ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЛТЕГРАВИРА ("ИСЕНТРЕСС", MSD, США) ПРИ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ АНЕМИИ, АССОЦИИРОВАННОЙ С ВИРУСНОЙ ЛЕЙКЕМИЕЙ КОШЕК Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 619:616.98:5786636.22/.28

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЛТЕГРАВИРА («ИСЕНТРЕСС», MSD, США) ПРИ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ АНЕМИИ, АССОЦИИРОВАННОЙ С ВИРУСНОЙ ЛЕЙКЕМИЕЙ КОШЕК

ЗЕНЧЕНКОВА А.П.,

аспирант Департамента ветеринарной медицины АТИ РУДН, г. Москва, Россия.

Реферат. Вирус лейкемии широко распространен в популяции домашних кошек и, несмотря на изученность данного заболевания, эффективной терапии, направленной на полную эрадика-цию вируса из организма инфицированного животного, не существует. Одним из наиболее жизнеугрожающих состояний, связанных с частыми гибелью и эвтаназией инфицированных животных, является анемия. Данное ретроспективное исследование направлено на оценку эффективности препарата «Исентресс» (MSD, США) с действующим веществом Ралтегравир против регенеративной анемии, ассоциированной с вирусной лейкемией кошек. В группе животных, получавших данный препарат, было зарегистрировано снижение концентрации вируса в крови, а также улучшение гематологических показателей красной крови. Гематологические показатели и концентрация вируса продемонстрировали положительную динамику у одной из кошек в группе животных, не принимавших Ралтегравир, однако связь с владельцем данного животного была потеряна, что не позволяет сделать окончательные выводы о природе этих лабораторных явлений. Вирусная нагрузка при отмене препарата возрастала, что характеризует необходимость пожизненного приема Ралтегравира. Побочных эффектов, требующих отмены препарата, отмечено не было. Единственным зарегистрированным побочным эффектом стала вялость у одной из инфицированных кошек, однако связать апатию с приемом препарата не удалось ввиду наличия у животного на момент появления побочного эффекта гематологических отклонений, связанных с выраженной анемией. Ралтегравир показал эффективность и безопасность при приеме у кошек с регенеративной анемией, ассоциированной с вирусной лейкемией кошек, однако требуются дальнейшие исследования, направленные на оценку безопасности препарата при длительном приеме у инфицированных кошек.

Ключевые слова: вирусная лейкемия кошек, анемия, антиретровирусная терапия, Ралтегравир, иммуносупрессия, вирусная нагрузка.

A STUDY OF THE EFFECTIVENESS OF RALTEGRAVIR (ISENTRESS, MSD, USA) IN REGENERATIVE ANEMIA ASSOCIATED WITH FELINE VIRAL LEUKEMIA

ZENCHENKOVA A.P.,

Postgraduate student of the Department of Veterinary Medicine of ATI RUDN, Moscow, Russia, e-mail: oshea.rorey@gmail.com.

Essay. The leukemia virus is widespread in the population of domestic cats and, despite the study of this disease, there is no effective therapy aimed at complete eradication of the virus from the body of an infected animal. One of the most life-threatening conditions associated with the frequent death and euthanasia of infected animals is anemia. This retrospective study is aimed at evaluating the effectiveness of the drug "Isentress" (MSD, USA) with the active substance Raltegravir against regenerative anemia associated with feline viral leukemia. In the group of animals receiving this drug, a decrease in the concentration of the virus in the blood was recorded, as well as an improvement in the hematological parameters of red blood. Hematological parameters and the concentration of the virus showed positive dynamics in one of the cats in the group of animals that did not take Raltegravir, but the connection with the owner of this animal was lost, which does not allow us to draw final conclusions about the nature of these laboratory phenomena. The viral load increased when the drug was canceled, which characterizes the need for lifelong administration of Raltegravir. There were no side effects requiring withdrawal of the drug. The only registered side effect was lethargy in one of the infected cats, but it was not possible to associate apathy with taking the drug due to the presence of he-

matological abnormalities associated with severe anemia in the animal at the time of the side effect. Raltegravir has shown efficacy and safety when taken in cats with regenerative anemia associated with feline viral leukemia, however, further studies are required to assess the safety of the drug when taken for a long time in infected cats.

