CC BY
22
УДК '616.932:6) 6-097
'С.А.Бугоркова, СЮ.Задумина, Т.Н.Щуковская, В.В.Кутырев
ИССЛЕДОВАНИЕ АДАПТАЦИОННО-КОМПЕНСАТОРНЫХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ
ИММУННОГО ОРГАНИЗМА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ХОЛЕРЕ
1 - . . • ’
; Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Проведено исследование ряда морфометрических характеристик, в частности, реакции апудоцитов функционально значимых систем организма предварительно иммунизированных взрослых кроликов при воспроизведении на них холерной инфекции для оценки адаптационно-компенсаторных возможностей макроорганизма. Выявлена активация нейроэндокринного окружения иммунокомпетентных органов иммунизированных кроликов, заключающаяся в достоверном (р<0,05) увеличении числа апудоцитов по отношению к контролю, уклады1 вающаяся в общую закономерность изменений апудоцитов при вторичном иммунном ответе. Показано участие апудоцитов ЖКТ в формировании «защитного барьера» кишечника у предварительно иммунизированных животных.
При воспроизведении экспериментальной холеры у предварительно иммунизированных животных появляется возможность оценки мобилизационных способностей функционально значимых систем организма биомодели (иммунной, нейроэндокринной и др.) в поддержании гомеостаза [5, 6, 8]. Далеко не всегда вакцинный препарат, обеспечивая защиту от инфекционного агента и, следовательно, предотвращая развитие классических клиникоанатомических проявлений болезни, способен защитить организм от стресса, обусловленного введением чужеродного антигенного материала, и предотвратить срыв компенсаторных резервов послед: него [2, 3]. Проблема «надежности биологических систем» все больше наполняется морфологическим содержанием и утрачивает прежнюю односторонне функциональную трактовку.
Цель нашего исследования заключалась в том, чтобы с помощью некоторых морфометрических характеристик оценить адаптационно-компенсаторные возможности иммунного организма при воспроизведении экспериментальной холеры.
Материалы и методы
Экспериментальная холера была воспроизведена на модели взрослых кроликов, зараженных внут-рикишечно V. cholerae eltor штамма Р 3122 в дозе 2109 м.к. по методу RITARD [16] в модификации
[13]. Животные опытных групп (I—II) за 14 дней до заражения были проиммунизированы различными противохолерными препаратами, любезно предоставленными доктором Werner Lubitz (Institute of Microbiology and-Genetics, University of Vienna):
I группа - двукратно с интервалом, в 14 дней в дозе 20 мг per os препаратом теней клеток холерных вибрионов :01 группы с пилями адгезии (VGG+TCP);-
II группа - двукратно с интервалом в 14 дней в дозе 20 мг per os препаратом теней клеток. холерных вибрионов 01 группы без пилей адгезии (VCG-TCP)
[14]. Животных -III опытной группы заражали холерными вибрионами без предварительной иммунизации: Контролем служили йнтактные кролики,-ко-торьш выполнялась процедура RITARD, но внутри-кишечно был введен физиологический раствор.
Патолого-анатомическое исследование проводили после умерщвления хлороформом животных, доживших до 5-х суток наблюдения. Для гистологического исследования были отобраны органы от кроликов с минимальными клиническими проявлениями холерной инфекции - с диареей, специфичность которой подтверждалась высевом холерных вибрионов. из материала ректальных мазков, или при отсутствии таковой, но с умеренными макроскопическими признаками гёмодинамических расстройств со стороны сосудов паренхиматозных органов и серозной оболочки тонкого кишечника.
. Гистологический материал помещали в 10 % водный нейтральный раствор формалина, дальнейшую обработку его проводили по общепринятой схеме [10]. Полутонкие парафиновые срезы окрашивали растворами гематоксилина и эозина для обзорной микроскопии и импрегнировали серебром по Гримелиусу [15]. В световом микроскопе при увеличении 200 проводили подсчет клеток в 50 полях зрения правильно ориентированных срезов. При выполнении морфометрического исследования соблюдали принципы стандартизации приготовления срезов и, подсчета клеток, руководствуясь пособием Г.Г.Автандилова [1]. Статистическую обработку полученных данных осуществляли по соответствующим рекомендациям Б. С.Бессмертного [4].
