CC BY
135
УДК 576.851.24
H.A. Глушанова1, Н.Б. Вербицкая2, Л.Н. Петров2, А.И. Блинов1, Б.А. Шейдеров3
ИССЛЕДОВАНИЕ АУТО-, ИЗО- И ГОМОАНТАГОНИЗМА ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ЛАКТОБАЦИЛЛ
1 ГОУ ДПО Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей (Новокузнецк)
2 ГНЦ Институт особо чистых биопрепаратов (Санкт-Петербург) 3 ФГУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ (Москва)
Изучен ауто-, изо- и гомоантагонизм среди пробиотических штаммов лактобацилл Lactobacillus acidophilus NK-1, L. plantarum. 8Р^3, L. acidophilus 317/402, L. acidophilus Д75 и L. acidophilus Д76 (препарат. «Витафлор») на двух вариантах плотной питательной среды. МРС-5: приготовленной по стандартной прописи и. с добавлением 1% мела для. нейтрализации, кислых продуктов метаболизма штам-ма-продуцента. Установлено, что ауто-, изо- и. гомоантагонизм, изученных штаммов лактобацилл обусловлен не только кислыми экзометаболитами, образующимися, в процессе их роста, но и другими субстанциями, более активными в условиях нейтрализации кислот, мелом.. Изучено влияние не-фракционированного безмикробного фильтрата L. acidophilus NK-1 (рН 6,1) и. его низко- (менее 12000 D) и. высокомолекулярных (более 12000 D) диализованных фракций на выход биомассы L. acidophilus NK-1, L. plantarum. 8Р^3, L. acidophilus 317/402 и. препарата «Витафлор» при культивировании в жидкой питательной среде.
Ключевые слова: пробиотические лактобациллы, антагонизм
STUDY OF AUTO-, ISO- AND GOMOANTAGONISM OF PROBIOTICAL LACTOBACILLI STRAINS
N.A. Glushanova1, N.B. Verbitskaya2, L.N. Petrov2, A.I. Blinov1, B.A. Shenderov3
1 Medical Institute of Postgraduate Training, Department of Microbiology, Novokuznetsk
2 SSC RF Institute of specifically cleaned biopreparations, St. Petersburg
3 FSIS G.N. Gabrichevsky Moscow SRI of Epidemiology and Microbiology, Moscow
Auto-, iso- and gomoantagonism amongst strain of probiotical lactobacilli Lactobacillus acidophilus NK-1, L. plantarum. 8Р^3, L. acidophilus 317/402, L. acidophilus Д75 and L. acidophilus Д76 (composition «Vita-flor») on two variants to the thick nourishing ambience МРС-5: prepared, on standard, samples of writing and.
with the accompaniment 1% chalk for neutralizations of tart products, the strain-producent which produces, the method, consequent cultivating in vitro is studied. It is shown, that auto-, iso- and gomoantagonism. of studied, strains lactobacilli can lie not only tart exsomethabolites, forming in the process of their growing, as well as other substances more active in conditions of neutralizations of acids by the chalk. Influence non fractionable unmicrobial filtrate Lactobacillus acidophilus NK-1 (рН 6,1) and. its low (less than 12000 D) and. high, molecular (more than 12000 D) dialyze fractions on leaving of biomass Lactobacillus acidophilus NK-1, L. plantarum. 8P-A3, L. acidophilus 317/402, composition. «Vitaflor», when cultivating in fluid, culture medium., is studied.
Keywords: probiotical lactobacilli, antagonism_______________________________________________________________________________
ВВЕДЕНИЕ
Анализ причин не всегда убедительной эффективности клинического применения пробиотиков позволяет сделать вывод, что на приживаемость и активность пробиотических штаммов в организме нового хозяина оказывают влияние многие факторы, среди которых определенное значение может иметь антагонизм (бионесовместимость) между пробиотическими бактериями и резидентной микрофлорой [6]. Проведенные нами ранее исследования совместного культивирования на плотной питательной среде большого количества штаммов молочнокислых бактерий различной природы и происхождения показали существование и высокую частоту антагонизма между пробиотическими и резидентными культурами лактобацилл [5]. Экспериментальные исследования на лабораторных животных также свидетельствуют, что штаммы пробиотических лактобацилл, бионе-совместимые с индигенными лактобациллами хозяина, лишь транзиторно сохраняются в организме нового хозяина и не обеспечивают эффективной и быстрой коррекции микроэкологических нарушений [4, 7, 8].
