Научная статья на тему 'Использование волокнистых материалов из поликапролактона, необлученных и облученных пучком быстрых электронов, для изготовления протезов сосудов малого диаметра'

Использование волокнистых материалов из поликапролактона, необлученных и облученных пучком быстрых электронов, для изготовления протезов сосудов малого диаметра Текст научной статьи по специальности «Нанотехнологии»

CC BY
52
10
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Аннотация научной статьи по нанотехнологиям, автор научной работы — Степанова Алёна Олеговна, Черноносова Вера Сергеевна, Лактионов Павел Петрович

Одной из перспективных технологий, которую можно использовать для изготовления протезов сосудов малого диаметра является метод электроспиннинга. 3Д матриксы, изготовленные методом электроспиннинга из поликапролактона (ПКЛ) не токсичны для клеток, однако для того, чтобы успешно использовать этот полимер для изготовления протезов сосудов желательно повысить прочность таких изделий, и особенно прочность в области упругой деформации. Было обнаружено, что облучение волокнистых материалов из ПКЛ пучком быстрых электронов с дозой облучения от 25-200 кГр приводит к повышению прочности, причем облучение дозой 25 кГр не влияет на физические свойства протезов сосудов, изготовленные методом электроспиннига и может быть использовано для их стерилизации, а облучения дозой 100 кГр позволяет повысить прочность протезов в области упругой деформации почти вдвое.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по нанотехнологиям , автор научной работы — Степанова Алёна Олеговна, Черноносова Вера Сергеевна, Лактионов Павел Петрович

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Использование волокнистых материалов из поликапролактона, необлученных и облученных пучком быстрых электронов, для изготовления протезов сосудов малого диаметра»

Выводы

1. Показано, что адаптированный вариант пандемического ВГ A(H1N1) pdm09 и высокопатогенный ВГА/Н5Ш при интерстициальном инфицировании экспериментальных мышей линии BALB/c вызывают развитие интерстициальной пневмонии с летальным исходом к 10 суткам наблюдения.

2. ВГ A/H5N1 в отличии от A(H1N1) pdm09 начинает активно разрушать структуры легкого с первых суток, затем его патоморфологическая активность снижается. При этом отмечается большее воздействие ВГ A/H5N1 на респираторный отдел, по сравнению с воздухопроводящими путями легких.

3. ВГ A(H1N1) pdm09 охарактеризован поздним по сравнению с ВГ A/H5N1 проявлением вирулентного эффекта на ткани лёгких, но при этом отмечается более тяжелые повреждения респираторной ткани к 10 суткам после инфицирования.

Список литературы

1. Романовская А.А., Шаршов К.А., Зайковская А.В., Дурыманов А.Г., Шестопалов А.М.// Патент на изобретение RUS 2451072 18.10.2010

2. Dawood F. S. et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: modelling study //The

Lancet infectious diseases. - 2012. - Т. 12. - №. 9. -С. 687-695.

3. De Jong J.C., Claas E.C.J., Osterhaus A.D.M.E., Webster R.G., Lim W.L. A pandemic warning? // Nature. -1997.-V. 389.-P. 554.

4. Lu X., Tumpey T.M., Morken T., Zaki S.R., Cox N.J., Katz J.M. A mouse model for the evaluation of pathogenesis and immunity to influenza A (H5N1) viruses isolated from humans //Journal of virology. - 1999. -V. 73. - N. 7. - P. 5903-5911.

5. Neumann G., Noda T., Kawaoka Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus //Nature. - 2009. - V. 459. - N. 7249. - P. 931-939.

6. Shortridge K.F., Gao P., Guan Y., Ito T., Kawaoka Y., Markwell D., Takada A., Webster R.G. Interspecies transmission of influenza viruses: H5N1 virus and a Hong Kong SAR perspective // Veterinary Microbiology - 2000. - V.74. - P. 141-147.