Результаты и обсуждение
Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) у предварительно иммунизированных животных играет роль мощного лимфоидного органа, где происходит формирование местного «защитного барьера» путем мобилизации энтероцитов, межэпителиальных лимт фоцитов (МЭЛ), бокаловидных клеток и апудоцитов [7]. У предварительно иммунизированных кроликов после заражения превалировали признаки продуктивной реакции - увеличение числа МЭЛ и активация их митотической активности, как следствие антигенной стимуляции, повышение количества плазматических клеток в строме ворсин и собственной пластинке слизистой оболочки, а проявления альтерации и экссудации были минимальными - в виде умеренного, чаще очагового отека стромы ворсин,
очагового полнокровия сосудов подслизистой оболочки и собственной пластинки слизистой, гидро-пической дистрофии отдельных клеток эпителиальной выстилки ворсин.
У переживших инфекцию интактных кроликов,: в отличие от предварительно иммунизированных До заражения животных, при гистологическом исследовании наблюдали остаточные проявления острого энтерита с развитием более выраженных альтера-тивных и экссудативных изменений (очаговая вакуольная дистрофия эпителия ворсин, некроз отдельных эпителиоцитов, гидропическая дистрофия эпителия желез подслизистой оболочки, выраженный очаговый отек, подслизистой оболочки и стромы ворсин, умеренная гиперплазия клеток стромы ворсин и МЭЛ, опустошение бокаловидных клеток).
Оценка нейроэндокринного компонента как неспецифического регулятора иммунологических процессов проводилась по состоянию апудоцитов в слизистой оболочке различных отделов ЖКТ, лимфоидных образованиях кишечника, мезентериальных лимфатических узлах и селезенке. Для анализа реакции апудоцитов ЖКТ были выбраны 3 отдела: двенадцатиперстная кишка, где содержится значительное количество апудоцитов с разнообразным гормональным профилем в силу функциональных особенностей этого отдела ЖКТ; подвздошная'кишка как место, где разворачивается основной патологический процесс при заражении подопытных кроликов по методу RIT ARD [8]; проксимальная петля ободочной кишки.
Изучение реакции апудоцитов у зараженных холерными вибрионами кроликов выявило ряд количественных (таблица) и морфофункциональных изменений этих клеток. Используемая для заражения доза вирулентных холерных вибрионов вызывала у предварительно иммунизированных против холеры животных достоверное увеличение количества клеток APUD-системы в двенадцатиперстной кишке по сравнению с аналогичным показателем у интактных кроликов и некоторое превышение значения показателя по сравнению с контролем у животных I опытной группы. Морфофункциональное состояние апудоцитов характеризовалось резким опустошением клеток в группе интактных зараженных кроликов и относительным функциональным «покоем» в группах предварительно иммунизиро-
Количество апудоцитов при экспериментальной холерной инфекции у взрослых кроликов (М+ш)
Объект Опытные группы Контроль
исследования I II III
Двенадцатиперстная кишка 4,15+1,69" 3,3+0,93" 2,0±0,12* 3,5±0,32
Подвздошная кишка 2,4+0,89 1,7+0,82 2,3±0,62* 2,9+0,61
Толстая кишка 2,25+0,84” 1,5±0,61 * 1,5±0,66* 2,3+0,64
Селезенка 2,2±0,89‘‘" 2,6±0,78 !,7±0,61 1,7+0,32
Мезентериальные 4,1+1,98"’ 4,2+0,46"* 2,7±0,61 2,1 ±0,92
лимфатические узлы
Пейеровы бляшки 4,35+0,89*“ 4,38±1,71*" 1,6±0,82 2,2±0,92
Аппендикс 11,7+1,17"' 8,2+2,55'" 5,4+2,32 4,1 ±2,44
ванных животных (рисунок, а), где отмечали незначительное увеличение числа опустошенных клеток по сравнению с аналогичным показателем в контроле на фоне появления умеренного числа гистохимически активных апудоцитов. ■
о н т р о л
группы
• р<0,05 по сравнению с контролем; р<0,05 по сравнению с по-, казателями в III группе; р<0,05 по сравнению с контролем и показателями в III группе.
