CC BY
30
Испытательный стенд
для перфузионного кондиционирования трансплантатов органов
Резюме. Представлен испытательный стенд для машинной перфузии, в котором можно разместить орган любого размера. Результаты экспериментально-клинического исследования жизнеобеспечения ткани донорской поджелудочной железы с использованием гипотермической машинной перфузии с оксигенацией перфузирующего раствора свидетельствуют о высокой эффективности применяемой технологии динамической консервации.
Ключевые слова: перфузионное кондиционирование, испытательный стенд, машинная перфузия эксплантированных донорских органов.
Актуальной задачей современной трансплантологии является расширение границ существующих критериев для использования донорских органов. Например, в Великобритании в около 42% случаев печень забирается у так называемых «маргинальных доноров» [2]. Это закономерно снижает однолетнюю выживаемость граф-та приблизительно на 10%, сопряжено с развитием отдаленных осложнений, существенно влияет на долгосрочный результат лечения, на частоту ретрансплантаций, качество жизни и стоимость оказанной помощи.
Кондиционирование органа (КО) представляет собой комплекс мероприятий по сохранению структурной целостности, жизнеспособности и функциональной состоятельности его клеток после эксплантации. Наиболее распространенным вариантом КО
после эксплантации в условиях ex vivo является статическая холодовая консервация (СХК). Однако гипотермия биологических тканей при СХК не до конца решает проблему метаболических запросов и активности катаболиче-ских ферментов в них. В любом эксплантированном органе развивается целый каскад типовых патобиологических процессов, при этом гипоксия тканей такого органа, безусловно, играет ведущую роль, несмотря на проводимую гипотермию.
В последние десять лет уделяется большое внимание развитию новых динамических методов консервации, позволяющих оптимизировать орган перед имплантацией и таким образом улучшить долгосрочные результаты лечения [3, 4]. Технология перфузионного кондиционирования трансплантатов органов позволяет обеспечить
термостабилизацию, создать условия для искусственной циркуляции через трансплантаты органов ex vivo консервирующего раствора, удалить продукты метаболизма и ката-болические ферменты, доставить энергетические субстраты, обеспечить защиту микро-циркуляторного русла от коллапса и обеспечить доставку тканям кислорода.
Положительный опыт применения технологий перфузи-онного кондиционирования трансплантатов органов частично реализуется через коммерческие модели аппаратов для машинной перфузии. Это приборы LifePort Kidney Transporter и RM3 (США), Kidney Assist (Нидерланды) для почек [5, 6]. Созданы приборы для машинной перфузии печени: Metra-normothermic perfusion, Life Port Liver Transporter, Liver Assist [7, 8]. Для перфузионно-го кондиционирования трансплантатов поджелудочной
Параметр Спецификация
Тип насосов Перистальтический
Емкость резервуара ~10 литров
Скорость потока Дискретная регулировка в диапазоне 60^220 мл/мин с шагом ~ 15 мл/мин
Давление Дискретная регулировка в диапазоне 1^10 мм рт. ст. с шагом ~ 1 мм рт. ст.
Термостабилизация (при объеме рабочего раствора 2 литра) В диапазоне 3^7 °С
Допустимая температура окружающей среды В диапазоне 1^30 °С
Система газонасыщения Подача газа из баллона. Скорость подачи газа в диапазоне 1^15 л/мин
Управление Ручная регулировка скорости потока, температуры, степени оксигенации
Контроль (индикация) - температура термостабилизации рабочей жидкости (°С); - парциальное давление газа в рабочей жидкости (мм рт. ст.); - текущее время/дата (дд. мм. гг.)
Интерфейс РС-мониторинг всех перечисленных параметров
Санитарно-эпидемиологические требования Внутренний контур аппарата стерилен
Питающая сеть 220 В, 12 В
железы и универсальных приборов для машинной перфузии не создано [9, 10].
