CC BY
86
УДК 577.2.043:539.1
Ю. В. Саенко, А. М. Шутов
ИССЛЕДОВАНИЕ ДИНАМИКИ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОГО ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЛЕЙКЕМИИ1
Аннотация. Изучена кинетика накопления активных форм кислорода и азота, внутриклеточной концентрации восстановленного глутатиона одновременно с исследованием кинетики повреждения ДНК в раковых клетках лейкемии К562 после радиационного облучения. Оценивалась внутриклеточная концентрация активных форм кислорода, оксида азота, восстановленного глутатиона и количество разрывов цепей ДНК. Радиационно-индуцированная генерация активных форм кислорода (ROS) в клетках К562 имеет два временных максимума - через 30 мин и 24 ч после облучения. Динамика повреждения ДНК также включает два максимума - первый через 5 мин и второй - через 12-48 ч после облучения. Концентрация оксида азота начинает возрастать через 8 ч и достигает максимальных значений через 48 ч. Концентрация глутатиона возрастала к 12 ч, а затем снижалась.
Ключевые слова: оксидативный стресс, повреждение ДНК, рентгеновское излучение, глутатион, оксид азота, активные формы кислорода.
Abstract. The article considers kinetics of reactive oxygen and nitrogen species accumulation and intracellular concentration of reduced glutathione with simultaneous study of DNA damage kinetics in cancer leukemia K562 cells after exposure to radiation. The authors has estimated intracellular concentration of reactive oxygen species, nitric oxide, glutathione, and the number of DNA strand breaks. Radiation-induced ROS generation in K562 cells has two time peaks - in 30 minutes and 24 hours after exposure. DNA damage dynamics also has two peaks - the first in 5 minutes and the second - 12-48 hours after exposure. The concentration of nitrous oxide starts to increase after 8 hours and reaches its maximum at 48 hours. The concentration of glutathione increased to 12 h time point, and then decreased. Key words: oxidative stress, DNA damage, x-rays, glutathione, nitric oxide, reactive oxygen species.
Введение
Биологические эффекты, наблюдающиеся после воздействия ионизирующей радиации на живые клетки, включают в себя повреждения ДНК, перестройку хромосомного аппарата, злокачественную трансформацию, возникновение геномной нестабильности и клеточную смерть [1]. Возникновение этих эффектов может быть отсрочено во времени и проявляться даже через несколько поколений после момента облучения [2]. Одним из таких отсроченных эффектов является нестабильность генома, которая является причиной возникновений мутаций и злокачественного перерождения [3]. Аналогичная картина наблюдается и у раковых клеток. После радиационного облучения злокачественные клетки могут подвергаться дальнейшим мутациям в результате приобретенной генетической нестабильности и утрачивать ра-
1 Работа выполнена при поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» контракт № 16.740.11.0434 и № 14.740.11.1037.
диочувствительность [4]. Считается, что причиной генетической нестабильности может являться оксидативный стресс, возникающий в результате радиационного воздействия [5]. Также продемонстрировано, что генетически нестабильные клетки демонстрируют повышенный уровень внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) [6]. АФК возникают в результате радиолиза воды и являются продуктом непосредственного взаимодействия фотонов высокой энергии с водой [7]. К ним относят короткоживущие радикалы - гидроксильный радикал и супероксид анион радикал, а также пероксид водорода. Из трех вышеперечисленных представителей АФК только гидроксильный радикал является непосредственным продуктом радиолиза воды [8]. Супероксид анион радикал и пероксиды называют вторичными АФК. Они генерируются в результате протекания цепных радикальных реакций, инициируемых гидроксильным радикалом. Важными участниками подобного рода реакций являются сульфгидрильные соединения - цистеин и глутатион, с участием которых могут образовываться в процессе воздействия ионизирующего облучения супероксиданионрадикал, пероксиды и активные тильные радикалы [9]. Одним из последствий радиационного воздействия является образование разрывов цепей ДНК, которые происходят в результате гидролитического разрыва фосфодиэфирной связи после переноса свободного радикала с основания на рибозный остаток [10]. Процессы свободнорадикального повреждения ДНК несомненно служат причиной мутаций и генетической нестабильности, но они хорошо описаны только для первых моментов времени после радиационного воздействия, охватывающих период от миллисекунд до минут [11]. Генетическая нестабильность и все связанные с ней неблагоприятные последствия проявляются во втором и последующих поколениях, когда кажется, что все последствия облучения должны быть исправлены [12]. Поэтому необходимо найти связь между первичным радиационным воздействием на клетку и последующими событиями, приводящими к возникновению генетической нестабильности. Теоретические расчеты продемонстрировали, что количество вторичных радикалов, возникающих после радиационного воздействия, соответствует количеству АФК, генерируемых в процессе нормального метаболизма клетки [13]. Вторичные АФК могут генерироваться в результате ряда внутриклеточных процессов, среди которых процессы дыхания, НАДФ (КЛБР) оксидаза, ксантиноксидаза и ряд других процессов [14]. Образовавшиеся вторичные радикалы способны также вызывать повреждение ДНК и инициировать процессы, приводящие к возникновению нестабильности генома.
