CC BY
86
ИССЛЕДОВАНИЯ / Биохимический анализ мяса
УДК 637.51:577.15
Исследование активности тканевых протеиназ
в процессе автолиза мяса яка
Б. А. Баженова, канд. техн. наук, Г. Н. Амагзаева, М. В. Баглаева, М. Б. Данилов, доктор техн. наук, ФБГОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления»
Проведенные исследования показали, что ферменты мяса катепсин D и кальпаины участвуют в процессе созревания и тендеризации мышечной ткани мяса яка. Установлено, что направленность послеубойных биохимических изменений в мясе яка сходна с динамикой автолиза в говядине, однако отличается по скорости.
Ключевые слова: мясо яка, кат кальпаины, кислотность среды логические показатели.
^ Одним из перспективных направлений решения проблемы дефицита мясного сырья является развитие аборигенного животноводства, в частности яко-водства. Для создания эффективных технологий переработки мяса яка и получения качественных продуктов необходимо изучать особенности биохимических явлений в мясе яка в послеубойный период.
Известно, что технологические показатели мяса в большой степени зависят от состава и строения мышечной ткани разных видов животных. Самые незначительные изменения в составе мышечной ткани могут оказывать воздействие на направленность и продолжительность автолиза.
Изменение тканей животных после убоя происходит под влиянием ряда биохимических и физико-химических процессов, протекающих в мышечных волокнах и связанных с распадом прижизненных биологических систем.
Изучение автолиза под действием тканевых про-теиназ с использованием препаратов изолированных тканей в стерильных условиях впервые описано Е. Сальковским в 1890 году. Он подтверждает самораспад клеток тканей под действием ферментов [1]. Исследованиями И. Смородинцева систематизированы и более подробно изучены ферментативные процессы при созревании мяса, которые в дальнейшем подтверждены рядом отечественных и зарубежных ученых. Выявлено, что пусковым механизмом процесса созревания мяса является изменение гликогена и АТФ, которые влекут конформационные изменения и агрегационные взаимо- действия белков. Далее в процессе созревания мяса происходит нарастание свободной протеолитической активности ка-тепсинов [2, 3].
Достижения современной науки о мясе позволили дополнить и даже пересмотреть существующую теорию автолитических изменений мышечной ткани.
Мясо с нормальным ходом автолиза сразу после убоя имеет нейтральную кислотность, а катепсины, которым придавалась основная роль в протеолизе белков, наиболее активны при кислых значениях рН. То есть на ранних стадиях автолиза эффективны другие ферменты. В связи с этим были выявлены протеи-назы, проявляющие максимальную активность при рН
, техно-
среды, близкой к нейтральному - кальпаины [4].
Установлено, что кальпаины действуют на структуру белков цитоскелета — коннектин, десмин, небу-лин, которые создают каркас, удерживающий нити актина и миозина в структуре мышечного волокна, а также способствуют частичной деградации актина. Особенностью кальпаина является то, что для его активации требуется определенная концентрация ионов кальция. Кальцийзависимые нейтральные про-теиназы локализованы в основном в саркоплазме, в отличие от лизосомальных катепсинов, поэтому более доступны и активны [1, 4, 5, 6, 7].
Кроме того, установлена кальциевая теория созревания мяса, которая имеет неферментативную природу. Согласно данной теории тендеризация мяса во время послеубойного созревания обусловлена ослаблением структуры миофибрилл, волокон дес-мина и внутримышечной соединительной ткани под влиянием ионов кальция. Ионы кальция образуют связи с фосфолипидами, находящимися в Z-линиях миофибриллярных структур, что приводит к их разрушению и деградации мышечных волокон [8, 9].
В связи с вышесказанным для выбора оптимальных сроков выдержки мяса яка, перед использованием его в производстве мясопродуктов, в данной работе была изучена активность тканевых протеиназ в процессе автолиза мяса яка. В продолжение работы планируется изучить роль кальция в созревании мяса яка.
Материалы и методы
В работе исследовали следующие образцы: пробы
£ 4
тс
я 3,5
и
0.5 0
мясо яка конина говядина
Рисунок 1. Содержание гликогена в парной мышечной ткани разных видов животных
И
28
ВСЁ О МЯСЕ № 6 декабрь 2013
Биохимический анализ мяса / ИССЛЕДОВАНИЯ
6,5 6
5,5 5
0,1 1 23456789
х, сут
---------мясо яка ----конина -говядина
Рисунок 2. Динамика изменения рН разных видов мяса
полусухожильных мышц бедра яка, конины и говядины с нормальным ходом автолиза. Образцы брались вскоре после убоя (1-2 часа), упаковывались в полимерную пленку и охлаждались при низких положительных температурах (2 - 4 °С). Для соблюдения идентичности условий эксперимента отбор туш производился по возрасту, массе и упитанности. Из образцов каждые 24 часа отбирали пробы для исследований и изучали в течение 9 суток следующие показатели:
— активность катепсина D, который обладает высокой активностью и широкой субстратной специфичностью;
— активность кальпаина;
— содержание гликогена;
— рН;
— усилие среза.
