн! фармакопейн ¡нсулши, але ус! вони лише парентерального застосування. Створення ¡нновацшного орип-нального ¡нсулшу для перорального застосування з вираженим ппогл^емтним ефектом, що максимально кошюе б¡олог¡чну д¡ю ендогенного ¡нсул¡ну, дозволить запропонувати хворим на цукровий д^бет принципово нов¡ як¡сть ¡ стиль життя та, крш того, виключити багато негативних момент¡в застосування ¡н'екцшних ¡нсул¡н¡в. Тому розробка ¡ впровадження у клштну практику не парентеральних форм ¡нсулшт, як¡ б справляли значну ппогл^емтну д¡ю ¡ вщповщали вимогам сучасно'' фарма-копе'', — перспективний напрямок фундаментально''' та прикладно''' медицини [3-7, 19].
Метою даного дослщження було опрацьовування в експеримент ¡нновацшних л¡карських препарат¡в, ство-рених за авторським методом молекулярного м^рокап-сулювання, на як отримано патент Украши № 17699 [10] ¡ патент Украши № 17812 [11], та портняння м¡ж собою 'х г¡погл¡кем¡чних властивостей.
МАТЕР1АЛ I МЕТОДИ
Первинною субстанц¡ею для виготовлення л^ар-ського препарату ¡нсул¡ну у вигляд¡ аерозолю та твердо'' (таблетково'') форми був нашвсинтетичний людськ¡й ¡нсул¡н (сер. 0060505ППС, ЗАТ «1ндар»), який м^рокапсу-лювали за допомогою ран¡ше описано'' та добре вивче-но'' методики [12], у даному випадку значно модиф^ова-но''. На основ¡ цю первинно'' субстанцГ'' (сер. 0060505ППС) було виготовлено експериментальний зразок м^рокап-сульованого аерозоль-шсулшу зг¡дно з патентом Украши № 17699 [10] та експериментальний зразок м^рокапсу-льованого таблеткового ¡нсулшу зпдно з патентом Украши № 17812 [11].
Оригшальний м^рокапсульований аерозоль-шсулш ¡ м¡крокапсульований таблетковий ¡нсул¡н е ¡нновацшни-ми препаратами, створеними шляхом ¡нкорпорацп моле-кули нап¡всинтетичного людського ¡нсулшу у синтетичну лтосому. Для отримання синтетично'' л¡посоми викорис-товували високо очищену пдратовану касторову ол^ з наперед заданими структурно-метабол¡чними власти-востями та низку допом¡жних фармакопейних ¡нгредкн-т¡в. В основу методу молекулярного м^рокапсулювання покладено принцип нанотехнологи [12], модиф¡кований нами. Процес гщратаци касторово'' олГ'' та отримання синтетично'' везикули (л¡посоми) проводили за автор-ською методикою, яка дозволила отримати лтосомопо-д¡бну везикулу, побудовану вщповщно до принципу амф¡ф¡льност¡. Отриман¡ синтетичш л¡посоми мали вс¡ амф¡ф¡льн¡ властивосл. Так¡ синтетичн¡ везикули (м^ро-капсули) мають структуру «Матрьошки», як ¡ справжн¡ (природн¡) л¡посоми [9], вони збер^ають вс¡ властивост¡ оболонкових структур, характеризуються достатньою стшкктю до бшьшосп фермент¡в, не розп¡знаються рети-кулоендотел^льною системою та п¡ддаються ц¡лковит¡й бюлопчнш деградаци. Кр¡м того, так¡ синтетичш оболон-ков¡ структури значною мфою п¡двищують бюдоступ-н¡сть солюб¡л¡зованих у них частинок, у нашому випадку — молекул ¡нсулшу. Це дозволило солюбтвувати (м^ро-капсулювати) молекулу нашвсинтетичного людського ¡нсулшу за температури, не вищо''' за 36,0°С, та забезпечи-
54
Кл¡н¡чна ендокринолог¡я та ендокринна хфурпя 1(30) 2010
ти вишку фapмaкoпeйнy cтaбiльнicть oтpимaниx пpeпa-paтiв, a тaкoж збepiгaти гoтoвi лiкapcькi зacoби нe y люфи лiзoвaнiй фopмi, a y кiнцeвiй лiкapcькiй фopмi. Bce цe icтoтнo вiдpiзнялo викopиcтaнy тexнoлoгiю [10, 11] oтpи-мaння нeiн'eкцiйниx пpeпapaтiв iнcyлiнy вiд мeтoдiв i cпocoбiв, зaпpoпoнoвaниx i дoбpe вивчeниx paнiшe [1417]. Уci iнгpeдieнти, щo вxoдили дo дocлiджeниx пpeпapa-лв iнcyлiнy, як i caMi пpeпapaти, вiдпoвiдaли вимoгaм cyчacнoï фapмaкoпeï.