В настоящей работе нами предпринята попытка изучить кинетику накопления активных форм кислорода и азота, внутриклеточной концентрации восстановленного глутатиона одновременно с исследованием кинетики повреждения ДНК в культуре клеток миелогенной лейкимии К562 после радиационного облучения.
1. Материалы и методы исследования
В экспериментах использовали клеточную линию миелогенной лейкемии человека К562. Клетки культивировали при 37 °С во влажной атмосфере, содержащей 5 % СО2. Для культивирования использовали среду ИРЫ1-1649, содержащую Ь-глутамин, 15 % фетальной коровьей сыворотки и 0,04 % ген-тамицина. Клетки облучали рентгеновским излучением, генерируемым тера-
певтическим акселератором Cliniac 600 при комнатной температуре в дозах 4 и 12 Гр одноразово. Мощность дозы составляла 0,03 Гр/с при фокусном расстоянии 104 см. Высота водного столба над клетками составляла 1 см. Клетки облучались в 24-х луночных культуральных планшетах (объем лунки 2,5 мл). Параметры оксидативного стресса и повреждения ДНК анализировались через 15, 30 мин, 1, 4, 8, 12, 24, 48 ч.
Внутриклеточную концентрацию активных форм кислорода определяли с использованием 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеин диацетата (DCFH-DA). Это вещество быстро проникает в цитоплазму и взаимодействуя с АФК, окисляется до флуоресцирующего дихлорфлуоресцеина [15]. DCFH-DA добавляли в среду с клетками в конечной концентрации 30 мкМ за 30 мин до анализа и держали в СО2-инкубаторе при 37 °С. После инкубации среду удаляли, добавляли равный объем фосфатного буферного раствора рН 7,4 и оставляли на льду на 15 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции дихлорфлуоресцеина измеряли с использованием проточного цитометра Becton Dickinson FACS Canto (лазер 488 нм, LP-зеркало - 503, BP-фильтр - 530/30).
Концентрацию оксида азота внутри клеток определяли с использованием флуоресцентного красителя 4-амино-5-метиламино-2',7'-дифлуоресцеин диацетата (DAF-FM) [16]. DAF-FM добавляли в среду с клетками в конечной концентрации 5 мкМ за 30 мин до анализа и держали в СО2-инкубаторе при 37 °С. После инкубации среду удаляли, добавляли равный объем фосфатного буферного раствора рН 7,4 и оставляли на льду на 15 мин в темноте. Интенсивность флуоресценции дифлуоресцеина измеряли с использованием проточного цитометра Becton Dickinson FACS Canto (лазер 488 нм, LP-зеркало -503, BP-фильтр - 530/30).
Внутриклеточную концентрацию восстановленного глутатиона изучали с использованием флуоресцентного красителя монохлоробимана [17]. В инкубационную среду с клетками добавляли монохлорбиман в конечной концентрации 5 мкМ и оставляли в СО2-инкубаторе при 37 °С в течение 10 мин. Затем 10 мкл клеточной суспензии переносили на предметное стекло и оценивали величину флуоресценции с использованием флуоресцентного микроскопа при ^ex = 390 нм и ^em = 478 нм.