Keywords: feline viral leukemia, anemia, antiretroviral therapy, Raltegravir, immunosuppression, viral load.

Введение. Вирус лейкемии кошек - это инфекционный агент, широко распространенный в популяции молодых кошек, имеющих доступ на улицу и контакты с сородичами. Вирус лейкемии кошек (ЛК) является гамма-ретровирусом и относится к семейству Кв^вут^ав [1, 3]. Он схож с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), что делает его полезной моделью для исследования патогенеза и клинической картины, наблюдаемых у инфицированных кошек и людей [9].

Вирусная лейкемия кошек (ВЛК) имеет несколько форм течения заболевания [8], наиболее значимой из которых является прогрессивная форма. Именно при прогрессивной форме течения ВЛК наблюдаются такие патологии, как иммуносупрессия и развитие оппортунистических заболеваний, анемия, неопластические процессы [2].

Несмотря на изученность патогенеза заболевания, эффективного лечения, направленного на полную эрадикацию вируса из организма инфицированного животного, не разработано [6]. Ранее терапия ВЛК включала разные группы препаратов (иммуномодуляторы и ан-тиретровирусные препараты, разработанные в начале изучения ВИЧ), эффективность которых была низка, а серьезные побочные эффекты, сопровождающие терапию, требовали ее отмены [12]. В настоящий момент на фармацевтическом рынке представлен относительно новый препарат "Исентресс" (MSD, США), действующим веществом которого является Ралтегравир. Недавние публикации позволяют сделать вывод о его эффективности в снижении вирусной нагрузки, наблюдаемой при прогрессивном течении ВЛК [2, 3], однако данных, оценивающих эффективность Ралте-гравира при анемии, ассоциированной с ВЛК, в ветеринарной литературе на данный момент не опубликовано.

Ралтегравир - первый одобренный препарат из группы ингибиторов интегразы ВИЧ 1-го типа, демонстрирующий высокую активность против данной вирусной инфекции. Механизм действия препарата заключается в ин-гибировании каталитической активности фер-

мента интегразы, который участвует во встраивании генома вируса в ДНК хозяина [4]. Таким образом, вирус, не встроенный в ДНК клетки хозяина, оказывается не способным продуцировать новые вирусные частицы, что делает распространение инфекции в организме хозяина невозможным. Ралтегравир мета-болизируется посредством глюкуронизации и не затрагивает печеночный путь элиминации вещества из организма, что делает возможным использование данного препарата в мульти-модальной терапии ВИЧ [10].

Первые публикации о возможности использования Ралтегравира в терапии ВЛК начали появляться в 2010-х гг. Исследования, проведенные в популяциях инфицированных кошек, продемонстрировали снижение вирусной нагрузки в 5 и более раз при прогрессивной форме течения заболевания, что связано с ингибированием вирусного фермента интегра-зы, ответственного за встраивание генома вируса в хромосому клетки хозяина [11]. Препарат имеет широкий диапазон безопасных дозировок (20-80 мг/кг), что позволяет корректировать дозировку в зависимости от состояния животного и начальной вирусной нагрузки. Побочные эффекты, зарегистрированные при приеме Ралтегравира инфицированными животными, минимальны, и включают явления со стороны желудочно-кишечного тракта, а также апатию [5].

В настоящий момент Ралтегравир считается перспективным препаратом в лечении ВЛК, однако до сих пор неизвестна его эффективность при терапии ВЛК-ассоциированной анемии, которая часто является причиной гибели инфицированных животных. В связи с вышеизложенным целью данного исследования была оценка эффективности препарата Исентресс (MSD, США), действующим веществом которого является Ралтегравир, при регенеративной анемии, ассоциированной с ВЛК, исходя из гематологических показателей крови и вирусной нагрузки инфицированных кошек.

Материалы и методы исследования.

