CC BY
80
УДК 577.47.170.49
Минакова В.В.1, Карнаухова И.В.1, Пряхин А.В.2, Соловых Г.Н.2, Павлова М.М.2
Оренбургский государственный педагогический университет1 Оренбургская государственная медицинская академия2 E-mail:[email protected]
ИССЛЕДОВАНИЕ АККУМУЛЯЦИИ СВИНЦА, РТУТИ И АКТИВНОСТИ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ В ТКАНЯХ ПРЕСНОВОДНЫХ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ СЕМЕЙСТВА иЫЮЫЮАЕ
Обнаружены межвидовые различия в аккумуляции тяжелых металлов и продукции суперок-сиддисмутазы моллюсками исследуемых систематических групп; при сравнительном анализе прослеживается взаимосвязь между локализацией тяжелых металлов и активностью суперок-сиддисмутазы в тканях унионид, что, видимо,связано с особой фильтрационной функцией дву-створок в гидробиоценозе.
Ключевые слова: аккумуляция металлов (ртуть, свинец),активность супероксиддисмутазы, моллюски.
В последние десятилетия в экосистемах водоемов наблюдаются изменения, которые происходят как под влиянием естественных факторов, так и в результате хозяйственной деятельности человека. Поэтому особую актуальность приобретают исследования закономерностей реакций моллюсков на меняющиеся условия окружающей среды. Угрозу для жизнедеятельности гидробионтов представляют тяжелые металлы (ТМ) и их соединения. Они характеризуются высокой токсичностью для живых организмов уже в относительно низких концентрациях, а также способностью к биоаккумуляции [2].
С экотоксикологической точки зрения особый интерес представляет способность тяжелых металлов индуцировать оки=слительный стресс, который рассматривается в качестве ведущего патогенетического механизма дезорганизации клеточного метаболизма [4]. Согласно этим представлениям, независимо от конкретного механизма действия чужеродного химического агента, его вмешательство в окислительный метаболизм прямо или косвенно сопряжено с усилением генерации высокореакционных радикалов кислорода(оксирадикалов). Возникший дисбаланс между про- и антиокислитель-ными системами приводит к накоплению продуктов окисления основных классов
макромолекул, включая липиды, белки и нуклеиновые кислоты, в результате чего в клетке может развиваться патологический (деструктивный) процесс, получивший в литературе название окислительного стресса [2,3]. Однако экспериментальных данных, подтверждающих способность ТМ нарушать равновесие между про- и антиоксидантной системами и вызывать
окислительный стресс в тканях водных беспозвоночных, в частности моллюсков, практически нет. Поэтому взаимоотношение двустворчатых моллюсков со средой обитания, динамика их популяций определяется, прежде всего, наличием в их тканях системы окислительного обмена [3, 4]. В ответ на стрессовое воздействие в тканях гидробионтов синтезируются различные защитные соединения, важнейшими из которых являются антиоксидантные ферменты.
На основании вышеизложенного целью данной работы было: в ходе натурных экспериментов провести сравнительное исследование локализации тяжелых металлов - свинца и ртути - и активности ключевого антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы (СОД) в тканях моллюсков родов ипіо и АпойопЬа.
Материалы и методы исследования
Объектами проводимых исследований явились двустворчатые моллюски, населяющие гидробиоценозы среднего течения р. Урал в районе г. Оренбурга видов ипіо рісґотиш и АпоСопІа упеа. Сбор моллюсков осуществлялся весной, летом и осенью, принятыми в малакологии методами. Производили измерения высоты, длины и выпуклости раковины, их соотношения, идентифицировали моллюсков до вида. Для исследований отбирали моллюсков одной возрастной группы, препарировали, отделяя жабры, мантию и тело. Часть тканей отбирали для гистохимии, часть - гомогенизировали.
Метод приготовления экстрактов тканей моллюсков. Для исследования отбирали моллюсков одной возрастной группы, препарировали, отделяя жабры, мантию и тело. Затем го-
могенизировали полученные ткани, предварительно взвешивая их. Экстракты моллюсков готовили путем растирания их тканей в 0,1 М фосфатном буфере (рН 6,2) с кварцевым песком на холоду в фарфоровой ступке с добавлением ингибитора протеаз - фенилметилсуль-фонилфторида (300 мкг/мл). Полученные го-могенаты подвергали многократному замораживанию и оттаиванию. Центрифугировали при 9000об/мин в течение 15 минут.
