CC BY
110
УДК 579.66:547.94
Л. М. Султанова (ст. преп.)1, А. А. Егорова (студ.)1, Р. Н. Шахмаев (к.х.н., доц.)1, Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.)1, Л. В. Спирихин (к.х.н., зав. лаб.)2, В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)1
Исследование биоконверсии растительного сырья с помощью сольвентогенных бактерий Clostridium sp. С-1
1 Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1, тел. (347) 243-19-35, e-mail: Biol@rusoil.net 2 Институт органической химии Уфимского научного центра РАН, лаборатория физико-химических методов анализа 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71, тел. (347) 235-55-60, e-mail: spector@anrb.ru
L. M. Sultanova1, A. A. Egorova1, R. N. Shakhmaev1, N. I. Petukhova1, L.V. Spirikhin2, V. V. Zorin1
Research of bioconversion of vegetable substrates into butanol
by Clostridium sp. C-1
1 Ufa State Petroleum Technological University 1, ul. Kosmonavtov, 450062, Ufa, Russia; Ph.: (347)243-19-35, e-mail: Bio1@rusoil.net 2Institute of Organic Chemistry of Ufa Scientific Centre of Russian Academy of Sciences 71, Oktyabrya Pr., Ufa, 450054, Bashkortostan, Russia,, tel. (347) 235-55-60, e-mail: spector@anrb.ru
Выделен и охарактеризован новый продуцент биобутанола dostridium sp. C1. Показана способность микроорганизма сбраживать ряд моно-и дисахаридов (глюкозу, мальтозу, ксилозу, маннозу), а также глицерин и некоторые виды растительного сырья (стебли подсолнуха, солому, древесные отходы, зерна рапса, кукурузы, пшеницы, картофель и крахмал).
Ключевые слова: брожение; бутанол; клост-ридии; растительное сырье.
Ферментация углеводов в ацетон, бутанол и этанол с помощью сольвентогенных клостри-дий — хорошо известный процесс 1 2. В начале XX века ацетонобутиловое производство по объему выпускаемой продукции являлось вторым после процесса получения этанола с помощью дрожжей. Развитие нефтехимической промышленности и повышение цен на субстраты (муку, крахмал) привело к повсеместному сокращению ацетонобутилового производства вплоть до его полного прекращения в 80-х годах прошлого века 3.
В наши дни интерес к ацетонобутиловому брожению вновь возрос благодаря растущей потребности в бутаноле. Бутанол, как жидкий энергоноситель, может частично заменить бензин и дизельное топливо благодаря высокой энергоемкости, хорошей смешиваемости, высокому октановому числу и низкой летучес-
Дата поступления 05.02.09
Clostridium sp. C-1 — new producent of biobutanol was isolated and characterized. Ability of microorganism to ferment a number of mono- and disaccharides (glucose, maltose, xylose, mannose), and also glycerol and some kinds of vegetal substrates (stalks of sunflower, straw, wood waste, grains of rape, corn, wheat, potato and starch) was shown.
Key words: butanol; Clostridium; fermentation; vegetal substrates.
ти 4. Он также широко используется как сырье при производстве пластиков, как экстрагент в пищевой и парфюмерной промышленности 5.
Продуцентами бутанола являются бактерии Clostridium acetobutylicum 6, C. beijerinckii 7' 8, C. saccharoperbutylacetonicum 9, C. ther-mosaccharolyticum 10, которые могут использовать довольно широкий спектр субстратов. Наиболее активные штаммы клостридий способны накапливать в оптимальных условиях около 15 г/л бутанола. Удаление в ходе ферментации сопутствующих кислот (уксусной и масляной), ингибирующих процесс брожения,
позволяет дополнительно увеличить выход це-11
левого продукта .
Экономическая эффективность процесса ацетонобутилового брожения напрямую зависит от стоимости субстрата. При использовании для производства бутанола традиционных
субстратов — муки, мелассы, крахмала и глюкозы, стоимость последних составляет до 60% от общих затрат. Для того, чтобы сделать аце-тонобутиловое брожение экономически выгодным в современных условиях, необходимы высокопродуктивные штаммы микроорганизмов, растущие на доступном и дешевом сырье.
