CC BY
18
УДК: 616.37-002.1:575.174.015.3
ИССЛЕДОВАНИЕ АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ EPHX1 И CYP1A1 С РАЗВИТИЕМ ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА У РУССКИХ
Самгина Т. А., Бушуева О. Ю., Назаренко П. М., Полоников А. В.
ФГБОУ ВО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России
THE INVESTIGATION OF ASSOCIATION POLYMORPHISMS OF XENOBIOTICS BIOTRANSFORMATION ENZYMES GENES EPHX1 AND CYP1A1 TO THE DEVELOPMENT OF ACUTE PANCREATITIS IN RUSSIANS
Samgina T. A., Bushueva O. Y., Nazarenko P. M., Polonikov A. V.
Federal public budgetary educational institution of higher education "Kursk State Medical University" of the Ministry of Healthcare of the Russia
Самгина
Татьяна Александровна
Samgina Tatyana A. [email protected]
Самгина Т. А. — доцент кафедры хирургических болезней № 2 Бушуева О. Ю. — доцент кафедры биологии и медицинской генетики Назаренко П. М. — профессор, заведующий кафедрой хирургических болезней № 2 Полоников А. В. — профессор кафедры биологии и медицинской генетики Samgina T. A. — ass. Professor of the department of surgical diseases № 2 Bushueva O. Y. — ass. Professor of the department of biology and medical genetics Nazarenko P. M. — Professor, Head of the department of surgical diseases № 2 Polonikov A. V. — Professor of the department of biology and medical genetics
Резюме
Цель — исследование влияния полиморфизмов H139R и I462V генов EPHX1 и CYP1A1 на развитие острого панкреатита (ОП) в русской популяции. Образцы цельной крови были собраны у 299 больных острым панкреатитом и 238 здоровых. Генотипирование полиморфизмов (rs2234922) гена EPHX1 и (rs1048943) гена CYP1A1 выполнено с помощью метода ПЦР с дискриминацией аллелей с помощью TaqMan-зондов. Было обнаружено, что аллель 139H (OR=1.34 95 % CI 1.03-1.75) ассоциирован с пониженным риском развития острого панкреатита, ассоциации полиморфизма I462V с развитием острого панкреатита не обнаружено, проведенный стратифицированный анализ влияния курения и генотипов полиморфизмов H139R и I462V генов EPHX1 и CYP1A1 на развитие острого панкреатита также не обнаружил различий в группах больных и здоровых.
Ключевые слова: острый панкреатит, генетический полиморфизм, ферменты биотрансформации ксенобиотиков Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2017; 147 (11): 34-37
Summary
The aim of this study was to investigate the relationship between polymorphisms H139R and I462V of genes EPHX1 and CYP1A1 in the development of acute pancreatitis (AP) in the Russian population. Whole blood samples were collected from 299 patients with acute pancreatitis and 238 healthy controls. Genotyping of the SNPs (rs2234922) EPHX1 gene and (rs1048943) CYP1A1 gene accomplished using PCR with allele discrimination using TaqMan-probes. It has been found that the allele 139H (OR = 1.34 95 % CI 1.03-1.75) associated with a reduced risk of acute pancreatitis. I462V polymorphism association with development of acute pancreatitis detected. Conducted stratified analysis of smoking and genotypes of polymorphisms H139R and I462V genes EPHX1 and CYP1A1 in the development of acute pancreatitis also found no differences in the groups of patients and healthy controls.
Key words: acute pancreatitis, genetic polymorphism, xenobiotics biotransformation enzymes Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2017; 147 (11): 34-37
Введение
Согласно современным представлениям об этио-патогенезе острый панкреатит (ОП) представляет собой мультифакториальное заболевание, развитие которого определяется сложным взаимодействием множества генов и различных факторов внешней среды [1,2,3]. Вопросы, касающиеся генетических механизмов ОП и его осложнений, изучены пока не достаточно [1,2,3].
Известно, что восприимчивость организма к вредным воздействиям окружающей среды в значительной мере зависит от активности ферментов системы детоксикации ксенобиотиков. При наличии функционально ослабленных вариантов таких генов риск возникновения некоторых частых муль-тифакториальных заболеваний увеличивается [4,5].