Наряду с индивидуальными генотипическими особенностями, существенную роль в проявлениях межвидового антагонизма лактобацилл могут играть продуцируемые ими биологически активные соединения (например, молочная и другие кислоты, лактоцины, перекись водорода) [11, 12,
14, 15]. В связи с этим для понимания механизмов взаимодействия микроорганизмов в системах бактерия-бактерия, бактерия-хозяин и совершенствования пробиотикотерапии, представляет интерес дальнейшее исследование продуктов метаболизма, оказывающих влияние на характер взаимоотношений индигенных и пробиотических микроорганизмов [9, 10].
Целью настоящей работы являлось изучение влияния экзометаболитов пробиотических лактобацилл на проявления феноменов аутоантагонизма, изоантагонизма и гомоантагонизма.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования являлись криокон-сервированные пробиотические штаммы лактобацилл Lactobacillus acidophilus NK-1, L. plantarum 8Р-Л3, L. acidophilus 317/402 (Наринэ) из коллекции МНИИЭМ им. Г.Н. Габричесвского и ассоциация симбиотических штаммов L. acidophilusД75 и L. acidophilus Д76 (препарат «Витафлор», ГНЦ РФ «ГосНИИ особо чистых биопрепаратов», Санкт-Петербург).
Ранее нами в исследованиях in vitro было установлено, что пробиотический штамм L. acidophilus NK-1 подавляет развитие L. plantarum 8Р-А3 и L. acidophilus 317/402 [3]. В настоящей работе изучено влияние суммарных и фракционированных экзометаболитов периодической культуры L. acidophilus NK-1 на рост и накопление биомассы указанных пробиотических лактобацилл в жидкой гидролизно-молочной среде (ГМС).
Штаммы пробиотических лактобацилл выращивали в течение 24 часов при 37 °С в ГМС. Затем исследуемые образцы нейтрализовали 12% раствором аммиака до рН 6,8, вносили 15 % глицерина, разливали по 0,5 мл в пробирки типа «эппендорф» и закладывали на хранение при температуре — 70 °С. Каждый эксперимент проводили с использованием отдельной пробирки с замороженным образцом.
Для получения препарата суммарных безмик-робных экзометаболитов с потенциальной антимикробной активностью, штамм L. acidophilus NK-1 выращивали в питательной среде ГМС в течение 18 часов при температуре 37 °С. Полученная биомасса L. acidophilus NK-1 имела следующие характеристики: концентрация жизнеспособных клеток 8,54 Lg КОЕ/мл, рН 3,9, титруемая кислотность 120 °Т. Бактерии отделяли центрифугированием при 3000 об./мин в течение 30 минут, супернатанты нейтрализовали 12% раствором аммиака до рН 6,1 и фильтровали через мембраны Millipore с диаметром пор 0,45 цш. Фильтраты хранили при +4 °С. Разделение экзометаболитов L. acidophilus NK-1, присутствующих в супернатанте, на фракции осуществляли с использованием диализных мешков Sigma 250-7U, пропускающих соединения с молекулярной массой не более 12000 дальтон.
Антагонистические свойства L. acidophilus NK-1 и пробиотика «Витафлор» в отношении тест-культур (L. plantarum 8Р-А3 и L. acidophilus 317/402) исследовали на плотной питательной среде МРС-5 при помощи классического метода отсроченного антагонизма. Для этого культуры, исследуемые на продукцию антагонистических субстанций, засевали штрихом по центру чашки, инкубировали в течение 24 часов в микроаэро-фильных и капнофильных условиях при 37 °С, а затем перпендикулярными штрихами к полоске роста штамма-антагониста подсевали тест-культуры; чашку вновь инкубировали в аналогичных условиях. Зону задержки роста тест-культур измеряли в мм. С целью выявления и оценки интен-
сивности аутоантагонизма штаммы-антагонисты одновременно использовали и в качестве тест-культуры. Для выявления изоантагонизма (антагонизма в отношении других штаммов этого же вида), использовали культуру L. acidophilus 317/402. Для изучения гомоантагонизма (антагонизма между разными видами одного рода) тест культурой служил штамм L. plantarum 8P-A3. При постановке опытов применяли параллельно два варианта питательной среды МРС-5: приготовленной по стандартной прописи и с добавлением 1 % мела для нейтрализации кислых продуктов метаболизма штамма-антагониста.
