CC BY
32
Исследование активности L-лизин-а-оксидазы в опытах in vitro на моделях вирусов Синдбис, клещевого энцефалита, Западного Нила, Тягиня и Дхори
И. П. СМИРНОВА', В. Ф. ЛАРИЧЕВ2, Ю. А. ШНЕЙДЕР'
1 Российский университет дружбы народов, Москва
2 Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи, Москва Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздрава России, Москва
L-Lysine-a-Oxidase in vitro Activity in Experiments on Models of Viruses Sindbis, Forest-Spring Encephalitis, Western Nile, Tyaginya and Dhori
I. P. SMIRNOVA, V. F. LARICHEV, YU. A. SHNEIDER Russian University of Peoples' Friendship, Moscow
N. F. Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow D. I. Ivanovsky Institute of Virology, Moscow
Впервые исследовалось влияние противоопухолевой препарата L-лизин-а-оксидазы, полученого из культуральной жидкости Trichoderma harzianum Rifai F-180. В опытах in vitro установлена высокая активность L-лизин-а-оксидазы на модели вируса клещевого энцефалита и отсутствие активности в отношении вирусов Синдбис, Западного Нила, Тягиня и Дхори.
Ключевые слова: L-лизин-а-оксидаза, арбовирусы, клещевой энцефалит, цитопатическое действие, противовирусная активность.
The antitumor effect of L-lysine-a-oxidase from the culture fluid of Trichoderma harzianum Rifai F-180 was investigated for the first time. The in vitro studies revealed its high activity on a model of the forest-spring encephalitis virus and no activity against the Sindbis, Western Nile, Tyaginya and Dhori viruses.
Key words: L-lysine-a-oxidase,arboviruses, forest-spring encephalitis, cytopathic effect, antiviral activity.
Арбовирусы — это экологическая группа вирусов, передающихся восприимчивым позвоночным через укусы кровососущих членистоногих: комаров, клещей, москитов, мошек и мокрецов.
Такие инфекции, как лихорадка Чикунгунья и О'Ньонг-Ньонг, восточный, западный, венесуэльский энцефалиты лошадей (сем. Togaviridae), лихорадка денге, жёлтая лихорадка, энцефалиты — японский, клещевой, Сент-Луис, долины Муррея, Западного Нила (сем. Flaviviridae), Крымской-Конго геморрагической лихорадки, лихорадки Долины Рифт (сем. Bunyaviridae), а также вирусы других семейств (Reoviridae, Arenaviridae и Rhabdoviridae) — далеко не полный перечень опасных для человека арбовирусных инфекций, имеющих огромное значение для здравоохранения.
Для подавляющего большинства арбовирус-ных инфекций вакцинные препараты не разработаны. В связи с этим химиопрепараты приобрета-
© Коллектив авторов, 2015
Адрес для корреспонденции: 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6. РУДН
ют решающее значение как для лечения, так и для профилактики.
В основу изучения противовирусного действия препаратов положен таксономический принцип (если препарат действует на один «модельный» вирус, то можно предположить, что он будет действовать на все вирусы данного семейства, так как стратегия генома у всего семейства одинакова).
Большая часть исследований, касающаяся химиотерапии арбовирусных инфекций, посвящена изучению ингибирующей роли антивирусных препаратов на моделях бунья- и аренавирусных инфекций. Весьма обнадёживающими были данные о выраженной противовирусной активности рибавирина в отношении тога-, бунья- и арена-вирусных инфекций и о перспективности этого препарата для клинического применения [1].
На кафедре биохимии им. академика Т. Т. Берёзова Российского университета дружбы народов в течение многих лет проводятся исследования Ь-лизин-а-оксидазы — антивирусного и противоопухолевого фермента из Trichoderma harzianum ШГа1 Б-180. Фермент
Схема эксперимента Определение активности L-лизин-а-оксидазы на перевиваемых линиях клеток
Ряды Ь-лизин-а-оксидаза, Ь-лизин-а-оксидаза Поддерживающая среда
_25 мкг/мл_12,5 мкг/мл_без Ь-лизин-а-оксидазы
1** 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
*A -2*** -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2
B -з -з -з -з -з -з -з -з -з -з -з -з
C -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4 -4
D -S -S -S -S -S -S -S -S -S -S -S -S
E -б -б -б -б -б -б -б -б -б -б -б -б
F -У -У -У -У -У -У -У -У -У -У -У -У
G -S -S -S -S -S -S -S -S -S -S -S -S
H Контроль токсичности Контроль токсичности Контроль клеток
Примечание. * — Номера горизонтальных рядов на 96-луночном планшете; ** - номера вертикальных рядов на 96-луночном планшете; *** — степень (10-2, 10-3...) разведения исследуемого вируса.
L-лизин-а-оксидаза является ингибитором вируса простого герпеса 1-го типа, вируса иммунодефицита человека и ряда других особо опасных вирусов [2—10].
Цель данной работы — исследование возможности ингибирования гомогенного фермента L-лизин-а-оксидазой вирусов из семейств Flaviviridae, Bunyaviridae и Orthomyxoviridae.