Контрол
в
■Морфофуикциональное состояние апудоцитов желудочно-кишечного тракта при воспроизведении холерной инфекции на взрослых кроликах: а - в двенадцатиперстной кишке; б - в подвздошной кишке; в - в толстом кишечнике:
По оси абсцисс - кол-во клеток в различном морфофункциональном состоянии, %; по оси ординат - номера экспериментальных групп — клетки в состоянии функционального покоя;.'
- опустошенные клетки; Г
у - гистохимически активные клетки
В подвздошной кишке во всех опытных группах имело место снижение общего числа апудоцитов по сравнению с контролем, но резкое опустошение клеток отмечалось только в группе' интактных зараженных кроликов, тогда как у предварительно иммунизированных животных морфофункциональное состояние апудоцитов не было резко нарушено, а показатели опустошения и накопления секрета в них были в пределах контрольных значений (рисунок, б).
В толстом китпечнике количество апудоцитов в I опытной группе достоверно выше, чем аналогичные показатели у интактных зараженных кроликов, но практически не отличалось от контроля. ,Во II и
III группах количество клеток АР1Л)-системы достоверно снижено по отношению к контрольным показателям. Морфофункциональное состояние апу-
доцитов1 этого отдела ЖКТ характеризовалось различной степенью опустошения клеток во всех опытных группах (рисунок, в).
При гистологическом исследовании у предварительно привитых животных, выживших после заражения, обнаруживали, в отличие от группы ин-тактных зараженных кроликов, четкие признаки вторичного иммунного ответа как в периферических органах иммунной системы, так и в лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником. Размеры фолликулов в мезентериальных лимфатических узлах и мальпигиевых телец в селезенке после заражения были заметно крупнее у предварительно привитых кроликов, чем у интактных зараженных животных. Активность Т- и В-зон лимфоидных органов у последних была невысокой, либо отсутствовала. У предварительно иммунизированных кроли: ков гиперплазия клеток в них и накопление бласти-ческих элементов достигали значительной степени выраженности, что отражало формирование наиболее полноценной иммунной реакции после заражения у предварительно иммунизированных животных в отличие от интактных. .
Количество аргирофильных элементов в периферических органах иммунитета (селезенка и мезентериальные лимфатические узлы) у предварительно иммунизированных животных после заражения было достоверно выше контрольных значений и аналогичных показателей у интактных зараженных кроликов (таблица). Эти клетки чаще выявлялись в центрах фолликулов лимфатических узлов и в Т-зонах селезенки.
В лимфоидной ткани кишечника (пейеровых бляшках, аппендиксе) предварительно иммунизированных животных после заражения наблюдали признаки активации Т- и В-зон, накопление плазматических клеток и плазмобластов в купольной части лимфоидных образований. Общая направленность реакции нейроэндокринных клеток лимфоидных структур, ассоциированных с ЖКТ, на заражение холерными вибрионами соответствовала вышеописанным закономерностям и заключалась в достоверном повышении количества аргирофильных клеток у предварительно иммунизированных кроликов по сравнению с аналогичными показателями в контроле и группе интактных зараженных животных. Некоторое увеличение числа аргирофильных клеток в лимфоидных образованиях, ассоциированных с ЖКТ, отмечено и в группе интактных зараженных животных. Достаточно высокой была активность аргирофильных элементов аппендикса у предварительно иммунизированных животных в силу особой роли этого органа у кроликов [11]. В пейеровых бляшках аргирофильные клетки чаще встречались в куполе и отчасти в эпителии, ассоциированном с фолликулами (ЭАФ).