В рамках инновационного проекта по разработке и внедрению технологии перфузи-онного кондиционирования трансплантатов органов нами совместно с инженерами компании «СоларЛС» был сконструирован универсальный испытательный стенд для машинной перфузии экспланти-рованных донорских органов. Проверка его эффективности проведена при экспериментально-клинической оценке жизнеобеспечения ткани донорской поджелудочной железы в условиях гипотермиче-ской машинной перфузии с ок-сигенацией перфузирующего раствора.
Такой аппарат подходит для размещения любого по размеру органа: почки, комплекса двенадцатиперстной кишки -поджелудочной железы - селезенки, печени.
Поскольку стенд создавался для исследовательских целей, в его дизайн заложены максимальные диапазоны регулировки всех основных параметров перфузии трансплантатов органов. В первую
очередь речь идет о специальных настройках режимов: температура, скорость протока, давление, уровень оксигена-ции (таблица).
Испытательный стенд перфузии представляет собой цельную конструкцию: в общем каркасе размещены отдельные части устройства, обеспечивающие процесс перфузии (рисунок).
Центральной частью конструкции является резервуар (1) для донорской ткани. Для снижения энергоемкости системы и повышения уровня автономности всего устройства резервуар помещен в термоизоляционную «рубашку», которая снижает влияние температуры окружающей среды на температуру его внутренней полости.
1 - резервуар с органом, 2 - фильтр,
3 - перфузионная магистраль для забора консервирующего раствора,
4 - перистальтический насос оттока,
5 - перфузионная магистраль для подключения к донорской ткани,
6 - перистальтический насос притока, 7 - регулятор скорости потока,
8 - баллон с газом, 9 - оксигенатор, 10 - пеноуловитель, 11 - резервуар-отстойник, 12 - блок охлаждения, 13 - теплообменник, 14 - система датчиков, 15 - измеритель оксигенации и температуры
Таблица. Основные параметры устройства для консервации донорской ткани
Рисунок.
Блок-схема
испытательного
стенда для
машинной
перфузии
с оксигенацией
перфузирующего
раствора
Фильтр (2), установленный в начале перфузионной магистрали (3) для забора консервирующего раствора, обеспечивает очистку рабочей жидкости при ее оттоке из емкости.
Циркуляцию консервирующего раствора из резервуара в устройство газонасыщения по перфузионной магистрали для забора консервирующего раствора обеспечивает работа перистальтического насоса оттока (4); консервирующий раствор в донорскую ткань по пер-фузионной магистрали (5) для подключения к донорской ткани продвигает перистальтический насос притока (6). Регулятор потока (7) перистальтических насосов позволяет плавно и в широком диапазоне регулировать скорость потока раствора, оптимизируя ее под требования консервации.
Устройство газонасыщения содержит баллон (8) с газом, подключенный к оксигенатору (9), который снабжен пено-уловителем (10) (средство стабилизации оксигенированного раствора в условиях использования оксигенатора проточного типа) и резервуаром-отстойником (11) (место, где насыщенный кислородом и очищенный от пены консервирующий раствор накапливается для дальнейшей прокачки).
Блок охлаждения (12), расположенный по ходу перфу-зионной магистрали для подключения к донорской ткани, содержит теплообменник (13) проточного типа, выполненный на основе пельте-элемен-тов, и позволяет охладить ок-сигенированный консервирующий раствор до целевой температуры.
Устройство снабжено системой датчиков (14) температуры и оксигенации, с корпусом проточного типа;
информация регистрируется измерителем (15). Испытательный стенд компактный и мобильный, выполнен с возможностью работы от сети или автономного источника тока, внутренний контур устройства стерилен.
Ключевой фактор упрощения и удешевления конструкции - использование в качестве компонента перфузионной рабочей жидкости препарата, содержащего перфторуглероды. Это вещество с кислородтранс-портной функцией позволило отказаться от дорогого одноразового мембранного оксигенатора и от применения цельной крови или раствора, содержащего изолированные эритроциты, что способствовало отсутствию тромбозов микро-циркуляторного русла донорской ткани и минимизировало риск развития инфекционных осложнений.