Дocлiднi зpaзки пpeпapaтiв бyлo вигoтoвлeнo в лaбo-paтopниx yмoвax з ypaxyвaнням вимoг cyчacнoï фapмa-кoпeï. ^улш, вигoтoвлeний y виглядi aepoзoлю aбo пiгyлки (eкcпepимeнтaльнi дocлiднi зpaзки), пepeд пpo-вeдeнням eкcпepимeнтy збepiгaли зa кiмнaтнoï тeмпepa-тypи бeз дoтpимaння тeмпepaтypниx peжимiв збepiгaн-ня, щo вимaгaютьcя для фapмaкoпeйниx iн'eкцiйниx rncy-лiнiв.
Гiпoглiкeмiчнy дiю дocлiдниx зpaзкiв тaблeткoвoгo тa aepoзoль-iнcyлiнy вивчaли нa мoдeлi aлoкcaнoвoгo дia-бeтy.
Eкcпepимeнт пpoвoдили нa щypax лшп Bicrap iз мacoю 190-200 г нa cьoмий дeнь пicля ввeдeння aлoкca-ну. Eкcпepимeнтaльний aлoкcaнoвий дiaбeт y пiддocлiд-ниx твapин викликaли вiдпoвiднo дo мeтoдичниx peio-мeндaцiй «Eкcпepимeнтaльнe мoдeлювaння цyкpoвoгo дiaбeтy для вивчeння cпeцифiчнoгo eфeктy нoвиx aнти-дiaбeтичниx peчoвин» [13]. Дo eкcпepимeнтy вiдбиpaли лишe твapин, y якиx пкля poзвиткy cтaбiльнoгo aлoкca-нoвoгo дiaбeтy piвeнь глюкoзи в кpoвi нaтщe був y мeжax 12,0-13,5 ммoль/л. Уcix щypiв yтpимyвaли нa oднaкoвoмy paцioнi, a пepeд пocтaнoвкoю eкcпepимeнтy твapини гoлoдyвaли пpoтягoм щoнaймeншe 6 годин. Kpoв для дocлiджeнь зaбиpaли з xвocтoвoï вeни твapини. Глюгазу y кpoвi визнaчaли глюкoзooкcидaзним мeтoдoм (кaт. №HP009,02) зa дoпoмoгoю нaбopiв TOB HBП «Ф^ат-Дiaгнocтикa».
B ycix щypiв з eкcпepимeнтaльнo виклиганим aлoкca-нoвим дiaбeтoм визнaчaли пoчaткoвий (бaзaльний) piвeнь глюкoзи в кpoвi пepeд пocтaнoвкoю eкcпepимeн-ту (нyльoвa xвилинa). Пoтiм, чepeз 20 xв., 40 xв., 60 xв., 1,5 години, 2 гoдини, 2,5 години тa 3 гoдини знoв зaбиpaли кpoв для визнaчeння вмicтy глюгази. Oдepжaнi дaнi пopiвнювaли з пoчaткoвими дaними i мiж гpyпaми.
Пiддocлiдниx твapин poзпoдiлили нa чoтиpи фупи пo 6-8 щypiв y гажнш.
1-a гpyпa. Koнтpoльнa гpyпa. Щypи з eкcпepимeн-тaльним aлoкcaнoвим дiaбeтoм, якиx нe гoдyвaли пpoтя-гом eкcпepимeнтy i нe ввoдили пpeпapaтiв iнcyлiнy. Цю гpyпy, y cвoю чepгy, пoдiлили нa двi пщфупи: пepшa шд-гpyпa — дocлiднi твapини з aлoкcaнoвим дiaбeтoм, яким пpoтягoм eкcпepимeнтy нiчoгo нe ввoдили; дpyгa пщфу-пa — дocлiднi твapини з aлoкcaнoвим дiaбeтoм, яким
ввoдили вoдy в oб'eмi, iдeнтичнoмy oб'eмy дocлiджyвa-нoгo пpeпapaтy.
