CC BY
65
7. Ulyanov S. Principles of high-resolution speckle microscopy: analysis of bioflows // Proc SPIE. 2002. Vol.4607. Р.374-380.
8. Ульянова О.В., Ганилова Ю.А., Ульянов С.С. Использование спекл-микроскопии при тестировании токсичности бактериальных препаратов // Вестн. Сарат. гос. аграрного ун-та. 2007. №2. С.18-20.
9. Инфекционные болезни и эпидемиология: Учебник /
В.И. Покровский, С.Г. Пак, Н.И. Брико, Б.К. Данилкин. 2-е изд. М.: ЭОТАР-МЕД, 2004. 816 с.
10. Волкова М.В. Разработка экспериментальной живой вакцины для профилактики колибактериоза свиней: Авто-реф. дис. ... канд. биол. наук. Саратов, 2006.
11. Мельников Н.И., Мельников В.Н., Гимранов М.Г. Ферменты патогенности и токсины бактерий. М.: Медицина, 1969. 252 с.
1 2 . Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Основы общей патологии: Учеб. пособие для студентов медвузов. СПб.: ЭЛБИ, 1999.
Ч. 1. Основы общей патофизиологии. 624 с.
УДК 579.835:57.083.334
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ ПОЧВЕННЫХ РОСТ-СТИМУЛИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ РОДА AZOSPIRILLUM
Ю.А. Чернова, Г.Л. Бурыгин*
Саратовский государственный университет, кафедра микробиологии и физиологии растений E-mail: [email protected]
* Лаборатория иммунохимии ИБФРМ РАН
Азоспириллы способны непосредственно или косвенно стимулировать рост растений и повышать урожайность ряда видов растений. Антигенное разнообразие видов рода Azospirillum обусловлено структурными различиями ЛПС О-антигена. Серологический скрининг 38 штаммов азоспирилл позволил выделить три серотипа, включающие восемь серовариантов, по наличию антигенных перекрёстов с модельными штаммами. В отдельную группу были отнесены 7 штаммов, так как взаимодействовали только с родоспецифичными антителами. Установлено сходство антигенных свойств ЛПС штаммов азоспирилл, выделенных с разных видов растений.
Ключевые слова: Azospirillum, О-антиген, антигенные свойства, серотипирование.
A Study of Antigenic Properties of Soil Plant-Growth-Promotion Bacteria Genus Azospirillum
Yu.A. Chernova, G.L. Burygin
Azospirillum can directly or indirectly stimulate growth of plants and improve yield of at least several plant species. Structural distinctions LPS O-antigen determinate antigen variations Azospirillum species. Thirty eight strains of Azospirillum were screening. The fact that most research strains demonstrated cross-reactions with model strains underlie the division into three serotypes, including eight serovariants. Seven strains demonstrated cross-reactions only with genus-specific antibodies and have been separated into individual group. It has been indicated antigen similarity LPS strains of Azospirillum from different plant species.
Key words: Azospirillum, О-antigen, antigen properties, serotypes.
Введение
В последнее время серологические методы широко применяются при изучении взаимоотношений растений и микроорганизмов. В литературе встречается много данных по серологическому исследованию фитопатогенных бактерий и представителей клубеньковых азотфиксаторов рода Rhizobium. Число работ, посвященных исследованию азотфиксирующих бактерий, колонизирующих небобовые растения, в частности бактерий рода Azospirillum, незначительно.
К роду Azospirillum относятся рост-стимулирующие ризобактерии, которые могут способствовать развитию растений как непосредственно (азотфиксация, гормональный эффект, улучшение минерального и водного питания растений), так и опосредованно, путем подавления развития растительных патогенов [1, 2]. В последнее время азоспириллы рассматриваются как перспективный член консорциума ризобактерий для инокуляции в качестве бактериальных удобрений. Важным является то, что штаммы одного вида, отличающиеся по своим антиген-
Ю.А. Чернова, Г.Л. Бурыгин, 2008
Ю.А. Чернова, Г.Л. Бурыгин. Исследование антигенных с войств почвенных
Для иммунохимических экспериментов препараты ЛПС (О-Аг) получали модифицированным методом экстракции ЭДТА-содер-жащим буфером [6].
