CC BY
67
УДК 615.241.3
А.А. Торопова, Д.Н. Оленников, Л.М. Танхаева, А.Г. Мондодоев, С.М. Николаев
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ СРЕДСТВА «НЕФРОФИТ» И ЕГО КОМПОНЕНТОВ В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ IN VITRO
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ
Установлено, что комплексное растительное средство «Нефрофит» и входящие в его состав компоненты обладают выраженными антиоксидантными свойствами, проявляя тенденцию к инактивации, активных форм, кислорода и. других инициаторов перекисного окисления липидов. Ключевые слова: Нефрофит, растительное средство, антиоксидантная активность, свободные радикалы
INVESTIGATION OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF «NEPHROPHIT» REMEDY AND ITS COMPONENTS IN IN VITRO MODELS
A.A. Toropova, D.N. Olennikov, L.M. Tankhaeva, A.G. Mondodoev, S.M. Nikolaev
Institute of General and Experimental Biology SB RAS, Ulan-Ude
It is established, that complex phytoremedy «Nephroph.it» and its components have expressed, antioxidant activity caused by abilities to inactivate reaction of oxygen forms and other initiators of lipid peroxidation.
Key words: Nephrophit, phytoremedy, antioxidant activity, free radicals
Большинство патологических процессов сопровождается дисбалансом окислительновосстановительных систем организма, что приводит к повышению уровня свободных радикалов в клетках. В этой связи поиск эффективных антиоксидантов, воздействующих на различные стадии окислительных процессов является одной из актуальных проблем медицины [1, 8]. Исследования последних лет показали, что природные соединения могут воздействовать на различные системы организма, в том числе на систему антиоксидантной защиты [3, 13].
В Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН разработано комплексное растительное средство «Нефрофит», представляющий собой сухой экстракт, состоящий из экстрактов трех видов растительного сырья: листьев толокнянки обыкновенной (Arctostaphylos uva ursi L.), листьев ортосифона тычиночного (Orthosiphon stamineus Benth.) и травы горца птичьего (Polygonum aviculare L.). Ранее проведенные экспериментальные исследования выявили у «Нефрофита» наличие антибактериальной, противовоспалительной, ранозаживляющей, диуретической, желчегонной и мембраностабилизирующей видов активности [2, 7, 11]; также установлено, что «Нефрофит» снижает активность каспазы-3 [6]. Некоторые из перечисленных эффектов сопровождаются снижением уровня продуктов перекисного окисления липидов и нормализацией показателей эндогенной антиоксидантной системы, что в свою очередь предполагает наличие у данного растительного средства антиоксидантного эффекта.
Целью работы является исследование антиоксидантной активности «Нефрофита» и его компонентов в условиях in vitro.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектами исследования являлось растительное средство «Нефрофит» (ВИЛАР, серия 040604),
а также сухие экстракты листьев A. uva ursi, листьев O. stamineus и P. aviculare, полученные по технологии, аналогичной «Нефрофиту». В качестве веществ сравнения использовали аскорбиновую кислоту, ионол (Fluka), таннин (Fluka).
Общую антиоксидантную емкость определяли молибдатным методом [14], антирадикальную активность — с применением дифенилпикрилги-дразил (ДФПГ) радикала [15]. Антиоксидантную активность «Нефрофита» и его компонентов in vitro проводили на модели Fe2+-индуцированного окисления плазмы крови [5], а также на модели Фентон-индуцированного окисления лецитина[4] с последующей регистрацией ТБК-активных продуктов. Дополнительно определяли влияние исследуемых средств на ряд активных форм кислорода (АФК): супероксидный анион-радикала (О2-) — в неэнзиматической системе феназин метосульфат / НАДФ [12]; пероксида водорода (H2O2) — окислительная деструкция фенолового красного [12]. Железо-хелатирующую активность определяли фенантро-линовым методом [10]. Способность фитосредств связывать молекулы оксида азота (NO) устанавливали по методу [14]. Повторность определения проводимых экспериментов трехкратная. При обработке результатов количественных анализов использовали методы математической статистики [9]. Регрессионный анализ выполняли с применением пакета программ Advanced Grapher ver. 2.07 (Alentum Software Jnc.).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В модельных системах in vitro, где происходила генерация свободных радикалов, комплексное средство «Нефрофит» и его компоненты проявляли в той или иной степени антиоксидантные свойства.