Описанные изменения количества и морфофункционального состояния апудоцитов в иммуно-компетентных органах отчасти отражают регуляторные свойства синтезируемых ими гормонов (серотонин, гистамин). Под действием этих и других гуморальных медиаторов в селезенке и других лимфоидных органах происходит активное антителооб-разование [9]. Мобилизация нейроэндокринного окружения иммунокомпетентных органов привитых кроликов, заключающаяся в достоверном (р<0,05) увеличении числа апудоцитов по отношению к кбн-
тролю, свидетельствует об усилении синтеза биологически активных. веществ в - них и характеризует стадию ограничения интенсивности иммунопатологических реакций при введении вирулентных холерных вибрионов, что укладывается в общую закономерность изменений апудоцитов при вторичном иммунном ответе [9, 12]. -
Таким образом, выявлены нарушения компенсаторных возможностей в организме интактных животных при заражении их вирулентными холерными вибрионами, несмотря на легкое клиническое течение инфекционного процесса у этих кроликов., В определенной мере срыв компенсаторных возможностей в организме биомоделей на тканевом уровне характеризовали реакция апудоцитов ЖКТ и иммунокомпетентных органов, изменение соотношения различных клеточных популяций, гистологические проявления гемодинамических нарушений, отека; экссудации. В то же самое время вирулентные холерные вибрионы, введенные внутрики-шечно предварительно иммунизированным животным, оказывали менее выраженное неблагоприятное воздействие, на их организм. У предварительно иммунизированных кроликов в ЖКТ формировался определенный «защитный барьер» из плазматических ' клеток, МЭЛ, • активных зон в лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником. Адаптационные реакции организма характеризовало и состояние клеток нейроэндокринной системы. Проведенное исследование позволило глубже охарактеризовать адаптационные возможности и компенсаторные резервы организма биомодели и показать участие апудоцитов различных функционально значимых систем предварительно иммунизированных животных в адаптации к экспериментальной холере.
' СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометркя. - М.: Медицина, 1990. - 379 с. - 2. Адамов А.К. Иммунология холеры. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1981. - 319 с. - 3. Белов Л.Г. Патогенёз функциональных и метаболических расстройств при холерной интоксикации и вакцинации: Автореф. дис. ... д-pä мед. наук. - Саратов, 1994. - 37 с. - 4. Бессмертный Б.С. Математическая статистика в клинической, профилактической и экспериментальной медицине. - М.: Медицина,
1967,- 303 с. - 5. Бугоркова С. А., Исупов И.В., Назарова Л.С./Елисеев Ю.Ю.//ЖМЭИ. - 2001.- №4,-С. 27-31.-6. Бугоркова С.А., Задумина С.Ю., Исупов И.В. и др. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2003. -Вып. 86. - С. 108—116. - 7. Ипатов Ю.П., Комарова Л.Г., Переслегина И.А., Шабунина Е.И. Ключи к проблеме гастроэнтерологических заболеваний у детей. - Нижний Новгород, 1997.- 217 с. - 8. Исупов И.В., Бугоркова С. А., Кутырев В.В. Патоморфологические аспекты доклинических испытаний различных вакцин против чумы,-сибирской язвы и холеры. - Саратов, 2004. - 179 с. - 9. Кветной И.М., Бал-масова И.П., Смородинов А.П.// Бюл. эксп. биол. -1983.- №9.- С. 78-79. - 10. Меркулов Г. А. Курс патогистологической техники. - М.: Медицина, 1969. - 423 с. -11. Синельников Е.И. // Физиол. журн. СССР. - Т. XXX, вып. 6. ^ 1941. - С. 14-16. - 12. Щуковская Т.Н. // Аллер-гол. и иммунол. - 2000. - Т. 1, № 2. - С. 110-111. - 13. Ähren С.i Svennerholm A. - М.//Infect. Immun. - 1985,- Vol. 50, N 1. - P. 255-267. - 14. Eko F.О., Schukovskaya T.N., Lotzmanova E.V.. et al. II Vaccine. - 2003.- Vol. 21. -P. 3663-3674. -15. Grimelius L. // Acta Soc. Med. upsaliensis. -
1968.- Vol. 73. - P. 243-270. - 16. Spira W.M., Sack R.B.,
Frocnlich- I.L. // Infect. Immun. - 1981. - Vol. 32, N2. -P. 739-747. . . .
S.A.Bughorkova, C.Yu.Zadumina, T.N.Shchukovskaya, V.V.Kutyrev
A Study of Adaptation Compensatory Capabilities of an Immune Organism Challenged with Cholera
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe”, Saratov
Analyzed in the work were some morphometric characteristics, especially, apudocyte responses of functionally important systems in preimmunized adult rabbits after reproducing cholera infection in them with the aim of assessing the adaptation and compensatory abilities of a macroorgantsm.
The neuro-endocrine milieu around the immunocompetent organs of the immunized rabbits was shown to be activated manifesting significant increase (p<0.05) of apudocyte numbers as compared to those of the controls that was in conformity with the general laws of apudocyte change in case of secondary immune responses. The apudocytes of the gastro-intestinal tract demonstrated their important role in forming the protective barrier in the intestine of preimmunized mammals.