В работе использовали антитела (Ат) на обработанные 2%-ным раствором глутарово-го альдегида (ГА) клетки модельных штаммов A. brasilense [7]: 8р7 (Ат 1), 8р245 (Ат 2), 1М125А2 (Ат 3); антитела на хроматографически очищенный ЛПС A. brasilense 8-17 (Ат 4) [8] и родоспецифичные Ат, полученные на интактные клетки A. brasilense С<1 (Ат 5). Иммуноглобулины были выделены из гипериммунных кроличьих сывороток по общепринятой методике [7].
Взаимодействие ЛПС азоспирилл с антителами оценивали методом радиальной иммунодиффузии в 1%-ном агарозном геле, с последующей окраской Кумасси Я-250 [9].
Результаты и их обсуждение
В результате проведенных исследований было установлено, что все 38 штаммов бактерий рода Azospirillum взаимодействовали с родоспецифичными Ат 5 (таблица). Это свидетельствует о высокой консервативности белковых антигенов азоспирилл, а также о возможности использования антител на ин-тактные бактериальные клетки для родовой идентификации.
Результаты серотипирования штаммов А Ьгтіїєпвє по структуре О-Аг
Серотип Серовариант Характеристика сероварианта* Штаммы, относящиеся к сероварианту
Ат 1 Ат 2 Ат 3 Ат 4 Ат 5
I А + - - ++ + A. brasilen.se: 8Я 80, 8р 7
В + - - + + A. brasilen.se 8Я 55
С + - - - + A. brasilen.se 8Я 14
II в - ++ - + + А. brasilense: 8Я 75, 8р107, 8р245
Е - + - + + Azospirillum sp 8Я 81 A. brasilen.se 8-27
Б - ++ - - + A. brasilen.se 8Я 15
III О - - + + + А. brasilen.se: Ж125А2, Ж6Б2, 8р 246
н - - + ++ + A. brasilen.se 8Я 32
I - - + - + A. brasilense КЯ 77, 8Я 115
Штаммы, не отнесенные к выделенным сероти-пам д - - - + + А. brasilen.se: 8Я 7, 8Я 37, 8Я 57, 8Я 88, 8Я 92, 8Я 96, 8Я 100, 8Я 103, 8-17 Azospirillum sp.: 8Я 59, 8Я 74, 8Я 120
к - - - ++ + А. brasilense: 8Я 50, 8Я 56, 8Я111, 8Я87; Azospirillum sp.: 8Я 79,
ь - - - - + А. brasilense: 8Я 8, 8Я 64, 8Я 72, 8Я 41, БЯ 14
* Антитела на обработанные ГА клетки: A. brasilense 8р 7 (Ат 1), A. brasilen.se 8р245 (Ат 2), A. brasilense ДМ125Л2 (Ат 3); антитела на хроматографически очищенный ЛПС A. brasilen.se 8-17 (Ат 4), антитела на интактные клетки A. brasilen.se Cd (Ат 5).
ным характеристикам, могут с разной степенью интенсивности взаимодействовать с растением [3, 4].
Антигенное разнообразие бактерий рода Azospirillum обусловлено, в первую очередь, структурными различиями ЛПС О-антигена (О-Аг) их наружной мембраны. О-антигены определяют иммунохимическую специфичность штаммов азоспирилл, что служит основой для их внутривидовой классификации. Построение на основе серологических признаков схемы идентификации рода Azospi-riПum облегчит процесс отбора более эффективных штаммов азоспирилл в образовании ассоциативных связей с растительными партнёрами. Целью данной работы было проведение анализа разнообразия О-Аг штаммов азоспирилл, необходимого в дальнейшем для построения схемы серотипирования данных бактерий.
Материалы и методы исследований
Объектом для исследования явились 38 штаммов бактерий рода Azospirillum из коллекции ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН, 28 из которых были выделены в Саратовской области. Бактерии выращивали при 30оС на жидкой и плотной синтетической малатной среде [5].