Нами проведено экспериментально-клиническое исследование жизнеобеспечения ткани донорской поджелудочной железы с применением ги-потермической машинной перфузии с оксигенацией перфузи-рующего раствора на разработанном испытательном стенде.
Эксплантация органоком-плекса «двенадцатиперстная кишка - поджелудочная железа - селезенка» проводилась у доноров со смертью мозга и бьющимся сердцем по классической методике. Возраст доноров поджелудочной железы составил 44 (35; 55) года, индекс массы тела доноров - 25,3 (22; 27) кг/см2, длительность проводимой ИВЛ - 96 (48; 143) часов, уровень глюкозы крови доноров - 12,1 (10; 17) ммоль/л, уровень амилазы крови - 57 (23; 80) ед/л. Температура органо-комплекса в конце флашинга 10 литрами холодного (+4 °С)
раствора кустодиола составила 11,8 (10; 13) °С, в конце транспортировки - 7,8 (5; 10) °С. Исходная масса органокомплек-са до начала экспериментальной перфузии - составила 350 (250; 510) г.
После перевязки мелких притоков органокомплекс помещали в емкость с консервирующим раствором, где путем канюляции верхнебрыжеечной и селезеночной артерий выполняли подключение сосудов донорской ткани к перфу-зионным магистралям испытательного стенда. В качестве консервирующего раствора применяли смесь охлажденного до +4 °С кустодиола с пер-фтораном, взятых в соотношении 20:1.
После включения испытательного стенда консервирующий раствор перистальтическим насосом оттока направлялся по перфузионной магистрали из емкости через фильтр в устройство газонасыщения. В процессе пер-фузионной консервации в растворе появлялись вымываемые из донорской ткани конгломераты клеток крови в виде микросгустков, обрывки жировой и соединительной ткани. Фильтр очищал перфузионный раствор от указанных нежелательных компонентов, что способствовало профилактике нарушений проходимости ми-кроциркуляторного русла донорской ткани, повреждения ее эндотелия, усугубления ишемии ее клеток.
В устройстве газонасыщения консервирующий раствор вначале доставлялся в нижнюю часть пеноуловителя, где расположен оксигенатор, подключенный к баллону с газом. В применяемом оксигенаторе консервирующий раствор орошался большим количеством
пузырьков кислорода, подаваемого из баллона, а затем проходил через пеноуловитель и стекал в резервуар-отстойник. Уровень подачи кислорода регулировали в зависимости от показаний измерителя оксигенации от 1 до 3 л/мин.
Насос притока обеспечивал нагнетание оксигенированно-го консервирующего раствора по перфузионной магистрали в блок охлаждения с теплообменником и далее через камеру системы датчиков контроля температуры и оксигена-ции в сосуды донорской ткани. Информация с датчиков отображалась в режиме реального времени на измерителе ок-сигенации и температуры. Это позволяло контролировать насыщенность перфузирующе-го раствора кислородом и при необходимости регулировать степень проводимой оксиге-нации. Парциальное давление кислорода в перфузионном растворе поддерживали на уровне 250-350 мм рт. ст.
Регулятор потока настраивали на перфузию со скоростью 100 мл/мин. Температуру поддерживали на уровне +4 °C. Внутренний контур устройства сохранялся стерильным. Гипо-термическую перфузионную консервацию с дополнительной оксигенацией проводили в течение 4 часов, после чего органокомплекс отсоединяли от устройства.
Далее в стерильных условиях от поджелудочной железы отделяли селезенку, двенадцатиперстную кишку, крупные сосуды и жировую ткань, производили канюляцию прото-ковой системы. Последнюю передавали в лабораторию клеточных биотехнологий, где после ферментативной обработки осуществляли выделение островков Лангерганса.
Испытательный стенд применялся при работе с 8 донорскими поджелудочными железами.