Поступила 01.12.04
УДК 616.981.452:636.91 .
С.М.Дальвадянц1, М.КХДубровин2, А.А.Бывалов2, Н.П.Додонов2, Ю.В.Чичерин2, В.И.Евстигнеев2, Е.В.Пименов2, СА.Еремин1, И.А.Дятлов1, В-В-Кутырев1
ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ИММУНИЗАЦИИ ПРОТИВ ЧУМЫ.
Сообщение 3. Ревакцинирующие свойства живой чумной вакцины и препаратов чумных химических вакцин для павианов гамадрилов
'Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов;
2Научно-исследователъсктй институт микробиологии МО РФ, Киров
На павианах гамадрилах, первично привитых аэрогенно живой чумной вакциной (ЖЧВ), проведены сравнительные исследования реактогенности и ревакцинирующей активности ЖЧВ и двух экспериментальных «химических» вакцин. Первая из них представлена комплексом антигенов чумного микроба - Ф1 и основного соматического антигена, вторая - депонированным на геле гидроокиси алюминия антигеном Ф1. Установлено, что препараты химических вакцин менее реактогенны, чем ЖЧВ. Все испытанные вакцинные препараты значительно повышают специфическую резистентность к аэрогенному заражению чумой.
Многочисленные исследования, выполненные в последние десятилетия на экспериментальных животных различных видов (белые мыши, морские свинки, павианы гамадрилы и др.), а также испытания на волонтерах свидетельствуют о необходимости совершенствования средств и методов вакцино-профилактики чумы. Одним из перспективных подходов в этом направлении является рациональное применение живой вакцины для грундиммунизации и «химических» вакцин, представляющих собой очищенные высокоактивные протективные антигены, для индукции вторичного ответа, характеризующегося, в первую очередь, быстрым подъемом специфической резистентности и реализующегося в условиях . проведения антибиотикопрофилактики или антибиотикотерапии [3, 5, 6, 7, 15].
Известно, что эффективность чумных вакцинных препаратов существенно различается при их оценке на лабораторных животных различных видов. В частности, антиген Ф1 обладает высокими протективными свойствами для белых мышей, но слабо защищает от экспериментальной чумы морских свинок. До настоящего времени отсутствует общепринятая точка зрения о том, какой из видов животных должен использоваться для наиболее адекватного моделирования иммунного и инфекционного процессов у человека. Наиболее убедительными' следует рассматривать результаты исследований восприимчивости к чуме и патогенеза этого за: болевания, а также оценки реактогенности и эффективности чумных вакцин, выполненных на высших приматах, что объясняется их филогенетической близостью к человеку [3]. Приматы в качестве экс-
периментальной биомодели стали использоваться вскоре после открытия возбудителя чумы. "Однако определенные сложности проведения экспериментов на обезьянах и дороговизна исследований ограничили их использование в последующем. '
В настоящей работе на павианах гамадрилах, первично привитых живой чумной вакциной (ЖЧВ), проведены исследования реактогенности и ревакцинирующей активности живой чумной вакцины и двух экспериментальных «химических» вакцин. Первая из них представляла комплекс двух антигенов: Ф1 и основного соматического антигена (ОСА) в соотношении по массе 1:2, вторая - депонированный на геле гидроокиси алюминия антиген Ф1.
Схема опыта включала первичную ингаляционную иммунизацию павианов ЖЧВ, подкожную ревакцинацию через 6 мес. препаратами Ф.1+ОСА, Ф1, ЖЧВ и последующее аэрогенное заражение культурой возбудителя чумы через 120 сут после ревакцинации. Такая схема эксперимента позволяла определить не только относительную напряженность противочумного иммунитета после ревакцинации указанными препаратами, но и продолжительность сохранения иммунитета.
Эксперименты проводились на павианах гамадрилах обоего пола массой 3-14 кг. После карантина (60 сут) животных иммунизировали ингаляци-онно живой чумной сухой вакциной : НИИС (сер. 180, к. № 886). Суспензию ЖЧВ в 10 % растворе лактозы диспергировали с помощью. распы-лителя типа РВ [13]. Определяли концентрацию микробных тел в воздухе и затем рассчитывали ас-пирационную дозу, которая варьировала в пределах