2-a гpyпa. Щypи з eкcпepимeнтaльним aлoкcaнoвим дiaбeтoм, яким пepopaльнo ввoдили дocлiдний зpaзoк тaблeткoвoгo iнcyлiнy y дoзi 2 MO. Щypiв нe гoдyвaли пpoтягoм eкcпepимeнтy.
3-a гpyпa. Щypи з eкcпepимeнтaльним aлoкcaнoвим дiaбeтoм, яким пepopaльнo ввoдили дocлiдний зpaзoк aepoзoль-iнcyлiнy y дoзi 2 MO. Щypiв нe гoдyвaли пpoтя-гoм eкcпepимeнтy.
4-a гpyпa. Щypи з eкcпepимeнтaльним aлoкcaнoвим дiaбeтoм, яким нaзaльнo ввoдили дocлiдний зpaзoк aepoзoль-iнcyлiнy y дoзi 2 MO. Щypiв нe гoдyвaли пpoтя-гoм eкcпepимeнтy.
Cтaтиcтичнy o6PO6^ oтpимaниx peзyльтaтiв пpoвo-дили мeтoдaми вapiaцiйнoï cтaтиcтики тa peгpecивнo-кopeляцiйнoгo aнaлiзy зa дoпoмoгoю пaкeтy пpиклaдниx пpoгpaм Excel [8]. Maнiпyляцiï з eкcпepимeнтaльними твapинaми пpoвoдили вiдпoвiднo дo зaтвepджeниx пpa-вил «Зaгaльнi eтичнi пpинципи eкcпepимeнтiв нa твapи-нax» [2].
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Bиxiднa кoнцeнтpaцiя глюкoзи y кpoвi (нyльoвa xви-линa) в ycix eкcпepимeнтaльниx щypiв з aлoкcaнoвим дia-бeтoм кoливaлacя в мeжax 12,8±0,31 ммoль/л.
Дocлiджeння вмicтy глюкoзи в кpoвi щypiв з aлoкca-нoвим дiaбeтoм y кoнтpoльнiй гpyпi пoкaзaлo нeзнaчнe йoгo пiдвищeння нa пoчaткy eкcпepимeнтy, щo бyлo бiльш виpaжeним y дpyгiй пiдгpyпi. Пiдвищeння piвня глюгази y кpoвi твapин кoнтpoльнoï фупи нa пoчaткy eкcпepимeнтy мoжнa пoяcнити дieю cтpecy, щo cпpичи-нювaв дoдaткoвий викид кoнтpicyляpниx гopмoнiв. У ц^му кoнцeнтpaцiя глюкoзи y кpoвi твapин кoнтpoль-нoï гpyпи пpoтягoм ycьoгo eкcпepимeнтy кoливaлacя нeзнaчнo. Глiкeмiчний пpoфiль твapин кoнтpoльнoï гpyпи нaвeдeнo нa pиc. 1.
У твapин дpyгoï гpyпи з aлoкcaнoвим дiaбeтoм пicля пepopaльнoгo ввeдeння 2 MO ^улту y виглядi пiгyлки визнaчeнo вipoгiднe (p<0,05) знижeння piвня глюгази y кpoвi. Чepeз 20 xв. пoкaзник знизивcя нa 10% i cклaв 11,57±0,23 ммoль/л, a чepeз 40 xв. — вжe нa 35% (8,37±0,24 ммoль/л). Пpиблизнo нa цьoмy piвнi глiкeмiя бyлa i чepeз 60 xв., a y пoдaльшoмy пoчaлa плaвнo пщви-щyвaтиcя. Дo кiнця 2-ï гoдини вмкт глюкoзи y кpoвi був знижeним лишe нa 5% i cклaдaв 12,19±0,23 ммoль/л, чepeз тpи години вш нe вiдpiзнявcя вiд пoчaткoвoгo.
У твapин тpeтьoï гpyпи пкля пepopaльнoгo ввeдeння 2 MO ^улту y виглядi aepoзoлю тaкoж зaфiкcoвaнo вipoгiднe (p<0,05) знижeння piвня глюгази в кpoвi. Bжe чepeз 20 xв. глiкeмiя знизилacя нa 15% i cклaдaлa 10,88± ±0,25 ммoль/л, чepeз 40 xв. — пpиблизнo нa 35% (8,35± ±0,23 ммoль/л), чepeз 60 xв. кoнцeнтpaцiя глюгази y
Kлiнiчнa eндoкpинoлoгiя тa eндoкpиннa xipypгiя 1(30) 2010
55
О 20 40 60 90 120 150 180
час забирания Kpoßi (хв.)