Изучение экзометаболитов штамма L. acidophilus NK-1 в экспериментах ауто-, изо- и гомоантагонизма осуществляли в жидкой питательной среде ГМС. В зависимости от задачи эксперимента в питательные среды вносили нейтрализованные нефракционированные (НФ) без-микробные фильтраты биомассы L. acidophilus NK-1, их низкомолекулярные (НМ, не более 12000 дальтон) и высокомолекулярные (ВМ, более 12000 дальтон) фракции в различной концентрации. Результаты оценивали после инкубирования посевов при температуре 37 °С в течение 18 часов по накоплению биомассы тест-штамма. Выход биомассы определяли по оптической плотности (OD540) с помощью спектрофотометра СФ-26 при длине волны 540 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Контролем служила питательная среда ГМС.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение влияния кислых продуктов метаболизма L. acidophilus NK-1 и штаммов, входящих в состав препарата «Витафлор», на проявления ауто-гомо- и изоантагонизма на плотной среде показало, что в процессе жизнедеятельности лактобацилл в питательной среде МРС-5 накапливаются метаболиты, активно ингибирующие рост самого продуцента (аутоантагонизм). При этом в условиях нейтрализации кислых продуктов метаболизма мелом, зоны задержки роста как L. acidophilus NK-1, так и препарата «Витафлор», оказались даже несколько больше, чем на среде без мела, что указывает на образование не только кислых продуктов метаболизма, но и других антагонистических
субстанций, более активных в нейтральной среде (табл. 1).
В исследованиях по изучению гомоантагонизма нами было обнаружено, что L. acidophilus NK-1 и «Витафлор» проявляли более значительную антагонистическую активность в отношении L. plantarum 8P-A3 на питательной среде МРС-5, не содержащей мел, нейтрализующий кислые продукты метаболизма. Это дало основание предполагать, что в феномен гомоантагонизма лактобацилл существенный вклад вносят молочная кислота, летучие жирные кислоты (ЛЖК) и, возможно, другие соединения, снижающие рН среды культивирования.
Наши исследования феномена изоантагонизма показали, что L. acidophilus NK-1 и «Витафлор» обладали индивидуальной специфичностью. Так, проявления изоантагонизма L. acidophilus NK-1 в отношении L. acidophilus 317/402 не зависело от наличия в питательной среде мела: как в его присутствии, так и без него зоны задержки роста имели равную величину. Напротив, совместное выращивание лактобацилл, входящих в состав «Витафлор», и штамма L. acidophilus 317/402 характеризовалось более значительной задержкой роста тест-культуры на питательной среде МРС-5 с мелом, чем в отсутствии в среде мела.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют, что в основе феноменов ауто-, гомо- и изоантагонизма изученных штаммов лактобацилл, могут лежать не только кислые экзометаболиты, образующиеся в процессе их роста (молочная кислота, ЛЖК), но и другие субстанции, более активные в условиях нейтрализации кислот мелом.
Исследования антимикробной активности безмикробного фильтрата L. acidophilus NK-1 в отношении тест-штаммов лактобацилл в жидкой питательной среде ГМС, показали, что цельный нефракционированный (НФ) фильтрат, нейтрализованный до рН 6,1 и вносимый в питательную среду ГМС в количестве 0, 25, 50, 75 и 100 %, различным образом влиял на рост и размножение тест-культур (табл. 2). Анализ данных табл. 2 свидетельствует, что накопление биомассы тест-культур лактобацилл снижалось при увеличении количества нефракционированного безмикроб-
Таблица 1
Влияние кислых продуктов метаболизма лактобацилл на проявления ауто- гомо- и изоантагонизма
Продуцент Вариант среды * Тест-культуры и величина зоны подавления их роста, мм
L. acidophilus NK-1 L. plantarum 8P-A3 L. acidophilus 317/402 Пробиотик «Витафлор»**
L. acidophilus NK-1 без мела 25 9 35 22
с мелом 28 7 35 28
Витафлор** без мела 21 8 29 18
с мелом 26 4 35 23
Примечание: * - плотная питательная среда МРС-5; ** - Витафлор изготовлен на основе двух симбиотических штаммов L. acidophilus Д75 и L. acidophilus Д76.
ного фильтрата L. acidophilus NK-1; наибольшую чувствительность к нему проявляли лактобациллы препарата «Витафлор» и сам штамм L. acidophilus NK-1. В то же время выход биомассы штамма L. acidophilus 317/402 при добавлении 25 % нефракционированного безмикробного фильтрата L. acidophilus NK-1 даже несколько увеличивался. Это свидетельствует, что подавляющее или стимулирующее действие НФ безмикробного фильтрата L. acidophilus NK-1 связано не только с кислыми продуктами метаболизма, но и с другими субстанциями штамма антагониста, накапливающимися в среде культивирования. В связи с этим, нами было проведено изучение влияния нефракционированного безмикробного фильтрата L. acidophilus NK-1 (рН 6,1) и его низко- (менее 12000 D) и высокомолекулярных (более 12000 D) диализованных фракций на выход биомассы как самого продуцента экзометаболитов - штамма L. acidophilus NK-1, так и тест-штамма L. acidophilus 317/402.