1.1. Дизайн исследования

В данном ретроспективном исследовании было использовано 10 кошек с подтвержденным диагнозом "вирусная лейкемия кошек" и прогрессивной формой течения заболевания. Данные об участвующих в исследовании кошках представлены в таблице 1. Наличие прогрессивной формы течения ВЛК подтверждено положительными результатами полимераз-ной цепной реакцией (ПЦР) и ELISA (имму-ноферментный твердофазный анализ) [7]. На основании получения терапии Ралтегравиром инфицированные животные были разделены на две группы по 5 особей в каждой: группа кошек, получавших терапию Ралтегравиром, и кошек, не получавших терапию Ралтегравиром. В группе получавших терапию Ралтегравиром препарат Исентресс (MSD, США) вводили перорально каждые 12 часов в дозировке 20 мг/кг в течение 12 недель. Инфицированные кошки обеих групп получали Эритропо-этин (Эпокрин, ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов", Россия) в дозировке 100 МЕ/кг 3 раза в неделю курсом не менее 3-х недель и Цианокобаламин (ОАО "Борисовский завод медицинских препаратов", Республика Беларусь) в дозировке 250 мкг/животное 2 раза в неделю курсом не менее 3-х недель. Для контроля эффективности терапии данные о гематологических параметрах, вирусной нагрузке и количестве ретикулоцитов собирали каждые 7 дней в течение первого месяца и далее каждый месяц до конца исследования. Исследование проводили в период с 01.03.2021 по 24.05.2021.

1.2. Полимеразная цепная реакция

Исследование с помощью полимеразной цепной реакции было основано на обнаруже-

нии провирусной ДНК вируса лейкемии кошек в крови инфицированных животных и проводилось с помощью Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия). С помощью коммерчески доступного набора для экстракции ДНК (QIAamp DNA Blood Kits, QIAGEN, Германия) провирусную ДНК выделяли из 200 мкл цельной крови, содержащих антикоагулянт ЭДТА. Амплификацию проводили с помощью Real-Time CFX96 Touch (Biorad, США). Вирусная нагрузка определялась соотношением количества копий вирусной ДНК к количеству геномной ДНК животного.

1.3. Иммуноферментный анализ

ELISA-исследование (иммуноферментный

твердофазный анализ) было основано на обнаружении антигена ВЛК с помощью тест-системы IDEXX Snap FIV/FeLV Combo (IDEXX, США) в образцах цельной крови, содержащей антикоагулянт ЭДТА, и сыворотки инфицированных кошек.

1.4. Гематологическое исследование

Гематологическое исследование проводили на автоматическом гематологическом анализаторе Biocode-Hycel Celly 70 (Biocode-Hygel, Франция) и оценивали такие показатели, как уровень эритроцитов (RBC), гемоглобина (HGB) и гематокрита (HCT). Для исследования брали полученные от инфицированных животных образцы цельной крови объемом 25 мкл, содержащие антикоагулянт ЭДТА. Были взяты следующие референсные интервалы для гематологических показателей:

• RBC: 4,6-10 х 1012/л;

• HGB: 90-150 г/л;

• HCT: 29-48%.

Таблица 1 - Данные об участвовавших в исследовании кошках

Животные (№) Пол Возраст (г) Порода Вес (кг) Исход

Группа кошек, получавших Ралтегравир

1 2 3,9 Метис 3,2 Летальный

2 в 3,5 Метис 3,0 Положительная динамика

3 в 2,1 Метис 2,6 Потеря связи с владельцем

4 в 1,8 Метис 2,1 Положительная динамика

5 2 2,4 Метис 2,8 Положительная динамика

Группа кошек, не получавших Ралтегравир

1 в 2,3 Метис 2,8 Летальный

2 в 1,9 Метис 3,1 Летальный

3 2 3,4 Метис 2,7 Летальный

4 2 4 Метис 3,5 Потеря связи с владельцем

5 в 2 Метис 2,5 Летальный

1.5. Подсчет ретикулоцитов

Подсчет агрегатных ретикулоцитов проводили с помощью ручного метода. Для исследования проводили микроскопию мазка крови инфицированных кошек, выполненного суправитальным методом окраски. Для получения мазка использованы образцы цельной крови, содержащей антикоагулянт ЭДТА. Полученный результат выражали в процентном содержании от общего числа эритроцитов. Был взят следующий референсный интервал: 0-0%.