Повреждение ДНК оценивали методом щелочного электрофореза клеток в агарозном геле [18]. В качестве характеристики повреждения ДНК использовали параметр - момент хвоста кометы (Тайл момент - ТМ), который рассчитывали как произведение процентного содержания ДНК вне клетки после проведения электрофореза на длину шлейфа ДНК и выражали в условных единицах.
Все эксперименты и определения параметров были выполнены как минимум с трехкратным повторением. Результаты выражались как средние значения ± стандартное отклонение (М ± SD). Результаты обработаны статистически с использованием критерия t Стьюдента для парных переменных. Различия между группами считали достоверными при р < 0,05.
2. Результаты исследования
Радиационно-индуцированная генерация АФК (ROS) в клетках К562 имеет два временных максимума.
Для оценки внутриклеточной концентрации активных форм кислорода мы использовали DCFH-DA, который становится способным к флуоресцен-
ции при взаимодействии с АФК [15]. На рис. 1 представлены данные по внутриклеточной концентрации АФК в клетках К562 после облучения в дозах 4 и 12 Гр. Как видно, концентрация АФК имеет два максимума. Первый максимум наблюдается через 30 мин после облучения и превосходит концентрацию АФК контрольных клеток в 1,35 и 1,67 раза при облучении клеток дозами 4 и 12 Гр соответственно. При определении концентрации АФК через 4 ч после облучения оказалось, что она практически не отличается от таковой в контрольных клетках. Через 8 ч концентрация АФК в клетках, подвергшихся облучению, была в 1,1 и 1,21 раза больше, но статистически достоверно не отличалась от таковой в контрольных клетках. Далее мы наблюдали рост концентрации АФК. Через 24 ч после облучения мы наблюдали второй максимум внутриклеточной концентрации АФК, который превосходил по своим значениям первый максимум, наблюдавшийся через 30 мин после облучения. При облучении клеток дозой в 4 Гр концентрация АФК в 1,83 раза превосходила аналогичный параметр в культуре клеток, не подвергавшихся облучению, и в 2,16 раза, если клетки подвергались облучению в дозе 12 Гр. Через 48 ч после облучения происходило некоторое снижение внутриклеточной концентрации АФК. Дальнейший мониторинг концентрации АФК в культурах клеток, подвергшихся облучению, нами был признан нецелесообразным в связи со старением среды и накоплением большого количества погибших клеток, что препятствовало точному определению концентрации АФК в клеточных культурах старше 48 ч. Таким образом, нами было установлено, что после облучения в дозах 4 и 12 Гр в клетках К562 активной формы кислорода генерируются циклически с двумя максимумами через 30 мин и 24 ч после облучения.
Рис. 1. Динамика изменения активных форм кислорода после облучения клеток линии К562 рентгеновским излучением в дозе 4 и 12 Гр (данные представлены как отношение величины внутриклеточной флуоресценции дихлорфлуоресцеина опытных групп к контрольной группе; * - р < 0,05)
Концентрация оксида азота в клетках К562растет после облучения.
Внутриклеточную концентрацию оксида азота мы определяли при помощи флуоресцентного красителя DAF-FM [16]. На рис. 2 представлена динамика изменения внутриклеточной концентрации оксида азота после облучения клеток К562 дозами 4 и 12 Гр. Как видно из рис. 2, спустя 8 ч после облучения нами не было выявлено отличий во внутриклеточной концентрации азота между контрольными и облученными клетками. Через 12 ч концентрация оксида азота в облученных клетках дозами 4 и 12 Гр была в 1,25 и
1,32 раза соответственно выше, чем в контроле. В дальнейшем мы наблюдали постоянный рост внутриклеточной концентрации оксида азота. Так, через 24 ч концентрация NO в случае облучения дозой 4 Гр была в 1,35 раза выше, а в случае 12 Гр - в 1,64 раза выше, чем в контроле. По прошествии 48 ч после облучения концентрация оксида азота в клеточной культуре К562, подвергшихся облучению 12 Гр, продолжала расти и была в 2,04 раза выше, чем в контрольной группе, тогда как в случае облучения дозой 4 Гр этот параметр стабилизировался на уровне, наблюдаемом в 24 ч. На основании этих данных мы сделали вывод, что радиационное излучение стимулирует отсроченную продукцию оксида азота культурой клеток К562.