В процесс биотрансформации, включающий ферментативное превращение чужеродных включений, или ксенобиотиков, и состоящий из трех фаз: активации, собственно детоксикации и выведения, вовлечено множество ферментов [6,7]. Так, цитохромы Р-450 осуществляют биоактивацию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Установлено, что CYP1A1 не обнаруживается в нормальной ткани, а экспрессируется лишь под действием ксенобиотиков. Не менее важным ферментом биотрансформации ксенобиотиков (ФБК) является микросомальная эпоксидгидролаза (ЕРНХ1), осуществляющая гидролиз разнообразных токсинов внешней среды: эпоксидов, арено-вых и алкеновых оксидов, образующихся в ходе их метаболической активации моноксигеназной
системой цитохромов Р-450 [8]. Главными субстратами для ЕРНХ1 являются эпоксидные производные ПАУ (бен-зо[а]пирен 4,5-оксид) и 1,3-бутади-ена, бензин, афлотоксин В 1, кризен, нитропирен, нафталиниантрацен [9, 10].
Исследования последних лет отводят важную роль влиянию химических токсинов из окружающей среды на развитие панкреатита. Так, выявлена ассоциация острого небилиарного панкреатита с курением [11], а у курящих и употребляющих алкогольные напитки пациентов с ОП отмечается повышенный риск развития панкреонекроза [12].
Гены, ответственные за процессы детоксикации, являются важным звеном в патогенезе острого панкреатита. Однако изучению связи генов ФБК с риском развития панкреатита посвящено небольшое количество исследований в мире, и данные их противоречивы. Проведенные исследования по изучению связи полиморфизма Y 113Н гена ЕРНХ1 среди европейцев не обнаружили его связи с заболеваниями поджелудочной железы, в том числе, алкогольного панкреатита [13]. Роль генов ФБК ^ТМ1, GSTT1, GSTP1, CYP2E 1 и CYP1A1) в развитии алкогольного панкреатита и цирроза печени изучалась среди употребляющих алкогольные напитки бразильцев, ассоциации с панкреатитом не установлено [14].
Цель исследования. В рамках настоящей работы впервые было проведено исследование влияния полиморфизмов H139R и 1462У генов ЕРНХ1 и СУР1Л1 на развитие острого панкреатита.
Материал и методы исследования
Материалом для исследования послужили 537 об- и разцов ДНК, включающих 299 больных ОП и 238 i здоровых индивидов русской национальности. Все i пациенты были этнически русские, проживаю- i щие на территории Центральной России (Курской т области) и неродственные друг другу. Больные с ОП (82 женщины и 217 мужчин) находились на с стационарном лечении в хирургических отделе- ! ниях города Курска в период с 2012 по 2015 год. j Средний возраст больных составил 48,9+13,1, здоровых лиц - 47,8+12,1. Диагноз ОП устанавливался н с использованием современной классификации ч острого панкреатита, разработанной Российским с обществом хирургов в 2014 г. с учетом классифи- э кации Атланта-92 и ее модификаций, предложен- ( ных в г. Кочин в 2011 г. Международной ассоциа- i цией панкреатологов (International Association of в Pancreatology) и Международной рабочей группой T по классификации острого панкреатита (Acute I Pancreatitis Classification Working Group) в 2012 г., о с использованием общеклинических, лабора- в торных (общий и биохимический анализ крови) в и инструментальных (УЗИ и МРТ поджелудочной с железы, ЭФГДС) методов исследования. По сте- j пени тяжести больные распределены следующим о образом: легкая - 27.9 %, средняя -39 %, тяжелая - j 33,1 %. Контрольная группа формировалась в ходе и профилактических осмотров на предприятиях (
и государственных учреждениях, а также в стационарах ЛПУ г. Курска. В контрольную группу включали пациентов (80 женщин и 158 мужчин), не имеющих заболеваний желудочно-кишечного тракта и стойкой хронической патологии других органов и систем. Исследование одобрено этическим комитетом КГМУ, все пациенты подписали информированное согласие на проведение исследований.