В результате скрининга продуцентов бу-танола среди 90 почвенных культур анаэробных спорообразующих микроорганизмов, выделенных из различных мест обитания, был выявлен штамм С-1, накапливающий при росте на глюкозе в неоптимизированных условиях около 4 г/л бутанола.
Бактерии представляют собой анаэробные, грамположительные, подвижные палочки с перетрихальным жгутикованием, образующие овальные эндоспоры. При ферментации глюкозы помимо бутанола в среду выделяются масляная кислота, ацетон и этанол, а также газообразные продукты. Штамм идентифицирован как Clostridium sp. и депонирован в коллекции культур микроорганизмов кафедры биохимии и технологии микробиологических производств ГОУ ВПО «Уфимский государственный нефтяной технический университет».
При исследовании субстратной специфичности было обнаружено, что найденные бактерии способны сбраживать ряд моно- и дисаха-ридов (глюкозу, мальтозу, ксилозу, маннозу), а также глицерин с образованием ацетона, бу-танола и этанола (рис. 1). Выход продуктов ферментации соответствовал известному для ацетонобутилового брожения соотношению 3 : 6 : 1 (ацетон:бутанол:этанол) 11. В то же
время было установлено, что галактоза и лактоза практически не сбраживались бактериями Clostridium sp. С-1.
Полученные результаты показывают, что данная культура бактерий представляет интерес для получения бутанола из гидролизатов углеводных компонентов растительного сырья (крахмала, целлюлозы, гемицеллюлозы) и отработанной микробной биомассы, содержащих глюкозу, мальтозу, ксилозу или маннозу, а также из глицерина, образующегося как отход при получении биодизеля. В тоже время молочная сыворотка (отход переработки молока), в состав которой входит лактоза, не может быть использована в качестве сырья для производства бутанола с помощью бактерий Clostridium sp. С-1.
Известные раздельные двухстадийные процессы получения бутанола, основанные на химическом гидролизе полимерного сырья и последующей ферментации продуктов гидролиза, оказались экономически не выгодными. Вместе с тем известно, что некоторые штаммы клостридий могут продуцировать ферменты, расщепляющие полимерные компоненты растительной биомассы, что позволяет осуществлять стадию гидролиза и ферментацию в одном реакторе 12-16. Такой подход значительно сокращает затраты на производство биобута-нола. В связи с этим была исследована способность бактерий Clostridium sp. C-1 гидролизо-вать и сбраживать растительное сырье различного углеводного состава, в частности, стебли подсолнуха, солому, древесные отходы (опилок), зерна рапса, кукурузы, пшеницы, а также картофель и крахмал.
5-
r 4,5-
^ 4^ «
К 3 5_
К 35
* 3-о
о ft С
21,510,50-1
Ш
-i~db Д
а а Я
СП СП СП
о о о
т т Н
Л И И
л а CS
а л н
2 CS 1-е
к
S ft о Я S н
1-е
Я
еч
Я Я
N о ft
ю
н
и «
о ft с
04
□ бутанол
□ ацетон □ этанол
Рис. 1. Выход продуктов брожения при использовании различных углеводов и глицерина
Рис. 2. Выход продуктов брожения при использовании растительного сырья
ft 2 5
б
2
1
В результате исследования было обнаружено, что полученный штамм активно сбраживает крахмал, а также крахмалсодержащее сырье (картофель, пшеницу, кукурузу), что указывает на наличие у него амилолитических ферментов (а-амилаз или амилоглюкозидаз) 12. Наибольший выход бутанола был получен при сбраживании крахмала, что, вероятно, связано с большей доступностью этого субстрата для бактерий.
Обнаружено также, что исследуемая культура бактерий способна синтезировать бу-танол на зернах масленичных культур, в частности рапса, используемого для производства биодизеля (рис. 2).