7. Pandemic (H1N1) 2009—update 102. World Health Organization. [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.who.int/csr/ don/2010_05_28/en/index.html (Дата обращения: 29.11.2014).

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВОЛОКНИСТЫХ МАТЕРИАЛОВ ИЗ ПОЛИКАПРОЛАКТОНА, НЕОБЛУЧЕННЫХ И ОБЛУЧЕННЫХ ПУЧКОМ БЫСТРЫХ ЭЛЕКТРОНОВ, ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПРОТЕЗОВ СОСУДОВ МАЛОГО ДИАМЕТРА

Степанова Алёна Олеговна12

младший научный сотрудник Черноносова Вера Сергеевна1'2

к.х.н., младший научный сотрудник Лактионов Павел Петрович1'2

к.б.н., ведущий научный сотрудник 'Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия 2Институт патологии кровообращения им. ак. Е.Н. Мешалкина, Новосибирск, Россия

АННОТАЦИЯ

Одной из перспективных технологий, которую можно использовать для изготовления протезов сосудов малого диаметра является метод электроспиннинга. 3Д матриксы, изготовленные методом электроспиннинга из поликапролактона (ПКЛ) не токсичны для клеток, однако для того, чтобы успешно использовать этот полимер для изготовления протезов сосудов желательно повысить прочность таких изделий, и особенно прочность в области упругой деформации. Было обнаружено, что облучение волокнистых материалов из ПКЛ пучком быстрых электронов с дозой облучения от 25-200 кГр приводит к повышению прочности, причем облучение дозой 25 кГр не влияет на физические свойства протезов сосудов, изготовленные методом электроспиннига и может быть использовано для их стерилизации, а облучения дозой 100 кГр позволяет повысить прочность протезов в области упругой деформации почти вдвое.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № '4-15-00493.

Введение

В России выполняется не менее 20 000-операций в год по замене участков сосудистого русла протезами из полимерных материалов. Протезирование сосудов жизненно необходимо при реконструкции коронарного кровообращения, сахарном диабете, зачастую

приводящему к облитерирующему атеросклерозу сосудов нижних конечностей. Основные требования к свойствам, которыми должен обладать сосудистый протез были сформулированы еще в середине прошлого века [4]. В соответствие с этими требованиями протезы сосудов должны быть гемо- и биосовместимы (нетромбогенны, нетоксичны), должны обладать требуемой физической прочностью, эластичностью, быть устойчивыми к формированию окклюзий и аневризм, обладать оптимальной пористостью. Большинство используемых тканных, плетеных или вязаных сосудистых протезов из синтетических материалов, таких как лавсан или политетрафторэтилен, имеют ряд серьезных недостатков, в частности недостаточную эластичность и биосовместимость. Важным недостатком является образование слоя неоинтимы, инициации процессов, приводящих к уменьшению и закупориванию просвета протеза, и необходимости повторного оперативного вмешательства для замены протеза или для устранения возникших дефектов [1]. Основным способом увеличения гибкости, эластичности и устойчивости к перекручиванию сосудистых протезов, является гофрирование стенки протеза, однако этот способ не подходит для изготовления сосудов малого диаметра (меньше 6 мм). Действительно гофрирование приводит к замедлению тока крови в пристеночном слое,

образованию толстого слоя неоинтимы и закупорке сосуда. Введение в протезы сосудов конструкционных элементов, обеспечивающих прочность на передавливание, перегиб, скручивание является серьезной проблемой на пути создания протезов сосудов малого диаметра.

Известен протез кровеносного сосуда, выполненный в виде гладкой вязаной трубки, армированной по спирали синтетической мононитью [6]. Однако, в результате воздействия внешних (сокращения мускулатуры) или внутренних (пульсация крови) сил в процессе эксплуатации протеза может происходить перетирание основного материала протеза в месте контакта с армирующей нитью, и потере структурной целостности и/или механической прочности протеза. Кроме того, поверхность вязаных протезов склонна к формированию обширной неоинтимы, участков склеротизации, что приводит к формированию обширных стенозов.