и,» -I---1----1----1----1----1----1----1----1----1----1----1----1
30 мин 4ч 8ч 12ч 24ч 48ч
Время, прошедшее после облучения 1 - —□— Контроль 2 - —О— 4 Гр 3 —А— 12 Гр
Рис. 2. Динамика изменения оксида азота после облучения клеток линии К562 рентгеновским излучением в дозе 4 и 12 Гр (данные представлены как отношение величины внутриклеточной флуоресценции флуоресцеина опытных групп к контрольной группе; * -р < 0,05)
Уровень восстановленного глутатиона после облучения возрастает, а затем снижается.
Внутриклеточная концентрация восстановленного глутатиона (08И) служит одной из характеристик тяжести внутриклеточного оксидативного стресса, считается, что при снижении концентрации 08И развивается оксида-
тивный стресс [19]. В наших экспериментах концентрация 08И в облученных клетках была выше практически на всем протяжении эксперимента. На рис. 3 видно, что при первом определении 08И через 1 ч после начала эксперимента его концентрация в облученных клетках в дозе 4 Гр на 50 % выше, чем в контрольной группе клеток. Максимальное различие в концентрации 08И между контрольными и облученными клетками мы наблюдали через 12 ч после начала эксперимента. В группе клеток, облученных в дозе 12 Гр, через 12 ч концентрация 08И была в 2,2 раза выше, чем в контрольной группе, а в группе 4 Гр - в 1,7 раза (рис. 3). В дальнейшем мы наблюдали снижение внутриклеточной концентрации восстановленного глутатиона. К 48 ч с момента начала эксперимента концентрация 08И в группе 12 Гр была всего в 1,3 раза выше, чем в контрольной группе. В группе клеток, облученных в дозе 4 Гр, концентрация 08И была ниже, чем в контрольной группе. Исходя из вышеизложенных наблюдений, мы сделали заключение, что облучение клеточной линии К562 рентгеновским излучением в дозах 4 и 12 Гр вызывает увеличение концентрации восстановленного глутатиона с максимумом в районе 12 ч с дальнейшим снижением до уровней контрольных клеток и ниже.
1ч 4ч 8ч 12ч 24ч 48ч
Время, прошедшее после облучения
Рис. 3. Изменение внутриклеточной концентрации восстановленного глутатиона после облучения клеток линии К562 рентгеновским излучением в дозе 4 и 12 Гр (внутриклеточная флуоресценция монохлорбимана оценивалась через условные единицы. За одну условную единицу принималась флуоресценция окружающей среды культивирования; * - р < 0,05)
Радиационно-индуцированное повреждение ДНК имеет волнообразную динамику.