Кроме того, установлено, что бактерии С1о..Ьг1й1иш .р. С-1 осуществляют биоконверсию соломы, стеблей подсолнуха и древесных опилок, состоящих главным образом из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина (рис. 2). Деградация подобных растительных субстратов у клостридий происходит с участием ксилана-зы 1113 и целлюлолитического ферментативного комплекса (целлюлосомы) 14. Это позволяет предполагать наличие у исследуемого штамма аналогичных ферментов, гидролизующих целлюлозу и расщепляющих ксилан — главный компонент гемицеллюлозы.
Таким образом, полученные данные показывают перспективность использования найденных бактерий С1о..Ьг1й1иш .р. С-1 для производства биобутанола на основе растительного сырья и отходов производства биодизеля. Однако требуется поиск оптимальных условий ферментации с целью увеличения выхода целевых продуктов.
Экспериментальная часть
Микроорганизмы выращивали на питательной среде, содержащей 2% мясопептонно-го бульона (МПБ) с добавлением различных источников углерода. В качестве источников углерода использовали моно- и дисахариды: глюкозу, мальтозу, ксилозу, маннозу, лактозу и галактозу, а также глицерин и некоторые виды растительного сырья: стебли подсолнуха, солому, древесные отходы, зерна рапса, кукурузы, пшеницы, картофель и крахмал в концентрации 5%. Микроорганизмы культивировали в анаэробных условиях в стерильных флаконах в термостате при 37 оС в течение 1.5—4 сут.
Идентификацию бактерий осуществляли
Концентрацию бутанола, ацетона и этанола в культуральной жидкости определяли методом ГЖХ после предварительного осветления проб центрифугированием в течение 10 мин при 12000 об/мин. Анализ проводили на газо-жидкостном хроматографе ЛХМ-80 с детектором по теплопроводности. Использовали газ-носитель — гелий (расход газа — 30 мл/мин), хроматографическую колонку 2000 х 3 мм с неподвижной жидкой фазой SE — 30—50 % на хроматоне N-AW, с изотермой на 60 оС.
Идентификацию продуктов брожения осуществляли методом хроматомасс-спектро-скопии на аппаратно-програмном комплексе Хроматэк-Кристалл 500 с масс-селективным детектором Finigan DSQ (электронная ионизация при 70 эВ).
Литература
1. Jones D. T., Woods. D. R. // Microbiol. Rev.-1986.- V. 50.- P. 484.
2. Rogers P. // Adv. Appl. Microbiol.- 1986.-V. 31.- P. 1.
3. Zverlov V. V., Berezina O., Velikodvorskaya G. A., Schwarz W. H. // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 2006.- V.71.- P. 587.
4. Ladisch M. R. // Enzyme Microb. Technol. -1991.- V. 13.- P. 280.
5. Ezeji T., Qureshi N., Blaschek H. P. // Process Biochemistry.- 2007.- V.42.- P. 34.
6. Qureshi N., Li X-L., Hughes S., Saha B. C., Cotta M. A. // Biotechnol. Prog. -2006.-V.22.- P. 673.
7. Formanek J., Mackie R., Blaschek H. P. // Appl. Envron. Microbiol.- 1997.- V. 63, № 6.-P. 2306.
8. Durre P. // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1998.- V.49.- P. 639.
9. Kobayashi G., Eto K., Tashibo Y., Okubo K., Sonomoto K., Ishizaki A. // J. Bioschem. Bioeng.- 2005.- V. 99, № 5.- P. 517.
10. Landuyt S. M., Hsu E. J., Wang B-T., Tsay S-S. // Envron. Microbiol.- 1995.- V. 61, № 3.-P. 1153.
11. Qureshi N., Saha B. C., Cotta M. A. // Bioprocess Biosyst Eng.- 2007.- V. 30.- P. 419.
12. Ezeji T. C., Qureshi N., Blaschek H. P. // Journal of Biotechnology.- 2005.- V. 115.-P. 179.
13. Marichamy S., Mattiasson B. // Enzyme and Microbial Technology.- 2005.- V. 37.- P. 497.
14. Desvaux M. // Enzyme and Microbial Technology.- 2005.- V. 37.- P. 373.
15. Хоулт Дж., Криг Н., Снит П., Стейли Дж., Уильяме С. Определитель бактерий Берджи.-М.: Мир.- 1997.- T.2.- 368 с.
по