Материал и методы
В работе использованы вирусы из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского»: семейство Togaviridae, род Alfavirus — вирус Синдбис (штамм 574); семейство Flaviviridae, род Flavivirus — вирус клещевого энцефалита (штамм 205), вирус Западного Нила (штамм Аст.986); семейство Bunyaviridae, род Bunyavirus — вирус Тягиня (штамм 92); семейство Orthomyxoviridae, род Thogotovirus — вирус Дхори (прототип-ный штамм).
Перевиваемые линии клеток: клетки почки эмбриона свиньи (SPEV) и клетки почки эмбриона зелёной мартышки (Vero, клон Е6). Клетки SPEV выращивали в 96-луночных планшетах («Corning», США) на питательной среде 199 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН) с 5% эмбриональной телячьей сыворотки («High Clone», США). Клетки Vero E6 выращивали в 96-лу-ночных планшетах на питательной среде Игла с двойным набором аминокислот (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН) с 5% эмбриональной телячьей сыворотки («High Clone», США).
Источником заражения клеток служили вируссодержа-щие суспензии мозговой ткани инфицированных новорождённых белых мышей. Для приготовления разведений мозговой ткани и препаратов использовалась питательная среда с 1% эмбриональной телячьей сывороткой («High Clone», США). Готовили 10% мозговую суспензию, а затем — последовательные десятикратные разведения вируссодержащего материала от 10-2 до 10-10.
Учёт реакций проводили ежедневно в течение 7 дней, наблюдая за развитием цитопатического действия (ЦПД) (гибель клеток) вирусов на клетки, просматривая лунки планшетов под инвертированным микроскопом. Титр вируса оценивали в lg ЦПД100 (развитие ЦПД во всех лунках с одинаковым разведением вируса).
Схема эксперимента (таблица): 10-кратные разведения вирусов от 10-2 до 10-8 или от 10-4 до 10-10 (в зависимости от активности предварительно «протитрованных» вирусных суспензий) последовательно, начиная с верхнего горизонтального ряда (А), вносили по 100 мкл в лунки 96-луночных планшетов с монослоем клеток. В ряд (Н) вносили поддерживающую среду без
вируса. Контакт вируса с клетками проводили в течение 1 ч при 37°С. После инкубации вируссодержащую среду удаляли из планшета. В лунки с контрольным (сравнительным) титрованием — 4 вертикальных ряда (№ 9—12) — вносили поддерживающую среду, а в лунки, предназначенные для определения противовирусной активности, добавляли поддерживающую среду, содержащую L-лизин-а-оксидазу: 4 вертикальных ряда (№ 1—4) в концентрации 25 мкг/мл и 4 вертикальных ряда (№ 5—8) — 12,5 мкг/мл.
В работе использовали фермент L-лизин-а-оксидазу из Trichoderma harzianum Rifai F-180. Гомогенный фермент получали по ранее разработанной методике [4, 5].
Активность L-лизин-а-оксидазы в культуральной жидкости Trichoderma рассчитывали по приросту Н2О2, количество которой определяли спектрофотометрическим ортодиазиди-новым микрометодом [5].
Результаты и обсуждение
На первом этапе эксперимента оценивалось токсическое действие L-лизин-а-оксидазы на перевиваемые линии клеток. К монослою клеток в лунках планшетов добавляли L-лизин-а-оксидазу в концентрациях 2,0, 1,0, 0,5, 0,25, 0,1, 0,05, 0,025, 0,012, 0,006, 0,003, 0,0012, 0,0006 мг/мл. Токсический эффект препарата оценивали по развитию ЦПД. Было установлено, что в обеих линиях клеток выраженный токсический эффект развивается в концентрациях 0,05 мг/мл и выше. Концентрации 0,025 мг/мл и 0,0125 мг/мл (25 и 12,5 мкг/мл) являются максимально допустимыми, хотя и вызывают тормозящее действие на размножение клеток. Для изучения противовирусного действия препарата были выбраны максимальные его концентрации, не вызывающие ЦПД.
Изучение противовирусного действия L-ли-зин-а-оксидазы на вирусы Западного Нила, Тягиня, Синдбис и Дхори проводились на клетках Vero E6.
В ходе эксперимента установлено, что титр вируса Западного Нила при контрольном титровании составил 9,0 lg ЦПД100, а с L-лизин-а-окси-дазой как в концентрации 25 мкг/мл, так и 12,5 мкг/мл составил те же 9,0 lg ЦПД100. Титр вируса Тягиня в контроле составил 7,0 lg ЦПД100, с L-ли-зин-а-оксидазой в концентрации 25 мкг/мл — 8,0
lg ЦПД100, в концентрации 12,5 мкг/мл — 7,0 lg ЦПД100. Титр вируса Синдбис в контроле составил 6,5 lg ЦПД100, а с L-лизин-а-оксидазой как в концентрации 25 мкг/мл, так и 12,5 мкг/мл составил 7,0 lg ЦПД100. Для вируса Дхори установлено, что титр в контроле составил 7,0 lg ЦПД100, а с L-лизин-а-оксидазой в концентрациях 25 мкг/мл и 12,5 мкг/мл — 7,0 lg ЦПД100.