Одним из оптимальных материалов для создания конструкции протеза сосуда является полимер поликапро-лактон - медленно биодеградирующий полимер, разрешенный для применения в хирургической практике. В цитологических исследованиях было показано, что этот полимер не вызывает цитотоксической реакции, материалы из поликапролактона могут выполнять роль 3Д мат-рикса, к которому прикрепляются и пролиферируют первичные клетки [2]. Учитывая вышеперечисленные факты, ПКЛ может быть использован в качестве основы для создания тканеинженерных матриксов. Тканеинженерные сосудистые протезы из поликапролактона, изготовленные методом электроспиннинга [3] обладают хорошей биосовместимостью, в них не наблюдается формирование тромбов или аневризм. К числу недостатков такого протеза можно отнести низкую прочность в области упругой деформации, плохую устойчивость к деформациям и перегибам, низкую устойчивость к передавливанию.

В представленном исследовании мы обнаружили, что проблему прочности микроволокнистых материалов из поликапролактона, изготовленных методом электроспиннинга, можно решить с помощью облучения материалов потоком быстрых электронов, генерируемых ускорителями электронов. Облучение потоком быстрых электронов обеспечивает не только упрочнение, но и стерилизацию материалов, т.к. доза облучения от 25 кГр относится к стерилизующему излучению. Методы и материалы:

В качестве протезов сосудов были использованы трубки с толщиной стенки 150-200 микрометров (внутренний диаметр 1,7 мм) и длиной 60-80 мм, изготовленные методом электроспиннинга из 7% раствора поликапролактона в гексафторизопропаноле (режим электроспиннинга: напряжение 20 кВ, расстояние между электродами 19 см) при укладывании волокна полимера на вращающийся стержень (скорость вращения 300 об/мин) с внешним диаметром 1,7 мм). Толщину материала измеряли при помощи механического микрометра с точностью ±10 микрон выполняя не менее 5 измерений в разных местах исследуемого протеза и использовали среднюю толщину для вычисления прочности. Для измерения прочностных характеристик использовали только те протезы, толщина которых в серии из 5 измерений отличалась не более, чем на 5%. Линейные размеры протезов (длину и диметр) измеряли при помощи штангенциркуля второго класса с точностью 0,1 мм. Точность измерения длины составляла ±0,5%, ширины ±1%, толщины ±5%, сечения ±6%.

Для изготовления протезов сосудов, содержащих в своем составе биополимеры были использованы трубки, изготовленные методом электроспиннинга из раствора содержащего 5% поликапролактона с 10% желатина, а так же из раствора содержащего 5% поликапролактона с 0,5% гепарина, при скорости подачи раствора полимера 1,5 мл/час, напряжении 23 и 25 кВ соответственно, расстояние от капилляра до коллектора 20 см, при укладывании волокна полимера на вращающийся стержень (скорость вращения 300 об/мин) с внешним диаметром 1,7 мм. Толщину материала измеряли при помощи механического микрометра как описано ранее.

Для модификации механических свойств протезы облучали излучением, генерируемым ускорителем электронов ИЛУ-6 (2,2 МэВ, 400 тА, 10 Гц). Образцы материалов помещали на конвейер, перемещающийся со скоростью 6,7 см/с относительно источника излучения. Доза облучения волокнистых материалов варьировала в диапазоне от 0 до 250 кГр.

Механические свойства облученных материалов, изучали как описано в ГОСТ 51556-2000 с использованием универсальной разрывной машины для испытания материалов Zwick/RoeИ 2100 (Германия) при постоянной скорости нагружения 10 мм/мин и исходном расстоянии между зажимами концов протеза 50-60 мм.

Для уточнения данных деформационной диаграммы, полученной на испытательной машине, дополнительно определяли прочность в области упругой деформации, в условиях статической нагрузки варьируя прикладываемое усилие с шагом 10 г. Для измерения остаточной деформации после статической нагрузки использовали оптический микроскоп МИР-2 (х15), который позволяет измерять остаточную деформацию образца материала с точностью 70 микрон.