Для определения активности протеиназ использовали метод Ансона в модификации Е. Каверзневой, в котором о каталитических свойствах судят по степени расщепления стандартных белков с образованием низкомолекулярных продуктов: пептидов и аминокислот, в частности, по накоплению тирозина. В качестве субстрата при определении активности катепсина D и кальпаина использовали казеин [10].
Расчет протеолитической активности экстракта катепсинов мышечной ткани ПА, ед./см3 вели по формуле:
ПА = (4 • Д •К) / (ТЭ • Т),
где Д - оптическая плотность раствора;
К - разведение (если оно применяется);
ТЭ - тирозиновый эквивалент, определяемый по калибровочному графику для данного реактива Фолина;
Т - продолжительность гидролиза, мин (Т=15 мин).
Активность кальпаинов определяли по модифицированной методике Ансона в буфере при рН 7,5.
Массовую долю гликогена определяли антроно-вым методом, основанным на нагревании моносахаридов с неорганическими кислотами для перехода их в фурфурол (оксиметилфурфурол), которые с антро-ном дают окрашенные соединения. Интенсивность окраски определяли колориметрически и определяли количество анализируемых углеводов [11].
Концентрацию ионов водорода определяли по-тенциометрическим методом, основанным на измерении электродвижущей силы элемента, состоящего
из электрода, потенциал которого обусловлен концентрацией ионов водорода в испытуемом растворе. Величину рН определяли в гидромодуле 1:10 [11].
Для определения структурно-механических свойств после определения потерь массы при термической обработке пробником №5 (диаметр 10 мм) вырезали образцы вдоль волокон и определяли усилие резания на приборе типа Уорнера-Братцлера. Принцип работы основан на измерении усилия, необходимого для разрушения образца путем среза и затраченной на это работы. Максимальная величина усилия среза служит инструментальным показателем нежности мяса.
Результаты и обсуждение
Сразу после убоя начинается анаэробный распад гликогена по пути фосфоролиза с накоплением молочной кислоты, количество которой зависит от запасов гликогена в мышечной ткани. На рисунке 1 представлено содержание гликогена в разных видах мяса в парном состоянии. Значение гликогена в говядине составило 0,9%, в мясе яка больше в два раза, а в конине - в три раза. Большее содержание гликогена в мясе яка и конине, видимо, связано с необходимостью восполнения запасов энергии при длительной физической работе этих животных, так как основной животный углевод, гликоген, обеспечивает потребность организма в энергии и метаболитах.
В результате фосфоролитического распада гликогена накапливается молочная кислота, которая изменяет кислотность среды, поэтому информативным является изучение величины рН мяса яка (рис. 2). Данные показали, что в мясе яка гликолиз несколько растянут по сравнению с говядиной, так как минимальное значение рН, равное 5,3 ед., достигается лишь на 2-е сутки при хранении образцов при минимальных положительных температурах (2 - 4 °С).
Как было указано выше, протеолитические изменения белков обусловлены действием лизосомальных катепсинов и кальцийзависимых нейтральных протеи-наз - кальпаинов, локализованных в саркоплазме клеток. В парной мышечной ткани активность кальций-зависимых протеиназ максимальна, поэтому сначала изучали изменение кальпаинов (рис. 3).
Полученные данные показали, что уровень активности кальпаинов зависит от вида исходного сырья и уровня концентрации ионов водорода. Уже в парном мясе уровень активности кальпаинов в мясе яка на
Ъ 0,12
О
Э 0,1
1 0,08 I
<! 0,06 0,04 0,02
О
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
т,суг
.........мясо яка ---конина -говядина
Рисунок 3. Зависимость активности кальпаина мышечной ткани от продолжительности автолиза
\
.... \ \
\ , \ \ N
\ V ч
— ---- ----
№ 6 декабрь 2013 ВСЁ 0 МЯСЕ
29
ISP
ИССЛЕДОВАНИЯ I Биохимический анализ мяса
Таблица. Усилие резания мяса в процессе автолиза (Н/м)
Показатели Продолжительность автолиза, сут.
0 1 2 3 4 5 6 7
Мясо яка 16,1±0,3 16,9±0,2 17,9±0,3 17,4±0,3 17,1±0,2 16,8±0,2 16,5±0,3 16,1±0,4
Конина 16,6±0,4 17,5±0,6 18,6±0,2 19,5±0,6 19,3±0,2 18,7±0,5 18,5±0,3 18,2±0,3
Говядина 15,6±0,6 16,5±0,5 16,4±0,4 16,1±0,4 15,8±0,3 15,3±0,4 14,8±0,5 14,5±0,3
13% ниже, чем в говядине и на 14% выше, чем в конине. В результате автолитических изменений наблюдается инактивация кальпаинов, причем скорость падения активности наибольшая в течение трех суток, что, по всей вероятности, обусловлено, в том числе, изменением кислотности среды и наличием эндогенного ингибитора — кальпастатина.