Основные результаты проведенных экспериментов (Me (25; 75)):
■ Масса поджелудочной железы -106,8 (87; 119) г
■ Температура органокомплекса, конец флашинга - 11,8 (10; 13) °C Температура органокомплекса, конец транспортировки - 7,8 (5; 10) °C
■ Температура консервации - 5,1 (3; 7) °C
■ Общее время холодовой ишемии -588 (420; 780) мин
■ Парциальное давление кислорода в консервирующем растворе через 4 часа эксперимента - 298,2
(174; 483) мм рт. ст.
■ Лактат через 4 часа эксперимента -0,56 (0,2; 1,2) ммоль/л.
Количество выделенных островковых комплексов -750 040 (40 600; 1 182 028).
Применяемая технология позволила эффективно переключить обмен веществ в клетках органа с анаэробного на аэробный (сохранение низкого уровня лактата). Количество выделенных островковых комплексов из одной поджелудочной железы составило 750 040 (40 600; 1 182 028), что является достаточным для проведения ал-логенной трансплантации среднестатистическому реципиенту с сахарным диабетом 1-го типа. Жизнеспособность островковых клеток в методе по исключению трипанового синего после выделения и в процессе культивирования in vitro составила 99%.
Полученные показатели обмена веществ, а также количество выделенных островковых комплексов указывают на высокую эффективность применяемой технологии динамической консервации в поддержании жизнеспособности донорской ткани в условиях
гипотермии. Гипотермическая машинная перфузия поджелудочной железы с дополнительной оксигенацией на испытательном стенде - эффективный способ жизнеобеспечения островков Лангерганса.
Дальнейшие исследования по разработке и внедрению методов перфузионного кондиционирования перспективны. СИ
Статья поступила в редакцию 01.06.2016 г.
A.М. Федорук1, Н.М. Яковец1, Д.А. Федорук1, Л.В. Кирковский1,
B.А. Ленкевич2, Е.В. Гулевич2, О.О. Руммо1
1РНПЦ трансплантации органов и тканей на базе 9-й городской клинической больницы, Минск
2Компания «СоларЛС»
Summary
Designed and engineered test bed for machine perfusion can accommodate any size organ. The results of experimental and clinical study of the donor pancreas tissue life-support using hypothermic machine perfusion with perfused solution oxygenation indicate the high efficiency of the dynamic conservation technology used to keep the donor tissue viability in hypothermia.
ff See: http://innosfera.by/2016/08/organ_grafts
Литература
1. Kim W. et al. Deaths on the liver transplant waiting list: an analysis of competing risks // Hepatology. 2006. Vol.43, N345. P. 351.
2. Dutkowski P. et al. Is single portal vein approach sufficient for hypothermic machine perfusion of DCD liver grafts? // J. Hepatol. 2015. N63. P. 1154-1158.
3. Schlegel A. et al. Hypothermic oxygenated liver perfusion: basic mechanisms and clinical application // Curr. Transpl. Rep. 2015. Vol.2, N52. P. 62.
4. Leeser D. B. et al. Pulsatile pump perfusion of pancreata before human islet cell isolation // Transplant. Proc. 2004. N36. P. 1050-1051.
5. Moers C. et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation // N. Engl. J. Med. 2009. N360. P. 7-19.
6. Burdick J. F. et al. National impact of pulsatile perfusion on cadaveric kidney transplantation // Transplantation. 1997. N64. P. 1730-3.
7. Brassil J. et al. Machine perfusion of the liver: past, present and future // Curr. Opin. Organ Transplant. 2010.Vol.15, N2, с. 160-6.
8. Pepijn D. et al. Machine perfusion in liver transplantation as a tool to prevent non-anastomotic biliary strictures: rationale, current evidence and future directions // J. Hepatol. 2015. N63. P. 265-275.
9. Karcz M. H. et al. An ex-vivo model for hypothermic pulsatile perfusion of porcine pancreata: hemodynamic and morphologic characteristics // Experim. Clin. Transplantation. 2012. Vol.2, N10. P. 87-100.
10. Taylor M. J. et al. Twenty-four hour hypothermic machine perfusion preservation of porcine pancreas facilitates processing for islet isolation // Transplant. Proc. 2008. N40. P. 480-482.