У всех обследуемых проводился забор венозной крови для проведения молекулярно-генети-ческих исследований. Геномную ДНК выделяли стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Генотипирование полиморфизмов (rs2234922) гена EPHX1 и (rs1048943j гена CYP1A1 проводилось методом ПЦР в режиме реального времени путем дискриминации аллелей с помощью TaqMan-зондов на амплификаторе CFX96Bio-Rad Laboratories (США) с использованием протоколов, опубликованных в литературе [15]. С целью проверки качества генотипирования 10 % проб было выбрано случайным образом «случай-контроль» с целью повторного генотипирования, полученные результаты не отличались от первоначальных. Для оценки ассоциаций аллелей и генотипов изучаемых полиморфизмов генов с риском развития ОП использовали критерий с2 и отношение шансов (OR) с 95 %-ми доверительными интервалами (CI).
Статистический анализ осуществлялся с использованием программы Statistica 6.0 ("StatSoft", США). Уровень статистической значимости принимали
при p<0,05. Статистический анализ осуществлялся с использованием программы Statistica 6.0 ("StatSoft", США).
Результаты исследования
Частоты аллелей и генотипов полиморфизмов 139Ж гена EPHX1 (^2234922), 1462У гена CYP1A1 (ге1048943) представлены в таблице 1. Генотипы исследуемых полиморфизмов находились в соответствии с распределением Харди-Вайнберга (р>0,05).
Как видно из таблицы 1, аллель 139Н (ОЯ=1.34 95 % С1 1.03-1.75) ассоциирован с пониженным риском развития острого панкреатита.
Проведенный стратифицированный анализ влияния курения и генотипов полиморфизмов H139R гена ЕРНХ1 и 1462У гена CYP1А1 на развитие острого панкреатита показал, что среди больных острым панкреатитом курение не является значимым фактором риска (таблица 2).
Обсуждение полученных результатов
Изучение полиморфизмов генов ферментов деток-сикации ксенобиотиков - одно из активно разрабатываемых направлений исследований в раскрытии патогенетических звеньев инициации и течения заболеваний легких, молочной железы, рака яичников и органов желудочно-кишечного тракта в различных популяциях [16,17,18].
Эпоксидгидролаза играет важную роль в процессе активации и детоксикации канцерогенов, продуктов тобакокурения, присоединяя воду к эпоксидам бензола, бензпирена и другим полициклическим углеводородам, образованным в ходе первой фазы обезвреживания, превращает их в ди-олы. Генетический полиморфизм может приводить к синтезу ферментов с измененной активностью, что в свою очередь, может быть причиной изменения скорости биотрансформации. Проведенные исследования по изучению связи полиморфизма Y 113Н гена ЕРНХ1 среди европейцев не обнаружили его связи с заболеваниями поджелудочной железы, в том числе, алкогольного панкреатита [13].
Трансформация имеющихся знаний о полиморфизмах гена ЕРНХ1 в клиническое применение ограничивается отсутствием кристаллической структуры фермента и соотношений между его генотипом и фенотипическими проявлениями. Так, аллельный вариант 139R может быть связан с повышенной активностью ЕРНХ1 в отношении метаболической активации (высокотоксичных и реактивных ареновых и алифатических эпок-сидов) некоторых липофильных ксенобиотиков [19,20], тогда как недавние исследования показали, что указанный аллель ассоциирован с пониженной активностью фермента в метаболизме эпоксидов ПАУ в их дигидродиольные производные [21].
В тоже время, при эпоксидировании бенз[а] пирен-4,5-оксида формирование диола может
привести к стабилизации вторичного эпоксида и существенному увеличению его токсических свойств [10].
В рамках настоящего исследования впервые обнаружена взаимосвязь полиморфизма Н139Я (^2234922) гена ЕРНХ1с развитием острого панкреатита, за счет снижения частоты встречаемости аллеля Н гена ЕРНХ1 среди больных.
Полиморфизм Н139Я гена ЕРНХ1 можно рассматривать в качестве нового генетического маркера предрасположенности к острому панкреатиту в русской популяции. Однако следует продолжить дальнейшие исследования по оценке вовлеченности полиморфизмов гена ЕРНХ1 в развитие острого панкреатита в других популяциях мира. В перспективе с практической точки зрения данные генетического тестирования полиморфизма Н139Я (^2234922) гена ЕРНХ1 можно будет использовать для формирования среди населения, а также членов семей, отягощенных развитием панкреатита, группы риска развития болезни и проведения необходимых профилактических мероприятий по ее предупреждению.