О степени повреждения ДНК мы судили по образованию одноцепочечных разрывов, определяемых методом электрофореза клеток в агарозном геле [18]. На рис. 4 представлен график, отражающий динамику образования одно- и двуцепочечных разрывов цепей ДНК через различные промежутки вре-
мени после облучения. В первые моменты времени (через 5-30 мин после облучения) нами отмечено зависимое от дозы увеличение количества разрывов ДНК. При облучении в дозе 4 Гр на 5 мин нами зафиксировано более чем 7-кратное увеличение ТМ, а при облучении в дозе 12 Гр ТМ увеличивался в сравнении с контрольной группой в 15,1 раза. В дальнейшем ТМ облученных клеток снижался и в группе клеток, подвергшихся облучению в дозе 4 Гр, уже к первому часу составлял 4,58 против 2,47 усл.ед. в контрольной группе. Аналогичная динамика наблюдалась и в группе клеток, облученных в дозе 12 Гр. Через 8 ч после облучения ТМ в контрольной группе был 2,5 ± 0,78 усл.ед., в группах 4 и 12 Гр ТМ составлял 4,42 ± 0,1 и 5,28 ± 0,01 усл.ед. соответственно. По прошествии 12 ч с начала эксперимента и далее вплоть до окончания мониторинга изменений повреждения ДНК мы наблюдали второй этап роста значений ТМ в облученных клетках. Через 24 ч после начала эксперимента ТМ составлял 4,17 ± 1,89; 15,12 ± 2,82 и 25,52 ± 7,89 усл.ед. в группах контроля, 4 и 12 Гр соответственно. Через 48 ч ТМ у облученных клеток незначительно снижался. Таким образом, из рис. 4 видна сложная динамика изменения количества разрывов ДНК, которую можно разделить на 3 этапа:
I этап заключается в росте повреждения ДНК в первый час после облучения;
II этап характеризуется снижением ТМ до значений, незначительно отличающихся от контрольной группы; III этап характеризуется опять повышением ТМ облученных клеток.
Рис. 4. Динамика изменения повреждения ДНК после облучения клеток линии К562 рентгеновским излучением в дозе 4 и 12 Гр, выраженная через Тайл момент; * - р < 0,05)
3. Обсуждение результатов
Наиболее чувствительной биомолекулой к ионизирующему излучению является ДНК. Облучение клеток радиацией ведет к разнообразным повре-
ждениям ДНК, к которым относятся: повреждение азотистых оснований, одно- и двуцепочечные разрывы цепей ДНК, образование ковалентных сшивок между азотистыми основаниями ДНК и между ДНК и белками [20]. Наиболее мутагенными и неблагоприятными являются одно- и двуцепочечные разрывы ДНК [13], которые в данной работе оценивались по значениям Тайл момента. [18]. Возникновение разрывов цепей ДНК инициирует появление генетической нестабильности клеток [20]. Генетически нестабильные клоны раковых клеток характеризуются большей агрессивностью и проявляют большую устойчивость в отношении радио- и лекарственной терапии [3]. Образование радиационно-индуцированных разрывов цепей ДНК является многостадийным процессом. На первом этапе происходит взаимодействие гидроксильного радикала с азотистым основанием, далее через образование пероксильного радикала происходит перенос радикала с основания на рибозный остаток цепи ДНК, что и служит причиной разрыва цепи ДНК [10]. Нами в данной работе продемонстрировано, что радиационное облучение клеточной культуры линии К562 вызывает увеличение ТМ на двух временных участках. Первое увеличение ТМ нами, как и ожидалось, зафиксировано в первый момент времени после облучения. Начало второй фазы роста ТМ нами зафиксировано через 12 ч после начала эксперимента. Причиной появления второй фазы роста ТМ может быть увеличение некротических и апоптотических клеток [21].