1.6. Гемотрансфузия

Гемотрансфузию цельной кровью проводили инфицированным кошкам при показателях гематокрита менее 15% при условии финансовых возможностей владельца и наличия продуктов крови соответствующей группы в банке крови (Независимая ветеринарная лаборатория "Шанс Био"). Гемотрансфузия цельной крови проводилась из расчета 2,2 мл/кг для увеличения гематокрита на 1%, однако часто объем переливаемой крови ограничивался объемом продукта, имевшегося в банке крови, что обуславливало показатели уровня гематокрита, эритроцитов и гемоглобина, полученные после гемотрансфузии, ниже желаемого уровня. Гемотрансфузия осуществлялась в течение 1 -2 часов в зависимости от ответа животного на манипуляцию с контролем основных витальных показателей (температура, пульс, частота дыхательных сокращения, артериальное давление) каждые 15-30 минут в течение всей процедуры. Премедикация включала в себя внутримышечные инъекции

Дифенгидрамина в дозировке 1 мг/кг и Пред-низолона 1 мг/кг за 30 минут до проведения гемотрансфузии.

Результаты и обсуждение. В группе кошек, получавших Исентресс, препарат показал высокую эффективность, снизив концентрацию вируса в крови инфицированных животных в 3-8 раз, что подтверждает выводы об эффективности препарата, сделанные в более ранних исследованиях [6]. Вирусная нагрузка у животных, не получавших Ралтегравир, осталась без изменений. Исключением стала одна кошка, чья концентрация вируса ЛК в ходе исследования уменьшилась, однако связь с владельцем данного животного была потеряна к моменту окончания исследования, что делает невозможной оценку динамики изменений вирусной нагрузки у данного животного. Результаты представлены в таблице 2.

Стоит отметить, что концентрация вируса ЛК в крови одной из инфицированных кошек, прервавшей прием Ралтегравира на 1 месяц ввиду отсутствия препарата на рынке, выросла в 2 раза, что подтверждает данные о необходимости постоянного приема Ралтегравира для успешного контроля течения ВЛК.

Большинство животных, принимавших Ралтегравир, продемонстрировали улучшения гематологических показателей, в то время как в группе кошек, не принимавших Ралтегравир, было обнаружено стойкое снижение всех показателей красной крови в независимости от силы регенеративного ответа и проводимой терапии. Результаты полученных исследований представлены в таблице 3.

Таблица 2 - Динамика изменений вирусной нагрузки* у исследуемых кошек

Животные (№) Периодичность измерений

01.03.2021 29.03.2021 26.04.2021 24.05.2021

Группа кошек, получавших Ралтегравир

1 1 1 1:3 Летальный исход

2 1 2 1:6 1:8 1:16

3 1 3 Потеря связи с владельцем

4 1 3 1:8 1:16 1:16

5 1 1 1:4 1:2** 1:8

Группа кошек, не получавших Ралтегравир

1 1 1 1:1 Летальный исход

2 1 2 Летальный исход

3 1 1 1:1 Летальный исход

4 1 3 1:6 1:6 Потеря связи с владельцем

5 1:2 1:2 1:1 Летальный исход

* соотношение количества копий вирусной ДНК к количеству геномной ДНК животного. ** перерыв в приеме Ралтегравира ввиду отсутствия препарата на российском рынке.