В эксперименте показано, что общая антиоксидантная емкость исследуемого фитосредства
составляет 384,1 мг кверцетина/г. Аналогичный показатель для препарата сравнения — ионола 313,2 мг/г. Таким образом, антиоксидантная емкость исследуемого комплексного фитосредства сопоставима с таковой препарата сравнения.
Для определения антирадикальной активности использовался наиболее широко применяемый ДФПГ-метод. Установлено, что исследуемое фитосредство, обладает умеренной активностью в отношении связывания ДФПГ-радикала, так величина 50 % связывания радикала (1С50) составляет 39,07 мкг/мл. Для препарата сравнения — аскорбиновой кислоты данный показатель составляет 4,81 мкг/мл.
На модели Бе2+-индуцированного окисления плазмы крови с последующей регистрацией ТБК-активных продуктов установлено, что «Нефрофит» проявляет умеренное антиоксидантное действие (1С50 = 24,7 мкг/мл), в то время как для препарата сравнения — аскорбиновой кислоты — данный показатель составляет 0,153 мкг/мл. Антиоксидантная активность исследуемых средств возрастает в ряду: Л. uva ц.^і > «Нефрофит» > P. aviculare >
O. stamineus При изучении способности испытуемых средств тормозить накопление ТБК-активных продуктов в суспензии желточных липопротеидов, выявлено, что величина антиоксидантной активности «Нефрофита» составляет 16,86 (г/л)-1, что соответствует умеренному антиоксидантному действию. Для исследуемых фитосредств данный показатель увеличивается в ряду:
Л. та и^і > «Нефрофит» > О. stamineus >
Р. aviculare
Известно, что существует шесть наиболее вредных кислородных реакционноспособных частиц: пероксидные ^ОО) и гидроксильный (ОН) радикалы, супероксид-анион (О2 -), синглентный кислород (1О2), перекись водорода Н2О2 и пероксинитрит (OONO). В эксперименте показано, что величина 50% связывания супероксид анион-радикала для исследуемого средства составляет 1,44 мкг/мл, а для препарата сравнения - аскорбиновой кислоты 1С50 = 0,081 мкг/мл. Таким образом, испытуемое фитосредство обладает умеренной активностью в отношении супероксид анион-радикала кислорода. Связывание О2- происходит за счет флавоноидов, входящих в состав Р. aviculare (1С50 = 12,71 мкг/мл) и О. stamineus (1С50 = 18,71 мкг/мл).
В экспериментах по определению способности фитосредства инактивировать Н2О2 установлено наличие активности в отношении указанной реакционноспособной частицы (1С50 = 1,60 мг/мл); аналогичный показатель для ионола и таннина составляет 0,46 мг/мл и 0,75 мг/мл соответственно. Установлено, что способность к инактивации молекул Н2О2 возрастает в ряду:
О. stamineus > «Нефрофит» > Р. aviculare >
Л. та ursi
При исследовании Бе2 + -хелатирующей активности исследуемого средства «Нефрофита»,
установлено, что величина его 50% ингибирования Fe2+ составляет 1,50 мг/мл (IC50 = 1,50 мг/мл), для препарата сравнения - ионола (IC50 = 0,15 мг/мл). Показано, что Fe2+-хелатирующая активность исследуемых средств возрастает в ряду:
«Нефрофит» > O. stamineus > A. uva ursi >
P. aviculare
Также, в условиях in vitro, показано, что комплексное средство «Нефрофит» до концентрации 1,50 мг/ мл обладает более высокой связывающей способностью по отношению к NO (IC50 = 0,97 мг/мл), чем аскорбиновая кислота (IC50 = 1,14 мг/мл). Данное свойство фитосредства обусловлено наличием в его составе O. stamineus (IC50 = 0,608 мг/мл) и A. uva ursi (IC50 = 0,863 мг/мл). При дальнейшем увеличении концентрации активность аскорбиновой кислоты резко возрастает. В концентрации 3,0 мг/мл активность исследуемого средства «Нефрофит» составляет 70,44 % от активности аскорбиновой кислоты той же концентрации.
Представлены результаты исследования анти-оксидантных свойств комплексного растительного средства «Нефрофит» и его компонентов. Установлено, что «Нефрофит» обладает выраженной антиоксидантной активностью, обусловленной антирадикальным действием соединений фенольной природы, входящих в его состав. Установлено, что исследуемое средство проявляет тенденцию к инактивации активных форм кислорода и других инициаторов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Таким образом, испытуемое фитосредство имеет несколько механизмов действия и способно ингибировать процессы свободно-радикального окисления на разных стадиях протекания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Антиоксиданты как нейропротекторы при ишемическом инсульте / О.В. Поварова и др. // Эксп. клин. фармакол. - 2003. - Т. 66, № 3. -С. 69-73.