Постепенное снижение кислотности среды в процессе послеубойных изменений создает условия для выхода катепсина D из лизосом и их активации. Результаты исследования активности катепсина D в процессе автолиза в мышечной ткани разных видов мяса, представленные на рисунке 4, показали одинаковый характер ее изменения, но разную скорость. Начальное значение активности катепсина во всех видах мяса невысокое, составляет лишь 0,05 ед/см3, что обусловлено латентным его состоянием в лизосомах (рис. 4).
Максимальное значение 0,25 ед/см3 активности катепсина в говядине достигает через 24 часа и далее наблюдается плавное ее снижение. В мясе яка данный процесс растянут почти на 24 часа, так как максимальное значение активности, равное 0,26 ед/см3 достигается на вторые сутки, в конине — только на третьи сутки по сравнению с говядиной. Интенсивное высвобождение катепсинов при созревании про-
S 0.25
S I
0.1 0,05 0
0,1 123456789
Рисунок 4. Изменение активности катепсина D мышечной ткани разных видов мяса
исходит вследствие повышения проницаемости мембран лизосом и увеличения концентрации ионов водорода в саркоплазме мышечного волокна. Далее наблюдается снижение активности катепсинов вследствие накопления продуктов реакции, ингиби-рующих их активность.
В результате действия комплекса ферментов на белки мясной системы происходит их гидролиз и улучшение структурно-механических показателей мяса. Для установления динамики размягчения мяса яка в процессе созревания было исследовано усилие резания мышечной ткани, представленное в таблице.
Полученные данные показали, что период окоченения мяса яка с приобретением наибольшей жесткости приходится на вторые сутки, в отличие от говядины (первые сутки) и конины (третьи сутки). Значения усилия резания образцов мяса яка превышают таковые в говядине, однако остаются ниже, чем в конине. По всей вероятности прочностные свойства мышечной ткани определяются не только видом и структурой мяса, но и глубиной развития автолитиче-ских процессов.
Таким образом, проведенные исследования доказывают, что в процессе созревания и тендеризации мышечной ткани мяса яка важную роль играют ферменты мяса. Установлено, что направленность после-убойных биохимических изменений в мясе яка, конине и говядине сходна, однако отличается по скорости. Процесс посмертного окоченения с последующим его разрешением растянут в мясе яка почти на 20-24 часа, в конине — на 44-48 часов по сравнению с говядиной. В связи с этим необходимо предусмотреть условия послеубойного хранения мяса яка или методы и способы повышения эффективности его переработки. _|
Контакты:
Баяна Анатольевна Баженова Галина Николаевна Амагзаева Мария Вадимовна Баглаева Михаил Борисович Данилов +7 (3012) 43-7218
Литература
1. Розанцев Э.Г. Элементы биохимической физики созревания мяса // Мясная индустрия. № 8. 2008. С. 28 - 33.
2. Кудряшов Л.С. Биохимические и физико-химические изменения при созревании мяса // Мясная индустрия. № 6. 2006. С. 21 - 24.
3. Соловьев В.И. Созревание мяса // М.: Пищевая промышленность, 1966. 85 с.
4. Кудряшов Л.С. Кальпаины и их роль в технологии мясных продуктов // Обзорная информация. М.: АгроНИИТЭИММП. 1993. 40 с.
5. Purslow P.P. Ertbjerg P.et. al. Patterns of variation in enzyme activity and cytoskeletal proteolysis in muscle // 47th International Congress of Meat Science and Technology, Poland, 2001.
6. Кудряшов Л.С. Ферменты мышечной ткани и их свойства // Мясная индустрия. № 9. 2007. С. 18 - 21, № 10. 2007. С. 30 - 33.
7. Koohmaraie M., Whipple G., Kretchmar D.H. Crouse J.D., Mersmann H.J. Postmortem proteolysis in longissimus muscle from beef, lamb and pork carcasses // J. Anim.Sci. 1991. v.69.
8. Takahashi K. Mechanism of tenderization during post-mortem ageing calcium theory. 45th International Congress of Meat Science and Technology, Japan. 1999.
9. Кудряшов Л.С. Кальций и его роль в изменениях тканей животных после убоя // Мясная индустрия. № 3. 2007. С. 22 - 24.
10. Антипова Л.В., Глотова И.А., Жаринов И.А. Прикладная биотехнология. УИРС для специальности 270900. Учеб. Пособие. Воронеж, 2000. 332 с.
11. Антипова Л.В., Глотова И.А., Рогов И.А. Методы исследования мяса и мясопродуктов. М.: Изд-во Колос, 2001. 376 с.
30
ВСё 0 МЯСЕ № 6 декабрь 2013