Наиболее вероятным механизмом повреждения ДНК в нашем эксперименте является возникновение оксидативного стресса, характеризующегося увеличением внутриклеточной концентрации АФК. Из результатов нашей работы видно, что внутриклеточная концентрация АФК после однократного облучения дозами 4 и 12 Гр имеет в обоих случаях два максимума (рис. 1). Первый максимум зафиксирован нами через 30 мин после облучения. В следующей точке - 4 ч после облучения - концентрация АФК в облученных клетках статистически достоверно не отличалась от таковой в контрольной группе. Аналогичная ситуация наблюдалась и через 8 ч. Через 12 ч после облучения в облученных клетках концентрация АФК начинала расти и достигала максимума в 24 ч, через 48 ч она несколько снижалась, но все-таки в 1,5-2 раза превосходила таковую в контроле (рис. 1.) Увеличение внутриклеточной концентрации АФК, оцениваемого по возрастанию флуоресценции дихлоро-флуоресцеина в первый момент времени после облучения может быть связано с радиационно-индуцированными свободнорадикальными реакциями в воде и биомолекулах [7]. Во-первых, дигидрофлуоресцеин (ДГФ) может реагировать с пероксильными радикалами оснований, которые имеют относительно большую продолжительность жизни, или с пероксидами оснований, образующимися в результате восстановительных реакций [22]. Во-вторых, возможным механизмом является реакция ДГФ с супероксиданионрадика-лом, который может высвобождаться из радикалов дезоксирибозного остова ДНК как процесс, конкурирующий с образованием разрывов цепи ДНК [22]. Еще одна возможность увеличения флуоресценции дегидрофлуоресцеина может быть связана с его реакцией с супероксиданионрадикалом, увеличение концентрации которого в первый момент времени связана с взаимодействием кислорода с дисульфидрадикал анионами (Я88Я), последние образуются в результате неферментативной реакции глутатиона с пероксильными радикалами и далее тиильных радикалов с глутатионом [23]. Второй период роста концентрации АФК, начинающийся через 12 ч после облучения, нельзя
напрямую связывать с радиационно-индуцированным образованием свободных радикалов и АФК, но естественно, что причиной второго пика является повреждение клеточных систем радиацией. Источником АФК при нормальных условиях могут быть различные клеточные процессы, к которым можно отнести побочные продукты деятельности дыхательной цепи, НАДФН окси-дазы, ксантин оксидазы и оксигеназы арахидоновой кислоты [14]. Однако, по мнению многих исследователей, более значительным источником АФК, чем радиационно-индуцированные цепные радикальные реакции, является митохондриальная дыхательная цепь. Количества АФК, генерируемые в процессе нормального клеточного метаболиза, сопоставимы или даже превосходят количество радиационно-генерируемых АФК [13, 24]. Из ранее проведенных исследований известно, что генерация АФК зависит от митохондриального мембранного потенциала и с его увеличением количество АФК генерируемых митохондрией также увеличивается [25].
Изменение концентрации оксида азота отличалось от динамики изменения АФК на первых этапах после облучения. Рост внутриклеточной концентрации N0 приходился на 8-12 ч после облучения (рис. 2). N0, химически реагируя с АФК, генерирует пероксинитрит, который обладает большой способностью к модификации белков, липидов и ДНК. Наибольшее повреждение пероксинитрит наносит митохондриальной ДНК, поскольку основным местом формирования N000- являются митохондрии [26].
Изменение внутриклеточной концентрации восстановленного глутати-она с течением времени имеет противоположную тенденцию динамики изменения концентрации АФК, митохондриального потенциала и ТМ (рис. 4). Отчасти это можно объяснить образованием тиильных радикалов и их взаимодействием с кислородом, но наиболее вероятным механизмом снижения концентрации восстановленного глутатиона является его использование в реакциях с перекисью водорода катализируемых глутатионпероксидазой [27]. Другая причина снижения концентрации 08И связана с его использованием в реакциях коньюгации с электрофильными группами биомолекул, катализируемых глутатион-8-трансферазой, которые возникают в результате взаимодействия с АФК и свободными радикалами [28]. Увеличение концентрации 08И в период до 12 часов после облучения, вероятно, связано с задержкой клеточного цикла в 02/М фазе, поскольку именно в этой фазе наблюдается наиболее высокий окислительно-восстановительный потенциал, рассчитанный по паре 08И/а88а [19, 29].
Таким образом, можно сделать заключение, что радиационно-индуцированная генерация АФК (Я08) в клетках К562 имеет два временных максимума и походит на динамику повреждения ДНК, которая также имеет два максимума и состоит из трех фаз. Первая фаза характеризуется значительным увеличением количества разрывов ДНК и начинается сразу после облучения. Во время второй фазы происходит постепенное снижение ТМ. Во время третьей фазы ТМ опять увеличивается. Снижение концентрации 08И, увеличение внутриклеточной флуоресценции дихлорфлуоресцеина и ТМ в периоды времени 0-1 и 12-48 ч после облучения свидетельствуют о возникновении внутриклеточного оксидативного стресса, который может служить причиной повреждения ДНК в течение первой и третьей фаз. Повреждение ДНК в третьей фазе может также осуществляться оксидом азота, увеличение концентрации которого наблюдается в период 8-48 ч после облучения.