2. Влияние нефрофита на показатели клеточного и гуморального звеньев иммунитета / Е.А. Аб-галдаева, А.Г. Мондодоев, В.Б. Хобракова, Т.А. Ажу-нова // Сб. научных трудов ВСГТУ. Серия: Химия и биологически активные вещества. - Улан-Удэ, 2004. - Вып. 8. - С. 74-78.
3. Исследование антиоксидантных свойств изофлавона - генистеин-8-С-гликозида in vitro и in vivo / Л.Б. Заводник и др. // Эксп. клин. фарма-кол. - 2006. - Т. 69, № 11. - С. 48-52.
4. Ингибирование антиокислительной активности плазмы крови азидом натрия / Г.И. Клебанов и др. // Биофизика. - 1988 - Т. 33, № 3. -С. 512-516.
5. Кузьменко Д.И. Оценка резерва липидов сыворотки крови для перекисного окисления в динамике окислительного стресса у крыс / Д.И. Кузьменко, Б.И. Лаптев // Вопр. мед. химии. - 1999. -Т. 45, № 1. - С. 85-89.
6. Лемза С.В. Влияние растительных средств «Нефрофита» и «Г епатона» на процессы апоптоза у
белых крыс / С.В. Лемза, А.Г. Мондодоев, С.М. Николаев // Вестник БГУ. - 2008. - Вып. 12. -С. 26-28.
7. Маркарян А.А. Хроматографическое изучение фенольного состава сухого экстракта «Не-фрофит» / А.А. Маркарян, А.А. Абрамов // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. - 2003. - Т. 44. -№ 5. - С. 356-360.
8. Никифорова Н.В. Антиоксиданты в злокачественных опухолях человека и экспериментальных животных / Н.В. Никифорова, А.Е. Берман // Био-мед. химия. - 2003. - Т. 49, № 3. - С. 250-262.
9. Статистика в медицине и биологии: Руководство в 2-х томах / В.А. Медик [и др.]. - М.: Медицина, 2000. - 412 с.
10. Химический состав сока каллизии душистой (Callisia fragrans Wood) и его антиоксидантная активность (in vitro) / Д.Н. Оленников и др. // Химия растит. сырья. - 2008. - № 4. - С. 95-100.
11. Экспериментальная фитотерапия повреждений почек / С.М. Николаев и др. — Улан-Удэ: Изд-во БНЦ СО РАН, 2003. - 186 с.
12. Antioxidant activities of chitibiose and chititriose / A.-S. Chen, T. Taguchi, K. Sakai et al. // Biol. Pharm. Bull. - 2003. - Vol. 26, N 9. -P. 1326-1330.
13. Chen J.H. Antioxidant activities of caffeic acid and its related hydroxycinnamic acids compounds / J.H. Chen, C.T. Ho // J. Agric. Food Chem. -1997. - Vol. 45. - P. 2374-2378.
14. Govindarajan R. Studies on the Antioxidant Activities of Desmodium gagenticum / R. Govindarajan,
S. Rastogi, M. Vijayakumar // Biol. Pharm. Bull. -2003. - Vol. 26, N 10. - P. 1424-1427.
15. Seyoum A. Structure-radical scavenging relationships of flavonoids / A. Seyoum, K. Asres, F.K. El-Fiky // Phytochemistry. - 2006. - Vol. 67. -P. 2058-2070.
Сведения об авторах
Оленников Даниил Николаевич - к.фарм.н., старший научный сотрудник лаборатории медико-биологических исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН.
Торопова Анюта Алексеевна - к.б.н., младший научный сотрудник лаборатории безопасности биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН.
Танхаева Лариса Максимовна - к.фарм.н., старший научный сотрудник лаборатории медико-биологических исследований Института общей и экспериментальной биологии СО РАН.
Мондодоев Александр Гаврилович - д.мед.н., старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной фармакологии (ЛЭФ) Института общей и экспериментальной биологии СО РАН.
Николаев Сергей Матвеевич - д.мед.н., профессор, руководитель ЛЭФ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, г. Удэ-Удэ, ул. Сахьяновой, 6.