Количество вводимых фракций в питательную среду ГМС составляло от 0 до 20 % (по объе-
му) (табл. 3). Установлено, что в диапазоне концентраций 1—20 % НФ безмикробный фильтрат L. acidophilus NK-1 практически не влиял на рост самого продуцента, а в отношении штамма L. acidophilus 317/402 оказывал стимулирующий эффект.
Добавление в ростовую среду НМ-фракции безмикробного фильтрата штамма L. acidophilus NK-1 в количестве 2,5 и 10 % от объема питательной среды ГМС заметно усиливало накопление биомассы как L. acidophilus 317/402, так и L. acidophilus NK-1. При повышении концентрации НМ-фракции безмикробного фильтрата L. acidophilus NK-1 до 20 % наблюдался обратный эффект: незначительное подавление роста L. acidophilus NK-1 и заметное ингибирование L. acidophilus 317/402 (табл. 3). Состав НМ-фракции фильтрата L. acidophilus NK-1, содержащей молекулы размером менее 12000 D, представлен, в основном, молочной кислотой, уксусной и другими летучими жирными кислотами. Известно, что ацетат в низких концентрациях способен стимулировать рост бактери-
Таблица 2
Накопление биомассы тест штаммов лактобацилл в присутствии нефракционированного фильтрата L. acidophilus NK-1
Концентрация (%) НФ фильтрата L. acidophilus NK-1 Тест-штаммы
L. acidophilus NK-1 L. plantarum 8P-A3 L. acidophilus 317/402 «Витафлор»
OD540 в % от контроля через 18 час при 37 °С
0 100 100 100 100
25 71 88 105 42
50 32 75 95 26
75 7 56 56 8
100 7 53 30 5
Примечание: OD540 определяли на спекторофотометре СФ-26.
Таблица 3
Накопление биомассы L. acidophilus NK-1 и L. acidophilus 317/402 в присутствии различных количеств диализованных фильтратов L. acidophilus NK-1
Количество диализованных фильтратов (в объемных процентах)
Тест-штамм Добавки 0 % 1 % 2,5 % 10 % 20 %
OD540
НФ 5,3 5,2 5,2 5,2 5,2
(100)* (98) (98) (98) (98)
L. acidophilus NK-1 НМ 5,3 (100) 5,0 (94) 5,5 (103) 5,7 (107) 5,0 (94)
ВМ 5,3 5,1 4,9 5,0 4,3
(100) (96) (92) (94) (81)
НФ 5,0 5,4 5,3 5,8 6,0
(100) (108) (106) (116) (120)
L. acidophilus 317/402 НМ 5,0 (100) 4,4 (88) 5,2 (104) 5,8 (116) 4,6 (92)
ВМ 5,0 3,6 5,2 3,8 3,1
(100) (72) (104) (76) (62)
Примечание: * - в скобках указано процентное соотношение OD540 по отношению к контролю (количество добавок в объемных процентах равно нулю); условные обозначе ния в таблице: НФ - нефракционированный фильтрат L. acidophilus NK-1; НМ - низкомолекулярная фракция фильтрата L. acidophilus NK-1 (менее 12о0о D); ВМ - высокомолекулярная фракция фильтрата L. acidophilus NK-1 (более 12000 D).
альной культуры, а в высоких — оказывать ингибирующее действие [1, 2]. Следовательно, стимулирующий эффект НМ-фракции безмикробного фильтрата L. acidophilus NK-1, можно связать с действием ацетата, продуцируемого этим штаммом.
Внесение в питательную среду ГМС от 1 до 20 % ВМ-фракции безмикробного фильтрата L. acidophilus NK-1, выявило прямую зависимость ее ингибирующего действия от концентрации на развитие самого продуцента L. acidophilus NK-1. В отношении штамма L. acidophilus 317/402 ВМ-фракция безмикробного фильтрата L. acidophilus NK-1 также действовала угнетающе в концентрациях 1 %, 10 % и 20 %, а в количестве 2,5 % оказывала стимулирующее действие (табл. 3).