Список литературы
1. Little, J. B. Radiation carcinogenesis / J. B. Little // Carcinogenesis. - 2000. -V. 21 (3). - Р. 397-404.
2. Morgan, W. F. DNA double-strand breaks, chromosomal rearrangements, and genomic instability / W. F. Morgan, J. Corcoran, A. Hartmann et al. // Mutat. Res. -1998. - V. 4 1-2. - Р. 125-128.
3. Coleman, W. B. The role of genomic instability in human carcinogenesis / W. B. Coleman, G. J. Tsongalis // Anticancer Res. - 1999. - Nov. - V. 19 (6A). -Р. 4645-1664.
4. Hu ang, L. Radiation-induced genomic instability and its implications for radiation carcinogenesis / L. Huang, A. R. Snyder et al. // Oncogene. - 2003. - V. 22 (37). -Р. 5848-5854.
5. Kim, J. Mitochondrial dysfunction, persistently elevated levels of reactive oxygen
species and radiation-induced genomic instability: a review / J. Kim,
G. Chandrasekaran et al. // Mutagenesis. - 2006. - V. 21 (6). - Р. 361-367.
6. Limoli, C. L. Persistent Oxidative Stress in Chromosomally Unstable Cells /
C. L. Limoli, E. Giedzinski et al. // Cancer Research. - 2003. - V. 63 (12). - Р. 31073111.
7. Le Caer Sophie. Water Radiolysis: Influence of Oxide Surfaces on H2 Production under Ionizing Radiation / Le Caer Sophie // Water. - 2011. - V. 3 (1). - Р. 235-253.
8. Haliwell, B. In Free Radicals in Biology and Medicine / B. Haliwell, J. M. C. Gut-teridge. - 2 ed. - Oxford : Clarendon Press, 1989. - P. 1-81.
9. Schoneich, C. Mechanisms of protein damage induced by cysteine thiyl radical formation / C. Schoneich // Chem. Res. Toxicol. - 2008. - V. 21. - Р. 1175-1179.
10. Regulus, P. Oxidation of the sugar moiety of DNA by ionizing radiation or bleomycin could induce the formation of a cluster DNA lesion / P. Regulus, B. Duroux, P.-A. Bayle et al. // Procedings of the National Academy of Science USA. - 2007. -V. 104. - Р. 14032-14037.
11. Wardman, P. The importance of radiation chemistry to radiation and free radical biology (The 2008 Silvanus Thompson Memorial Lecture) / P. Wardman // The British Journal of Radiology. - 2009. - V. 82. - Р. 89-104.
12. Lorimore, S. A. Radiation-induced genomic instability and bystander effects: interrelated nontargeted effects of exposure to ionizing radiation / S. A. Lorimore, P. J. Coates and E. G. Wright // Oncogene. - 2003. - V. 22. - Р. 7058-7069.
13. Ward, J. F. The complexity of DNA damage: Relevance to biological consequences / J. F. Ward // Int J Radiat Biol. - 1994. - V. 66. - P. 427-432.
14. Jones, D. P. Radical-free biology of oxidative stress / D. P. Jones // Am J. Physiol Cell Physiol. - 2008. - V. 295. - Р. 849-868.
15. Oyama, Y. Characterization of 2',7'-dichlorofluorescin fluorescence in dissociated mammalian brain neurons: estimation on intracellular content of hydrogen peroxide / Y. Oyama, A. Hayashi, T. Ueha, K. Maekawa // Brain Res. - 1994. - V. 635 (1-2). -Р. 113-117.
16. Sheng, J. Z. DAF-FM (4-Amino-5-methylamino-2,7-difluorofluorescein) diacetate detects impairment of agonist-stimulated nitric oxide synthesis by elevated glucose in human vascular endothelial cells: reversal by vitamin C and L-sepiapterin / J. Z. Sheng et al. // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 2005. - V. 315. - Р. 931-940.