Гистохимическое определение тяжелых металлов в тканях двустворчатых моллюсков семейства ишошёае.Ткань фиксировали в 10%-ом растворе формалина. Выполняли проводку в спиртах возрастающей концентрации. Затем ткани заливали в парафин. Срезы выполняли на микротоме МС? 2, толщина 8 - 10 мкм.
Для определения свинца в тканях двустворчатых моллюсков парафиновые срезы фиксировали в подкисленном уксусной кислотой растворе хромата в течение нескольких дней. Соли свинца превращаются в желтые моноклиничес-кие кристаллы хромата свинца.
Определение ртути проводили по методике Ламбардо. Метод основан на переводе солей ртути в сульфидные соединения. Срезы тканей помещали в сероводородную воду, затем промывали в проточной воде, обезвоживали в спирте, просветляли в ксилоле и заключали в бальзам. Локализацию ртути определяли по черному осадку.
Количественное определение белка проводили по методике Варбурга и Кристиана. В 1 см кювете измеряли оптическую плотность разбавленного соответствующим образом раствора супернатанта при длине волны 260 и 280 нм. Концентрацию белка вычисляли по формуле:
Сбелка(мг/мл) = 1,55*А280 - °,76*А260,
где Сбелка - концентрация белка;
А280 - экстинкция супернатанта при 280 нм;
А260 - экстинкция супернатанта при 260 нм
Определение удельной активности супе-роксиддисмутазы. Активность СОД определяли в надосадочной жидкости по реакции торможения аутоокисления адреналина в адренохром в щелочной среде (рН=10,5).
К 2 мл карбонатного буфера добавляли 20 мкл супернатанта и 100 мкл 0.1% аптечного раствора адреналина. Тщательно, быстро перемешивали, закрыв кювету крышечкой от спектральной кюветы, и регистрировали нарастание оптической плотности при 347 нм в течение
10 минут против контрольного раствора: те же компоненты, но без адреналина.
Активность СОД определяли по формуле: А (%) = (Е - Е ) • 100 / Е,
4 / 4 к опыт' ' к
где А - активность фермента;
Ек - экстинкция контроля;
Ео - экстинкция опыта
За единицу активности принимали торможение аутоокисления в опыте по сравнению с контролем на 50%. Во всех пробах определяли содержание белка спектрофотометрически и рассчитывали удельную активность фермента на мг белка в пробе.
Результаты и их обсуждение
В ходе эксперимента было зафиксировано наличие свинца и ртути в тканях двустворчатых моллюсков. Отмечались межвидовые различия в накоплении тяжелых металлов, о чем косвенно можно судить по интенсивности окраски исследованных тканей. Все срезы тканей моллюсков рода АпойопЬа имели более интенсивную окраску. Кроме этого зафиксированы межтканевые особенности локализации тяжелых металлов. Наибольшее содержание тяжелых металлов фиксировалось в жаберной ткани обоих видов двустворчатых моллюсков.
На втором этапе представлялось актуальным исследовать активность СОД моллюсков и провести сравнительный анализ между локализацией тяжелых металлов в тканях двустворчатых моллюсков и активностью этого антиоксидантного фермента.
Активность СОД определяли в надосадоч-ной жидкости по реакции торможения аутоокисления адреналина в адренохром в щелочной среде. Из полученных результатов видно, что удельная активность СОД колеблется в пределах от 4,8 до 660,7 е.а./мг белка. Наибольшая активность зафиксирована в жаберной ткани обоих видов: 660,7 и 271,4 е.а./мг белка соответственно.
Такая корреляция между накоплением тяжелых металлов в тканях моллюсков и уровнем активности СОД свидетельствует о повышенной окислительной нагрузке в жабрах уни-онид по сравнению с другими тканями.
Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:
- обнаружены межвидовые различия в аккумуляции ТМ и продукции СОД моллюсками исследуемых систематических групп;
- при сравнительном анализе прослежива- что, видимо, связано с особой фильтрационной
ется взаимосвязь между локализацией тяжелых функцией двустворок в гидробиоценозе.
металлов и активностью СОД в тканях унионид, 17.02.2011
Список литературы:
1. Виселина Т. Н. Изменение активности ферментов углеводного обмена у моллюсков под действием кадмия /Т.Н. Висели-на, О.Н. Лукьянова // Биология моря. - 2000. - Т. 26, №4. - С. 278 - 280.
2. Давыдов С.Л., Тарасов В.И. Тяжелые металлы как супертоксиканты XXI века /С.Л. Давыдов, В.И. Тарасов. - М.: Изд-во РУДН, 2002. - 140 с.
3. Клишко О.К., Авдеев Д.В., Голубева Е.М. Особенности биоаккумуляции тяжелых металлов у моллюсков в аспекте оценки состояния окружающей среды / О.К. Клишко, Д.В. Авдеев, Е.М. Голубева // Доклады Академии Наук. - 2007. - С. 132-134.
4. Остроумов С.А., Ворожун И. М. Аккумуляция тяжелых металлов в тканях двустворчатого моллюска ЛпойопШ cygnea в водоемах аграрной и урбанизированной территорий /С.А. Остроумов, И.М. Ворожун //Экологическая химия. - 2008, №6 - С. 25-33.
Сведения об авторах:
Минакова Виктория Валерьевна, доцент кафедры химии и методики преподавания химии Оренбургского государственного педагогического университета, кандидат биологических наук Карнаухова Ирина Владимировна, доцент кафедры химии и методики преподавания химии Оренбургского государственного педагогического университета, кандидат биологических наук Пряхин Алексей Владиславович, ассистент кафедры оперативной хирургии и клинической анатомии Оренбургской государственной медицинской академии, кандидат медицинских наук Соловых Галина Николаевна, заведующий кафедрой биологии Оренбургской государственной медицинской академии, доктор биологических наук, профессор, тел. (3532) 775878, e-mail: [email protected] Павлова Маргарита Михайловна, доцент кафедры биохимии Оренбургской государственной медицинской академии, кандидат биологических наук, тел. (3532) 774867
UDС 577.47.170.49
Minakova V.V.*, Karnauhova I.V.*, Praihin A.V.**, Solovih G.N.**, Pavlova M.M.**
* The State Pedagogical University of Orenburg **The State Medical Academy of Orenburg E- mail: [email protected]
RESEARCH OF ACCUMULATION OF LEAD, MERCURY AND ACTIVITY OF SUPEROKSIDDISMUTAZY TISSUES OF FRESHWATER BIVALVES OF FAMILY OF UNIONIDAE
Localization of serious metals and activity SOD in tissues of molluscums of sorts Unio and Anodonta is defined. At the analysis of the received data the direct interrelation between localization of serious metals and activity SOD in tissues of molluscums is found out.
Key words: accumulatiom of metals, lead, mercury, activity of superoxiddismutase, mollusks.
Bibliography:
1. Viselina T.N. Change activity of enzymes of carbohydrate exchange for shellfishes under the action of cadmium/T.N. Viselina, O.N. Lukyanova// Biology of sea. - 2000. - T. 26,№ 4io - P. 278 - 280.
2. Davydov S.L.,Tarasov V.I. Heavy metals as supertoksikanty of XXI age /C.L. Davydov, V.I. Tarasov. - M.: Publishing house RUDN, 2002. - 140 p.
3. Klishko O.K., Avdeev D.V., Golubeva E.M. Peculiaritys of bioakkumulyacii of heavy metals for shellfishes in the aspect of estimation of the state of environment/O.K. Klishko, D.V. Avdeev, e.M. Golubeva //Lectures of Academy of Sciences. -2007. - P. 132 - 134.
4. Ostroumov S.A., Vorozhun I.M. Accumulation of heavy metals in tissues of bivalve Anodonta cygnea in the reservoirs of agrarian and urbanized territories/ S.A. Ostroumov, I.M. Vorozhun //Ecological chemistry. - 2008, №6 - P. 25 - 33.