Таким образом, проведенные нами исследования показали, что в механизмах взаимодействия лактобацилл существенную роль играют продуцируемые ими в среду культивирования экзометаболиты. Установлено, что низкомолекулярные органические кислоты активно участвуют в проявлениях межбактериальных взаимоотношений этих микроорганизмов. На разных этапах развития периодической монокультуры эти экзометаболиты, в зависимости от концентрации, могут выполнять функции ингибиторов или стимуляторов роста как самих штаммов продуцентов, так и других культур лактобацилл. Результаты исследования различных штаммов лактобацилл показали, что антагонистическая активность каждого штамма лактобацилл является индивидуальным физиологическим свойством, а степень выраженности этой активности зависит от условий культивирования (состав среды, время культивирования, индивидуальные физиологические свойства тест штаммов и т.д.). Предстоит провести дальнейшую химическую идентификацию экзометаболитов различной молекулярной массы (сигнальных молекул), регулирующих quorum sensing [13] лактобацилл различной таксономической принадлежности и происхождения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вахитов Т.Я. Изучение действия препарата аутостимуляторов роста Escherichia coli М-17 (препарат «Актофлор») на рост чистых и смешанных культур бактерий / Т.Я. Вахитов, О.Ю. Яшина, Л.Н. Петров, А.М. Королюк // Журн. микробиол.
- 2000. - № 3. - С. 20-24.
2. Вахитов Т.Я. Состав и биологическая активность экзометаболитов Escherichia coli М-17 / Т.Я. Вахитов, Е.Н. Момот, О.Н. Шалаева, Л.Н. Петров // Журн. микробиол. - 2003. - №6. - С. 20-25.
3. Глушанова Н.А. Взаимоотношения пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro /
Н.А. Глушанова, Б.А. Шендеров // Журн. микробиол. - 2005. - №2. - С. 56-61.
4. Глушанова Н.А. Влияние пробиотиков на индигенную микрофлору здорового организма / Н.А. Глушанова // Сибирский медицинский журнал. - 2004. - Т. 19, № 3. - С. 65-71.
5. Глушанова Н.А. О биосовместимости пробиотиков с индигенной микрофлорой хозяина / Н.А. Глушанова // «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы»: Сб. матер. междунар. конф. - М., 2004. -С. 23-24.
6. Глушанова Н.А. О причинах недостаточной эффективности пробиотикотерапии / Н.А. Глушанова // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2004. - № 1, Т. 3.
- С. 17-24.
7. Глушанова Н.А. Об эффективности коррекции дефицитного дисбактериоза кишечника гомо-и гетеропробиотиками / Н.А. Глушанова // Сибирский медицинский журнал. - 2004. - Т. 19, № 3. - С. 75-81.
8. Глушанова Н.А. Экспериментальное изучение колонизации кишечника гомопробиотиками / Н.А. Глушанова // Сибирский медицинский журнал. - 2004. - № 1. - С. 48-51.
9. Зорина В.В. Влияние бактерий рода Lactobacillus на продукцию цитокинов клетками пейе-ровых бляшек экспериментальных животных / В.В. Зорина, Т.Н. Николаева, А.Н. Наровлянский / / Иммунология. - 2004. - № 5. - С. 288-290.
10. Зорина В.В. Модуляция клеток иммунной системы лактобактериями / В.В. Зорина, Т.Н. Николаева, В.М. Бондаренко // Журн. микробиол. -2004. - №6. - С. 57-60.
11. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 1: Микрофлора человека и животных и ее функции / Б.А. Шендеров. - М.: ГРАНТЪ, 1998. - 288 с.
12. Jack R.W. Bacteriocins of gram-positive bacteria / R.W. Jack, J.R. Tagg, B. Ray // Microbiol. Rev. - 1995. - Vol. 59. - P. 171 -200.
13. Lenoir-Wijnkoop I. The Intestinal microflora. Understanding the symbiosis / I. Lenoir-Wijnkoop, M. Hopkins // Danone Vitapole. Nutrition and Health Collection. John Libbey Eurotext. - 2003. - 48 p.
14. Mikelsaar M. Lactic acid microflora in the human microbial ecosystem and its development / M. Mikelsaar, R. Mander, E. Sepp // In: Lactic Acid Bacteria. Microbiology and Functional Aspects (eds. S. Salminen, A. von Wright). - Markel Dekker, Inc. New York-Basel, Hong-Kong 2nd edition, 1998. -P. 279-342.
15. Tomas M.S.J. Comparison of the growth and hydrogen peroxide production by vaginal probiotic lactobacilli under different culture conditions / M.S.J. Tomas, E. Bru, M.E. Nader-Macias // Am. J. Obstet. Gynecol. - 2003. -Vol. 188. - P. 35-44.