—п'щгрупа 1 —•— п'щгрупа 2
Рис. 1. Гл1кем1чнш профть тварин контрольно!* групп.
Kpoßi почала збгльшуватися i на початок другоТ години була на pißHi початкових величин.
У тварин четвертоТ групи пiсля назального введення 2 МО гнсулгну у виглядi аерозолю вiдбувалoся вipoгiдне (р<0,05) зниження piвня глюкози у кpoвi вже на 20-й хви-линi на 12% (11,30±0,27 ммоль/л), через 40 хв. глiкемiя дopiвнювала 8,41±0,25 ммоль/л, тобто приблизно на 35% нижче вгд початкового piвня/ через 60 хв. — 10,27±0,28 ммоль/л, приблизно на 20% нижче вщ початкового piвня. У подальшому кoнцентpацiя глюкози у кpoвi прогресив-но збгльшувалася до початкових величин.
Глiкемiчний профгль усiх дoслiджених груп тварин наведено на рис. 2.
О -)--
§ 0 -I-1-1-1-1-1-1-
0 20 40 60 90 120 150 180
час забирания кров1 (хв.)
а група 1 —•—група 2 —■—група 3 —о—група 4
Рис. 2. Гл1кем1чнш профть щур1в з алоксановим д1абетом.
Слщ вщзначити, що поведшка уах щурш другоТ, тре-тьоТ та (меншою м1рою) четвертоТ груп тсля введення ¡нсулшу впродовж першого перюду експерименту була пом^но загальмованою, що можна пояснити рвким пад¡нням вм¡сту глюкози у кров¡ через високу дозу ¡нсулшу (2 МО), натомкть жодного випадку коми не було. По закшченш експерименту активнкть вс¡х щурш вщновлю-валася.
висновки
1. Отримано та апробовано в експеримент мтро-капсульований ¡нсул¡н, який справляв пом^ний ппогли кем¡чний ефект за неш'екцшного введення.
2. Застосування шновацшноТ методики молекулярного мiкpoкапсулювання напiвсинтетичнoгo людського шсулшу дозволяе отримати гoтoвi лгкарськг форми — аерозоль i пггулки — зi значним гiпoглiкемiчним ефек-том.
3. Використання нанoтехнoлoгiчнoгo методу у про-цесi мiкpoкапсулювання молекули шсулшу дозволяе уникати дотримання суворого температурного режиму для зберггання препаратгв.
4. Отриманг данi дозволяють припустити, що оригг-нальний мiкpoкапсульoваний iнсулiн може у найближчо-му майбутньому перейти зi стадп експериментальних i передклгнгчних дослгджень на етап прикладноТ медици-ни, а подальша робота у цьому напрямг дозволить запро-понувати системг охорони здоров'я препарат принципо-во нового класу.
Л1ТЕРАТУРА
1. Балаболкин МИ. Диабетология. — М.: Медицина, 2000. — 672 с.
2. Загальн етичнг принципи експериментгв на тваринах // Ендокринологгя. — 2003. Т. 8, №1. — С. 142-145.
3. Кал1ман В.П. Гипогликемическое действие перорально введенного инсулина у крыс с аллоксановым диабетом // Ендокринологгя. — 2008. — Т. 13, №2. — С. 242-247.
4. Калиман В.П. Применение липосомального спрей-инсулина в качестве гипогликемической терапии при инсули-нозависимом сахарном диабете// Експериментальна та клгнгчна медицина. — 2008. — №2. — С. 85-87.
5. Калиман В.П. Таблетированный инсулин — миф или реальность / Материалы IV Всероссийского диабетологическо-го конгресса. — Москва, 19-22 мая 2008 г. — С. 324.
6. Калиман В.П. Гипогликемическое действие таблетирован-ного инсулина, полученного методом молекулярного микрокапсулирования // Клшгчна фармацгя в УкраТнг. Матергали VIII всеукраТнськоТ науково-практичноТ конфе-ренцгТ за участю мгжнародних спецгалгстгв. — Харкгв, 6-7 листопада 2008 р. — С. 42-43.