17. Nair, S. Flow cytometric monitoring of glutathione content and anthracycline retention in tumor cells / S. Nair, S. V. Singh, A. Krishan // Cytometry. - 1991. - V. 12 (4). -Р. 336-42.
18. Olive, P. L. Heterogeneity in radiaiton-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells mesured using the «comet» assay / P. L. Olive, J. P. Banath, R. E. Durand // Radiat. Res. - 1990. - V. 122. - Р. 86-94.
19. Schafer, F. Q. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple / F. Q. Schafer and G. R. Buettner // Free Radical Biology and Medicine. - 2001. - V. 30 (11). - Р. 1191-1212.
20. Morgan, W. F. Non-targeted and delayed effects of exposure to ionizing radiation: I. Radiation-induced genomic instability and bystander effects in vitro / W. F. Morgan // Radiat. Res. - 2003. - V. 159. - Р. 567-580.
21. Godard, T. Early detection of staurosporine-induced apoptosis by comet and annex-in V assays / T. Godard, E. Deslandes, P. Lebailly et al. // Histochem. Cell Biol. - 1999. -V. 112. - Р. 155-161.
22. Schulte-Frohlinde, D. Lifetime of peroxyl radicals of poly(U), poly(A) and single- and double-stranded DNA and the rate of their reaction with thiols / D. Schulte-Frohlinde, G. Behrens // Int J. Radiat Biol. - 1986. - V. 50. - Р. 103-110.
23. Wardman, P. Thiyl radicals in biology: their role as a ‘molecular switch’ central to cellular oxidative stress / P. Wardman // The Chemistry of S-Centered Radicals / Alfassi ZB ed. - New York, USA : Wiley, 1999. - Р. 289-309.
24. Zorov, D. B. Mitochondrial ROS-induced ROS release: an update and review /
D. B. Zorov, M. Juhaszova, S. J. Sollott // Biochim. Biophys. Acta. - 2006. - V. 1757. -Р. 509-517.
25. Starkov, A. A. Regulation of brain mitochondrial H2O2 production by membrane potential and NAD(P)H redox state / A. A. Starkov and G. Fiskum // J. Neurochem. -2003. - V. 86. - Р. 1101-1107.
26. Cover, C. Peroxynitrite-Induced Mitochondrial and Endonuclease-Mediated Nuclear DNA Damage in Acetaminophen Hepatotoxicity / C Cover, A. Mansouri, T. R. Knight, M. L. Bajt // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 2005. - Nov. - V. 315. - Р. 879-887.
27. Handy, D. E. Glutathione Peroxidase-1 Regulates Mitochondrial Function to Modulate Redox-dependent Cellular Responses / D. E. Handy, E. Lubos et al. // Journal of Biological Chemistry. - 2009. - V. 284 (18). - Р. 11913-11921.
28. Yang, Y. Role of Glutathione S-Transferases in Protection against Lipid Peroxidation / Y. Yang, J.-Z. Cheng et al. // Journal of Biological Chemistry. - 2001. - V. 276 (22). -Р. 19220-19230.
29. Conour, J. E. A combined in vitro/bioinformatic investigation of redox regulatory mechanisms governing cell cycle progression / J. E. Conour, W. V. Graham // Physiological Genomics. - 2004. - V. 18 (20). - Р. 196-205.
Саенко Юрий Владимирович
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник,
Центр нанотехнологий и материалов, Ульяновский государственный университет
E-mail: [email protected]
Шутов Александр Михайлович доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой терапии и профессиональных болезней, Ульяновский государственный университет
E-mail: [email protected]
Saenko Yuriy Vladimirovich Candidate of biological sciences, senior staff scientist, Center of Nano-technology and Materials, Ulyanovsk State University
Shutov Alexander Mikhaylovich Doctor of medical sciences, professor, head of sub-department of therapeutics and occupational diseases, Ulyanovsk State University
УДК 577.2.043:539.1 Саенко, Ю. В.
Исследование динамики радиационно-индуцированного оксида-тивного стресса в культуре клеток лейкемии / Ю. В. Саенко, А. М. Шутов // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2011. - № 3 (19). - С. 30-41.