L-лизин-а-оксидаза не оказывает какого-либо противовирусного действия на вирусы Западного Нила, Тягиня, Синдбис и Дхори, так как не выявлено разницы в титрах вирусов при их титровании с препаратом и без.
Опыты по определению активности L-лизин-а-оксидазы относительно вируса клещевого энцефалита (КЭ) проводились на линии клеток SPEV, так как именно в них развивается ЦПД, вызываемое вирусом КЭ.
Было установлено, что титр вируса в контроле составил 8,0 lg ЦПД100, а с L-лизин-а-оксидазой как в концентрации 25 мкг/мл, так и 12,5 мкг/мл составил 5,0 lg ЦПД100. L-лизин-а-оксидаза оказывает выраженное противовирусное действие (индекс нейтрализации — 3,0 lg ЦПД100).
Отрицательные результаты эксперимента с другими вирусами оказались неожиданными,
ЛИТЕРАТУРА
1. Березина Л.К. Химиопрофилактика и химиотерапия / Арбовирусы и арбовирусные инфекции / Под ред. Д.К.Львова, С.М.Клименко, С.Я.Гайдамович. М.: Медицина, 1989; 156—163.
2. Алексеев С.Б, Березов Т.Т., Анджапаридзе О.Г. и другие. Ингибитор вируса герпеса простого I-го типа. Патент РФ №2022012,1994.
3. Алексеев С.Б, Веса В.С., Смирнова И.П. и другие. Ингибитор вируса иммунодефицита человека. Патент РФ № 2022011,1994.
4. Смирнова И.П., Березов Т.Т. Биотехнология фермента L-лизин-а-оксидазы из триходермы. М.: Изд.-во «Копиризо». M.: 189.
5. Смирнова И.П., Шкинев В.М., Руднев А.В., Шнейдер Ю.А., Кузовни-ков А.Е. Технологии выделения и очистки L-лизин-а-оксидазы. Журн Биотехнология 2010; 6: 47—54.
6. Смирнова И.П., Шнейдер Ю.А. Штамм — Trichoderma harzianum Rifai — продуцент ингибитора вируса кольцевой пятнистости табака (Tobacco ringspot virus). Патент № 2475528, (Р.Ф; Изобретение), Бюллетень Роспатента «Изобретения, полезные модели» № 5, 20.02.2013г.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Смирнова Ирина Павловна — Кафедра биохимии РУДН, Москва.
особенно с вирусом Западного Нила, который относится к тому же семейству, что и вирус КЭ (Flaviviridae). Однако эксперимент с вирусом КЭ проводился на клетках SPEV, а с остальными вирусами на клетках Vero E6. Возможно, противовирусное действие связано с особенностями клеточных линий. В то же время эксперименты по изучению действия рибавирина на вирусы Тягиня и Дхори, проводившиеся на клетках Vero E6, показали его способность подавлять репликацию этих вирусов [11]. А эксперименты по изучению противовирусной активности рибавирина на клетках SPEV относительно КЭ — отрицательные.
Заключение
Таким образом, в результате проведённых исследований в опытах in vitro на модели вируса клещевого энцефалита на сегодняшний день, L-лизин-а-оксидаза — первое вещество, которое ингибирует ЦПД вируса КЭ на перевиваемой линии клеток. Механизм ее противовирусного действия не известен. Нами обнаружено отсутствие активности фермента в отношении вирусов Синдбис, Западного Нила, Тягиня и Дхори.
7. Смирнова И.П., Шнейдер Ю.А. Продуцент ингибитора вируса некротической пятнистости бальзамина. Патент № 2481392 (Р.Ф; Изобретение), Бюллетень Роспатента «Изобретения, полезные модели» № 13, 10.05.2013 г.
8. Смирнова И.П., Ларичев В.Ф. Ингибитор вируса клещевого энцефалита. Патент № 2473689 (Р.Ф; Изобретение), Бюллетень Роспатента «Изобретения, полезные модели» № 3, 27.01.2013 г.
9. Сёмкина О.А.,СмирноваИ.П., ДавахянМ.А.,Бондаренко О.В. Кишма-хова Л.М. Разработка состава и технологического геля ранозажив-ляющего действия. Вестник РУДН, Медицина, 2013; 4: 79—87.
10. Smirnova I.P., Kuznetsova O.M., Ivanova-Radkevich V.I., OrlovaV.S, Podboronov V.M., Alexeev A.A. Testing of an antitumor enzyme L-lysine-а-oxidase from Trichoderma harzianum Rifai F-180. World J Med Sci 2014; 11: 2: 233—236.
11. Белов А. В., Ларичев В. Ф, Галкина И. А., Хуторецкая Н. В., Бутенко А. М, Константинова И. Д., Музыка И. С, Галегов Г. А. Активность отечественного рибавирина в опытах in vitro на моделях вирусов крымской геморрагической лихорадки, лихорадки долины Рифт, Тягиня и Дхори. Вопр вирусол 2008; 1: 34—36.
Шнейдер Юрий Андреевич — Кафедра биохимии РУДН, Москва.
