CC BY
47
ПРОЦЕССЫ И АППАРАТЫ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ
УДК 576.8
А. А. Денисов, И. И. Павлинова, А. А. Кадысева
ИССЛЕДОВАНИЕ БИОЦЕНОЗА ИММОБИЛИЗОВАННОЙ БИОПЛЕНКИ АНАЭРОБНОГО РЕАКТОРА
Показано, что в пленке превалировали два семейства МеЖапв^пх на поверхности и Methanвsarcina в нижних слоях пленки. Пленка содержала чагета-содержащие цисты, плотно упакованные до 20 мкм в диаметре и не плотно упакованные до 70 мкм в диаметре, содержащие кокки размеры до 2 мкм. Микробиологические популяции пленки были окружены экзополисахаридным матриксом, наиболее плотным в слоях, примыкающих к носителю.
В настоящее время все более широкое распространение приобретают исследования анаэробных методов обработки высоко загруженных сточных вод и отходов биологических очистных сооружений (осадков первичных отстойников и избыточного активного ила вторичных отстойников). Большим толчком к развитию и распространению анаэробных способов послужил внедряемый в последнее время экономический подход к оценке альтернативных источников энергии в сельском хозяйстве и промышленности.
Одним из направлений совершенствования анаэробных процессов является управление микрофлорой с целью поддержания жизнедеятельности микроорганизмов, играющих ключевую роль на различных стадиях конверсии биомассы. В связи с этим актуальным вопросом сегодняшнего дня является исследование морфологического состава популяций биопленки, функционирующей на поверхности загрузки анаэробного реактора. Наиболее важным является изучение на этой основе возможности повышения активности метаногенных бактерий на конечной стадии сбраживания при превращении углеродных соединений в метан. Поэтому главное внимание должно быть обращено на морфологию и структуру функционирующих в биопленке родов микроорганизмов, особенно метаногенных видов бактерий.
Настоящие исследования проводились в анаэробных реакторах с загрузкой из пластиковых цилиндров и сфер на сточных водах свинокомплекса производительностью 54 тыс. голов свиней. Контрольный реактор работал без загрузочного материала, чтобы определить вклад фиксированной загрузки в обработку субстрата при формировании биопленки. Реакторы имели объем 25 л и функционировали с контролируемой температурой 30 0С при времени пребывания культивируемой среды в течение 2-х суток. Загрузочный материал с биопленкой отбирался из верхней части, середины и нижней части каждого реактора. В реакторе без загрузки отбирались пробы смеси сточной воды и активного ила. Все образцы проб фиксировались 3% раствором глутаральдегида в течение 3-х часов при комнатной температуре. После этого образцы промывались и хранились в буферном растворе до тех пор, пока не выполнялось микроскопирование. Зафиксированные образцы, предназначенные для контроля с помощью электронной микроскопии, обезвоживались в этаноле и затем осушались воздухом в течение
нескольких суток. Состав микробиологических популяций, состоящих из бактерий и некоторых видов дрожжей, определялся с помощью оптического, сканирующего и трансмиссионного электронных микроскопов.
Общими наблюдениями установлено:
- толщина пленки на всех испытанных реакторах находилась в пределах от 1 до 3 мм;
- пленка плотно прилипала к пластиковым загрузочным элементам;
- на внутренней поверхности реактора без загрузки пленка не имела микробиальных разрушений и была плотной и однородной.
Оптическая микроскопия показала, что в пленках наблюдались в основном гетерогенные бактериальные популяции, причем превалировали два морфологических семейства бактерий: Methanothrix, представленные в основном на поверхности пленки, и Methanosarcina, в большинстве случаев находящиеся в прикрепленных к поверхности загрузки нижних слоях пленки. Bacilli-, cocci-, spirilla- и sarcina - содержащие цисты
различных размеров присутствовали или отдельно, или во фрагментах флоккул. Sarcina содержащие цисты имели до 50 мкм в диаметре и, тесно связанные с другими бактериями, находились в больших агрегатах. В биопленках присутствовало также множество бактериальных спор и, в незначительном количестве, одноклеточные эукариоты.