Ген CYP1A1 кодирует ключевой фермент, в 1 фазе биотрансформации ксенобиотиков превращающий полициклические ароматические углеводороды в высокоактивные мутагенные метаболиты. Известно 19 вариантов полиморфизмов гена, которые играют определенную роль в развитии онкологических и профессиональных заболеваний [21].
В представленной работе впервые изучен вклад полиморфизма 1462У гена CYP1A1 в развитие острого панкреатита, ассоциации полиморфизма 1462У с развитием острого панкреатита не обнаружено, проведенный стратифицированный анализ влияния курения и генотипов полиморфизма 1462У гена CYP1А1 на развитие острого панкреатита также не обнаружил различий в группах больных и здоровых.
Литература
1. LaRusch J, Whitcomb DC. Genetics of pancreatitis// Curr. Opin. Gastroenterol. - 2011.-№ 27. - P. 467-474.
2. Curley P. J., McMahon M.J., Lancaster F. et al. Reduction in circulating levels of CD 4 positive lymphocytes in acute pancreatitis: relationship to endotoxin, interleukin-6 and disease severity// Br.J. Surg. 1993,80.-P.1312-1315.
3. Yin YW, Sun QQ, Feng JQ, Hu AM, Liu HL, Wang Q. Influence of interleukin gene polymorphisms on development of acute pancreatitis: asystematic review and metaanalysis //Mol. Biol. Rep. - 2013 Oct;40(10).-P.5931-5941.
4. Thornton-Wells, T.A. Genetics, statistics, and human disease: Analytical retooling for complexity/
462I
Генотипы/ Больные ОП (n =299) Здоровые лица (n=238) OR (95 %CI)
аллели n % n % c2 (p)
139HH 131 43.8 124 52.1 3.65(0.06) 1.39(0.99-1.96)
139HR 137 45.8 99 41.6 0.96(0.33) 1.19(0.84-1.67)
139RR 31 10.4 15 6.3 2.8(0.09) 1.72(0.91-3.27)
139H 0.667 0.729 1.34(1.03-1.75)
139R 0.333 0.271
462II 268 89.6 215 90.3 0.07(0.79) 1.08(0.61-1.9)
462IV 27 9.0 23 9.7 0.06(0.8) 0.93(0.52-1.66)
462VV 4 1.3 0 0 3.21(0.07) 7.26(0.39-135.6)
0.941
0.952
462V
0.059
0.048
0.54(0.46)
1.22(0.71-2.1)
Таблица 1.
Частоты аллелей и генотипов полиморфизмов 139ИЯ гена ЕРНХ1, 4621У гена CYP1A1 в группах больных острым панкреатитом и здоровых лиц
Генотипы
фактор риска
Больные ОП
Здоровые лица
OR(95 % CI) Р
462VV CYP1A1
без фактора риска
4(3.6)
с фактором риска
без фактора риска
с фактором риска
без фактора риска
с фактором риска
Курение
139RR ЕРНХ1 10(9.3) 21(10.9) 10(8.1) 5(4.3) n=231 n=307
139HH+ 139HR ЕРНХ1 97(90.7) 171(89.1) 114(91.9) 110(95.7) 1.61(0.76-3.42) 0.29 2.7(0.99-7.38) 0.04
462II CYP1A1 103(92.8) 165(85.9) 113(91.9) 102(88.7) 1.28(0.63-2.60)0.49 0.88(0.33-2.31)0.79
462IV CYP1A1 4(3.6) 23(12.0) 10(8.1) 13(11.3) 1.07(0.52-2.20)0.86 0.42(0.13-1.39)0.14
4(2.1)
0(0)
0(0)
5.51(0.29-103.3)0.12
10.34(0.55-194.2) 0.03
Таблица 2.
Анализ влияния курения, генотипов полиморфизмов И139И гена ЕРНХ1 и 1462У гена CYP1А1 на развитие острого панкреатита
T. A. Thornton-Wells, J.H. Moore., J.L. Haines // Trends Genet. - 2004. - Vol.20. -P.640-647;
5. Rosendaal, F.R. Forum on genetic studies in complex disease / F.R. Rosendaal, P.H. Reitsma// J. Thromb. Hae-most. - 2004. - Vol.2. - P. 342.