7. Калиман В.П. Спрей-инсулин—на пути от фундаментальных исследований к прикладной медицине // Материалы IV Всероссийского диабетологического конгресса. — Москва, 19-22 мая 2008 г. — С. 322-324.
8. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel. — К.: Морион, 2000. — 320 с.
9. Липосомы в биологических системах / Под ред. Г. Грего-риадиса, А. Аллисона. — М.: Медицина, 1983. — 384 с.
10. Патент 17699U UA, МПК 7 A61D 9/00. Ппоглгкемгчний засгб у формг спрей-гнсулгну для лгкування гнсулгнозалеж-ного дгабету / Калгман В.П., Калгман П.А, та гн. (UA): З. № 200603215. Заяв. 27.03.2006; Опубл. 16.10.2006. Бюл. № 10.
11. Патент 17812U UA, МПК 7 А61К 31/00. Ппогшкемгчний засгб у формг таблетованого гнсулгну / Калгман В.П., Калгман П.А. (UA): З. № 200603976; Заявл. 10.04.2006; Опубл. 10.10.2006, Бюл. № 10.
12. Патент 75030C UA, МПК 7 А61К 9/08, 9/10, 38/00. Спосгб одержання стабгльного водного розчину препарату / Биков В.А., Щербина Н.В., Верба I.E. (RU): — З. № 200511349; Заявл. 30.11.2005; Опубл. 15.03.2006; Бюл. № 3.
56
Клгнгчна ендокринологгя та ендокринна хгрурггя 1 (30) 20 1 0
13. Полторак B.B., Блох К.О., Малашенко A.M. Экспериментальное моделирование сахарного диабета для изучения специфического эффекта новых антидиабетических веществ (Метод. рекоменд.). — Харьков, 1991. — 20 с.
14. Стефанов A.B., Лишко В.К., Шевченко A.B., Ефимов A.C., Ховако В.В. Гипогликемический эффект инсулина, включенного в липосомы, при оральном введении животным с различными типами экспериментального диабета // Укр. биохим. журн. — 1986. — Т. 58, №2. — С. 58-64.
15. Стефанов A.B., Лишко В.К., Шевченко A.B., Ефимов A.C., Ховако B.B. Стабильность и всасываемость липосом с включенным инсулином в тонком кишечнике // Укр. биохим. журн. — 1986. — Т. 58, №2. — С. 64-69.
16. Стефанов A.B., Кононенко И.Н., Лишко B.K., Шевченко A.B. Влияние инсулина в липосомах, введенного per os, на уровень сахара в крови крыс в норме и при экспериментальном диабете // Укр. биохим. журн. — 1980. — Т. 52, №4. — С. 495-498.
17. Ховака B.B. Изучение сахароснижающего действия инсулина, заключенного в липосомы, при пероральном введении экспериментальным животным / Автореф. дисс. к.м.н. — К., 1988.
18. Wild S., Roglic G., Green A. et al. Global Prevalence of Diabetes // Diabetes care. — 2004. V. 27, №5. — P. 124-127.
19. HiroshiI.,KoheiK. Future treatment of insulin therapy // Japan. J. Clin. Experim. Med. — 2002. — V. 79, №11. — P. 1995-1999.
РЕЗЮМЕ
Исследование экспериментального неинъекционного инсулина, созданного методом молекулярного микрокапсулирования В.П. Калиман
В статье приводятся экспериментальные данные по изучению и сравнению гипогликемического действия опытного образца микрокапсулированного неинъекционного инсулина на модели аллоксанового диабета, обсуждается перспектива его использования для лечения инсулинзависимого сахарного диабета в форме аэрозоль-инсулина и таблетированного инсулина.
Ключевые слова: синсулин, аэрозоль-инсулин, таблети-рованный инсулин, сахарный диабет.
SUMMARY
Investigation of experimental non-injected insulin made by method of molecular microcapsulation V.P. Kaliman
Article deals with experimental data studying and comparing of antihyperglicemic actvity of prototype microcapsulated non-injected insulin using alloxsan-induced diabetes rat model. Perspectives of its application for treatment of insulin dependent diabetes mellitus as spray and tebleted forms are discussed.
Key words: insulin, spray insulin, diabetes mellitus, micro-capsulation.
Дата надходження до редакци 10.01.2010 р.
Клштна ендокринолопя та ендокринна хфурпя 1(30) 2010
57