Биология
77
Для 14 штаммов выявлены перекрёстные серологические реакции с антителами только к одному из модельных штаммов (Л. brasilense 8р7, A. brasilense 8р245, A. Ьш-silense 1М125Л2), полученными на клетки бактерий, обработанные ГА (Ат 1, Ат 2 или Ат 3). В результате было выделено три серо-типа. Каждый серотип, в свою очередь, можно разделить на сероварианты, во-первых, в зависимости от количества (1 или 2) полос преципитации, которые данные штаммы образовывали с антителами к соответствующему модельному штамму, во-вторых, в зависимости от наличия полос преципитации с антителами к ЛПС A. brasilense 8-17 (Ат 5) (см. таблицу).
Из изученных штаммов Azospirillum 17 давали серологическую реакцию только с Ат 4 и не взаимодействовали с антителами к модельным штаммам. Данный факт требует дальнейшего изучения.
Пять штаммов азоспирилл (А. brasilense: 8Я 8, 8Я 64, 8Я 72, 8Я 41, БЯ 14) взаимодействовали только с родоспецифичными антителами и не имели общих антигенных структур с модельными штаммами и с хроматографически очищенными вариантами антигенов по данным наших серологических исследований. Это свидетельствует, возможно, о более широком разнообразии антигенных свойств О-антигенов данных бактерий.
Полученные результаты демонстрируют насколько велико разнообразие антигенных детерминант азоспирилл. Следует отметить, что некоторые штаммы, выделенные с растений одного вида, были отнесены в разные серотипы. И наоборот, были штаммы, выделенные с разных видов растений, которые проявляли сходные антигенные свойства, что позволило отнести их в один серовари-ант. Полученные экспериментальные данные имеют существенное значение для построения схемы идентификации бактерий рода Azospirillum в дальнейшем. При более де-
тальном изучении, возможно, будет пересмотрено серологическое положение различных штаммов азоспирилл.
Выражаем благодарность доктору биологических наук Л.Ю. Матора за предоставление антител, использованных в работе, и сотрудникам лаборатории биохимии ИБФРМ РАН кандидату биологических наук О.Н. Конновой и кандидату биологических наук Ю.П. Федоненко.
Работа выполнена при финансовой поддержке программы Президента РФ по поддержке научных школ (грант НШ-6177.2006.4).
Библиографический список
1. Bashan Y., Holguin G. Azospirillum-plant relationships: environmental and physiological advances (1990-1996) // Can . J. Microbiol. 1997. Vol.43. P.103-121.
2 . Albrecht S.L., Okon Y., Lonnquist L., Burris R.H. Nitrogen fixation by corn-Azospirillum associations in a temperate climate // Crop. Sci. 1981. Vol.21. P.301-306.
3. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiol. Rev. 2000. Vol.24. P.487-506.
4. Ignatov V.V., Fendrik I., M. Del Gallo et al. Interaction between partners in association "Wheat-Azospirillum brasi-lense Sp245" // Azospirillum VI and Related Microorganisms. Berlin, 1995. P.271-278.
5. Dobereiner J., Day J.M. Associative symbiosis in tropical grasses: characterization of microorganisms and dinitrogen-fixing sites // Proc. Intern. Symp. on N2-Fixation. Washington, 1976. P.518-537.
6. Leive L., Shovlin V.K., Mergemhagen S.E. Physical, chemical and immunological properties of lipopolysaccharides released from Escherichia coli by ethylenediaminetetraacetate // J. Biol. Chem. 1968. Vol.243. P.6384-6391.
7. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Matora L.Yu., Schwartsburd
B.I. The serotyping of Azospirillum spp. by cell-gold immu-noblotting // FEMS Microb. Lett. 1992. Vol.96. P.115-118.
8. Коннов,а О.Н., Бурыгин Г.Л., Федоненко Ю.П. и др. Химический состав и иммунохимическая характеристика липополисахарида азотфиксирующих ризобактерий Azospirillum brasilense Cd // Микробиология. 2006. Т.75, №3.
C.3 83-388.
9. Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И., Щеголев, С.Ю. Имму-нохимический анализ О-специфических полисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillum brasilense // Микробиология. 1998. Т.67, №6. С.815-820.
78
Научный отдел