Таблица 3 - Гематологические показатели исследуемых кошек

Животные Периодичность измерений и показатели

0] .03.2021 05 5.03.2021 15.03.2021 22.03.2021 26.04.2021 24.05.2021

квс НОВ нет ЙВС НОВ нет ЙВС НОВ нет иве НОВ нет ЙВС НОВ нет явс НОВ нет

Группа кошек, получавших Ралтегравир

1 3,23 36 13,1 3,56 40 19:8 2,91 28 12,3 2,08 22 7,4 Летальный исход

2 1,07 21 8 2,7 56 17 3,25 63 20,2 3,11 54 19,6 4,05 74 27,9 4,68 84 30

3 4,51 32 16,5 4,44 34 17,В Потеря связи с владельцем

4 3,56 58 21 2,48 41 13,5 3,96 63 24,8 4,21 77 27,1 4,58 89 31,3 5,3 94 38,6

5 2,51 38 11,3 2,74 43 13,8 3,48 56 21,7 4,01 68 25,9 4,36 72 27,4 4,63 84 33,6

Группа кошек, не получавших Ралтегравир

1 2,76 45 13,3 3,01 68 19,8 2,84 53 15,2 18,8 80 7,1 Летальный исход

2 2,40 48 16,4 2,08 39 8,2 Летальный исход

3 1,07 35 9,2 2,38 49 15,1 2,24 38 11,2 2,03 35 8,8 Летальный исход

4 4,52 86 21,4 4,38 72 19,3 4,5 89 23,5 4,53 91 25,8 4,41 87 24,3 Потеря связи с владельцем

5 3,99 56 18,8 2,83 51 14,9 2,51 39 10,2 3,05 44 16,4 2,82 38 10,3 Летальный исход

*Зеленым цветом отмечен уровень гематокрита, при обнаружении которого проводилась гемотрансфузия.

Таблица 4 - Степень регенеративного ответа у исследуемых кошек

Животные (№) Периодичность измерений

01.03.2021 08.03.2021 15.03.2021 22.03.2021 26.04.2021 24.05.2021

Группа кошек, получавших Ралтегравир

1 0,3 1,2 0,2 0,1 Летальный исход

2 1,1 1,4 1,2 1,4 0,5 0,5

3 1,3 1,1 Потеря связи с владельцем

4 0,9 1,2 1,4 0,8 0,3 0

5 0,7 0,6 0,9 1,2 0,8 0,2

Группа кошек, не получавших Ралтегравир

1 0,8 0,7 0,3 0,1 Летальный исход

2 0,5 0,3 Летальный исход

3 0,1 0,9 0,7 0,7 Летальный исход

4 0,3 1,1 0,9 1,3 1,0 Потеря связи с владельцем

5 1,0 0,8 0,3 1,4 0,9 Летальный исход

Степень регенеративного ответа со стороны красного костного мозга варьировалась, но в целом была выше в группе кошек, получавших Ралтегравир. Исход анемии также зависел от уровня ретикулоцитоза - показатели, связанные с ростом показателей красной крови, продемонстрировали кошки с показателями ретикулоцитов, которые были выше нормы. Результаты отражены в таблице 4.

Одна кошка в группе животных, принимавших Ралтегравир, погибла через 1 месяц от

начала исследования, что было связано с низкой степенью регенеративного ответа со стороны красного костного мозга. Полученные данные могут свидетельствовать о том, что успех терапии Ралтегравиром может зависеть от степени поражения красного костного мозга на момент начала приема препарата.

Дозировка Ралтегравира на протяжении всего исследования оставалась неизменной и хорошо переносилась всеми особями из группы животных, получавших данный препарат.

У одного из животных наблюдалась вялость, однако это состояние также можно быть связано с тяжелой анемией, не поддающейся коррекции, несмотря на гемотрансфузию, терапию Ратлегравиром и консервативную медикаментозную терапию. Все это позволяет сделать заключение о безопасности Ралтегравира у кошек с ВЛК, однако требуются дальнейшие исследования, анализирующие газовый и биохимический состав крови, а также гематологические показатели у животных, длительно принимающих данный препарат.