6. Баранов В. С. Геном человека и гены предрасполо-жености. Введение в предиктивную медицину /
B.С. Баранов, Е.В. Баранова, Т.Е. Иващенко // СПб.: Интермедика, 2000. - 272 с.
7. Полиморфизм в генах человека, ассоциирующихся с биотрансформацией ксенобиотиков / А.В. Спи-цын [и др.] // Вестн.ВОГиС. - 2006. - Том 10, № 1. -
C. 97-105.
8. Omiecinski C. J., Aicher L., Swenson L. Developmental expression of human microsomal epoxide hydrolase // J. Pharmacol. Exp. Ther. -1994. - Vol. 269. - P. 417-423.
9. Fretland A. J., Omiecinski C. J. Epoxide hydrolases: biochemistry and molecular biology // ^em^iol. Interact. - 2000. - Vol. 129. - P. 41-59.
10. Morisseau C, Hammock B. D. Epoxide hydrolases: mechanisms, inhibitor designs, and biological roles // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. -2005. - Vol. 45. - P. 311-333.
11. Setiawan VW1, Pandol SJ, Porcel J, Wilkens LR, Le Marchand L, Pike MC, Monroe KR. Prospective Study of Alcohol Drinking, Smoking, and Pancreatitis: The Multiethnic Cohort. Pancreas. 2016.-45(6).-Р.819-825.
12. Ahmed Ali U, Issa Y, Hagenaars JC. Risk of Recurrent Pancreatitis and Progression to Chronic Pancreatitis After a First Episode of Acute Pancreatitis. Clin Gastroenterol Hepatol. 2016.-14(5).-Р.738-746.
13. Ockenga J, Strunck S, Post C, Schulz H U, Halangk J, Pfützer R H, Löhr M, Oettle H, Kage A, Rosendahl J, KeimV, Drenth J P, Jansen J B, Lochs H, Witt H. The role of epoxide hydrolase Y 113H gene variant in pancreatic diseases.-Pancreas. 2009.-38(4).-Р.97-101.
14. Burim RV, Canalle R, Martinelli Ade L, Takahashi CS. Polymorphisms in glutathione S-transferases GSTM1, GSTT1 and GSTP1 and cytochromes P450 CYP2E 1 andCYP1A1 and susceptibility to cirrhosis or pancreatitis in alcoholics./ Mutagenesis. 2004.-19(4).-P.291-298.
15. Koressar T, Remm M. Enhancements and modifications of primer design program Primer3// Bioinformat-ics.-2007.-23.-P.1289-1291.
16. XiangLi, ZhengHu, Xinshun Qu, JiadongZhu, Lin Li, Brian Z. Ring, and Li Su. Putative EPHX1 Enzyme Activity Is Related with Risk of Lung and Upper Aerodigestive Tract Cancers: A Comprehensive Meta-Analysis.-Journal List.-2011.-v.6 (3).-P.147-149.
17. Jourenkova-Mironova N, Mitrunen K, Bouchardy C, Day-er P, Benhamou S, Hirvonen A (2000). "High-activity microsomal epoxide hydrolase genotypes and the risk of oral, pharynx, and larynx cancers". Cancer Res. 60 (3).-P. 534-536.
18. Sarmanova J, Susova S, Gut I, Mrhalova M, Kodet R, Adamek J, Roth Z, Soucek P (2004). "Breast cancer: role of polymorphisms in biotransformation enzymes". Eur. J. Hum. Genet. 12 (10).-P.848-854.
19. Hassett C., AicherL., Sidhu J. S., Omiecinski C. J. Human microsomal epoxide hydrolase: genetic polymorphism and functional expression in vitro of amino acid variants // Hum. Mol. Genet. -1994. - Vol. 3. - P. 421-428.
20. Hassett C., Lin J., Carty C. L. et al. Human hepatic microsomal epoxide hydrolase: comparative analysis of polymorphic expression // Arch. Biochem.Biophys. -1997. - Vol. 337. - P. 275-283.
21. Hosagrahara V. P., Rettie A. E., Hassett C., Omiecinski C. J. Functional analysis of human microsomal epoxide hydrolase genetic variants //Chem. Biol. Interact. - 2004. -Vol. 150. - P. 149-159.