Сканирующая электронная микроскопия установила, что вся внешняя поверхность биопленки была неровной и шероховатой. Наблюдались выпуклости размером от 100 до 500 мкм в диаметре с гладкой микробиальной поверхностью. Эти выпуклости были в хаотичном беспорядке расположены в основном в толстых частях пленки. Много кристаллов минерального происхождения было вкраплено в биопленку (рис. 1). Форма кристаллов была разнообразной, а их размеры доходили до 100 мкм. При анализе с помощью спектрометра было обнаружено, что кристаллы содержат такие элементы, как Ca, Mg, P, Mn.
Рис. 1 - Сканирующие электронные микрофотографии поверхности биопленки.
Фрагменты волокна, вкрапленные в пленку вместе с многочисленными кристаллами. Увеличение 800х
Длинные волокнистые бактериальные палочки были наиболее частыми представителями поверхностной микрофлоры. Отдельные неразветвленные волокна имели 0,7 мкм в диаметре и до 100 мкм в длину. Сегментация палочек наблюдалась при большом увеличении, причем каждый сегмент имел 1,5 мкм в длину. Наблюдались также кокки и короткие округлые палочки длиной 2,0 мкм и шириной 1,3 мкм. Размеры кокков различались больше, находясь в пределах от 0,5 до 1,0 мкм в диаметре. В составе пленки присутствовало два типа sarcina-содержащих цист. Самый большой тип составляли плотно упакованные клетки, которые формировали одинаковые цисты до 20 мкм в диаметре. Поперечное сечение биопленки обнаруживает более высокую плотность материала по направлению к основе пленки. Микробиологические популяции пленки были окружены экзополисахаридным матриксом, наиболее плотным в слоях, примыкающих к носителю. По всему объему матрикса наблюдалась развитая сеть каналов, способствующих выделению образующихся при разложении субстрата газов и проникновению питательных веществ в нижние слои пленки. Более низкие слои пленки характеризовались присутствием толстого матричного материала, но встречались и щели, в которых были различимы группы клеток. Когда пленка отделялась от пластиковой поверхности носителя эти скопления можно было наблюдать на нижней поверхности пленки.
Биопленка реактора без загрузки была в основном микробиальной по составу и значительно отличалась от пленок реакторов с загрузкой наличием гладкой поверхности, содержащей главным образом кокки. В пленке было обнаружено небольшое количество кристаллов и совсем малое количество частиц почвы. В образцах проб из этого реактора в сканирующем электронном микроскопе редко наблюдались sarcina - содержащие цисты.
Трансмиссионная электронная микроскопия позволила более тонко определить ультраструктуру бактерий, входящих в состав биоценоза пленки. Длинные волокнистые палочки, превалирующие в биопленке, имели размеры около до 0,9 мкм в диаметре.
Наблюдение sarcina-содержащих цист показало, что входящие в их структуру клетки имели размеры около 1,0 мкм (рис. 2). Клетки на периферии цисты были укрыты капсулеподобным материалом или ячеистой сеткой погибших клеток.
Рис. 2 - Микрофотографии нижнего слоя биопленки. Частично разрушенная цистовая форма с колонией бактерий, связанных с внутренней частью цисты. Увеличение 7000х
Различные виды клеток были определены также в небольших, тесно упакованных конгломератах или микроколониях. Некоторые микроколонии содержали только один морфологический вид кокков, которые имели 3 мкм в диаметре. Однако, большинство микроколоний содержало несколько различных видов клеток. Наблюдались большие клетки длинных волокнистых форм с меньшими, имеющими постоянную форму, палочками 0,4 мкм в диаметре. Это расположение обеспечивало плотную упаковку разнообразных клеток. Изредка были видны группы небольших отдельных палочек 0,18 мкм в диаметре, окруженные волокнистым плотно облегающим материалом экзополисахарида.
Заключение
Настоящие исследования являются дальнейшим шагом по систематизации различных семейств микроорганизмов в иммобилизованной среде и крайне важны для понимания основных принципов управления процессами анаэробного сбраживания высокозагрязненных стоков и органосодержащих отходов.
© А. А. Денисов - д-р биол. наук, проф., зав. отд. производственной санитарии и охраны окружающей среды ВНИТИБП Российской академии сельскохозяйственных наук; И. И. Павлинова - д-р техн. наук, проф., зав. каф. коммунального и промышленного водопользования Московского ин-та коммунального хозяйства и строительства; А. А. Кадысева - асп. ВНИТИБП Российской академии сельскохозяйственных наук.