Заключение. Препарат Исентресс (MSD, США) показал высокую эффективность в снижении вирусной нагрузки при ВЛК, а так-

же улучшении гематологических показателей красной крови у кошек с регенеративной анемией. Концентрация вируса в крови увеличивалась в течение месяца после отмены препарата, однако быстро снижалась при возобновлении приема. Побочные эффекты при приеме препарата были минимальными. Они не требовали отмены приема Ралтегравира и, вероятно, были связаны с клинической симптоматикой анемии. Необходимы дальнейшие исследования для оценки безопасности препарата при длительном приеме, а также для оценки его влияния на другие аспекты патогенеза ВЛК.

Список использованных источников

1. Amie N. Burling, Julie K. Levy, Harvey M. Scott, et al. Seroprevalences of feline leukemia virus and feline immunodeficiency virus infection in cats in the United States and Canada and risk factors for seropositivity // Journal of the American Veterinary Medical Association. - 2017. - № 2. - C. 187194. DOI: 10.2460/javma.251.2.187

2. Andrea Boesch, Valentino Cattori, Barbara Riond, et al. Evaluation of the effect of short-term treatment with the integrase inhibitor raltegravir (Isentress™) on the course of progressive feline leukemia virus infection // Veterinary Microbiology. - 2015. - № 175. - С. 167-178. DOI: 10.1016/j.vetmic.2014.10.031

3. Ariko Miyake, Shinya Watanabe, Takahiro Hiratsuka, et al. Novel Feline Leukemia Virus Interference Group Based on the env Gene // Journal of Virology. - 2016. - № 9. - С. 4832-4836. DOI: 10.1128/JVI.03229-15

4. Charles Hicks, Roy M. Gulick. Raltegravir: The First HIV Type 1 Integrase Inhibitor // Clinical Infectious Diseases. - 2009. - № 48. - С. 931-939. DOI: 10.1086/597290

5. Chloe B. Spertus, Matthew R, Pennington, Gerlinde R. Van de Walle, et at. Effects of orally administered raltegravir in cats with experimentally induced ocular and respiratory feline herpesvirus-1 infection // American Journal of Veterinary Medicine. - 2019. - № 80. - С. 490-497. DOI: 10.2460/ajvr.80.5.490

6. Heather L. Lockhart, Julie K. Levy, Susan E. Amirian, et al. Outcome of cats referred to a specialized adoption program for feline leukemia virus-positive cats // Journal of Feline Medicine and Surgery. - 2020. - № 4. - С. 1-8. DOI: 10.1177/1098612X20913359

7. Melissa J. Beall, Jesse Buch, Roberta J. Cahill, et al. Evaluation of a quantitative enzyme-linked immunosorbent assay for feline leukemia virus p27 antigen and comparison to proviral DNA loads by real-time polymerase chain reaction // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2019. - № 67. - С. 1-7. DOI: 10.1016/j.cimid.2019.101348

8. Nalie C. B. Duda, Lucia Cano Ortiz, Stella Faria Valle, et al. Laboratory and clinical findings and their association with viral and proviral loads in cats naturally infected with feline leukemia virus // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2020. - № 71. - С. 1-10. DOI: 10.1016/j.cimid.2020.101491

9. Rick B. Meeker, Lola J. Hudson. Feline Immunodeficiency Virus Neuropathogenesis: A Model for HIV-Induced CNS Inflammation and Neurodegeneration // Veterinary Science. - 2017. - № 4. - Р. 1-20. DOI: 10.3390/vetsci4010014

10. Roy T. Steigbigel, David A. Cooper, Princy N. Kumar, et al. Raltegravir with Optimized Background Therapy for Resistant HIV-1 Infection // The New England Journal of Medicine. - 2008. - № 359. - С. 339-354. DOI: 10.1056/NEJMoa0708975

11. Valentino Cattori, Beatrice Weibel, Hans Lutz. Inhibition of Feline leukemia virus replication by the integrase inhibitor Raltegravir // Veterinary Microbiology. - 2011. - № 152. - С. 165-168. DOI: 10.1016/j.vetmic.2011.03.039

12. Willie M. Greggs, Christine L. Clouser, Steven E, Patterson, et al. Discovery of drugs that possess activity against feline leukemia virus // Journal of General Virology. - 2012. - № 93. - C. 900905. DOI: 10.1099/vir.0.039909-0