Прочность материалов на прорыв ниткой измеряли, как описано в [5]. Для этого один край протеза фиксировали, второй край на расстоянии 2 мм от конца протеза прошивали ниткой, и к петле прикладывали увеличивающееся усилие (с шагом 10 г). Протез прошивали монофиламентной полипропиленовой нитью №5, диаметр нити 15 микрон, диаметр иглы 170 микрон. Прочностью считали максимальную нагрузку, при которой еще не наблюдается деформация/прорыв протеза. Прочность на прорыв для протезов из ПКЛ составляла 160±20 грамм силы.

Прочность на передавливание измеряли по сдавливанию участка протеза сосуда длиной 1 см между двумя плоскими параллельными поверхностями с оптическим контролем просвета сосуда (до контакта стенок протеза, при помощи оптического микроскопа МИР-2 х15); нагрузку увеличивали с шагом 2 г.

Было исследовано как первичные фибробласты и эндотелиоциты адгезируют и пролиферируют на поверхности 3Д матриксов из ПКЛ и ПКЛ, содержащих 10% желатина, а также на матриксах из тех же материалов, облученных дозой излучения 100 кГр. Первичные фибробласты и эндотелиальные клетки культивировали в ростовой среде 1М БЫ с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки при 37 С, в атмосфере 6% СО2 Перед посевом клеток матриксы предварительно стерилизовали путем инкубации в 70% этаноле в течение 5 минут и последующей отмывкой в фосфатном буфере с 5кратной сменой буфера. Жизнеспособность клеток оценивали через 24 часа после посева клеток на исследуемую поверхность в концентрации 0,5*105 клеток/см2 по окрашиванию клеток кальцеином/пропидиум иодидом. Количество клеток подсчитывали на флуоресцентном

микроскопе Axiovert 200, при помощи программного Изменения механических характеристик протезов

обеспечения Axiovision (Zeiss, Германия) на всей сосудов, изготовленных из поликапролактона в

поверхности подложки. зависимости от дозы облучения приведены в таблице 1. Результаты и обсуждение:

Таблица 1.

Зависимость механических характеристик протезов сосудов, изготовленных из поликапролактона от дозы __облучения. Представлены средние значения ±стандартное отклонение._

Доза облучения кГр Прочность в области упругой деформации/относительное удлинение МПа/% Прочность на разрыв в продольном направлении/относительное удлинение МПа/% Прочность на разрыв в поперечном направлении/относительное удлинение МПа/% Прочность на прорыв ниткой грамм силы Прочность на сдавливание грамм силы

0 1,2±0,2/7±2 2,3±0,5/860±120 2,6±0,3/660±170 160±20 20±2

25 1,3±0,3/7±2,2 2,3±0,4/810±150 2,6±0,4/640±160 182±25 28±2,5

50 1,6±0,3/5±1,2 2,2±0,2/750±120 2,4±0,3/550±80 207±24 35±3

100 2,1±0,3/4±0.6 2,2±0,3/710±90 2,4±0,3/510±90 310±20 44±4

150 1,6±0,2/3,5±0,5 1,8±0,2/290±50 2,0±0,2/210±60 343±31 50±5

Из таблицы 1 следует, что облучение протезов сосудов из поликапролактона дозой 25 кГр не влияет на механические свойства протезов и может быть использовано для стерилизации изделий.

Принципиальной величиной является предел пропорциональности или прочность в области упругой деформации. Эта величина характеризует нагрузку, при которой линейные размеры материала не изменяются после снятия нагрузки, что принципиально для протезов сосудов, которые работают в условиях постоянно изменяющейся гидравлической нагрузки. При облучении дозой 100 кГр прочность протезов в области упругой

деформации и прочность на передавливание улучшаются практически вдвое, что демонстрирует эффективность предложенного способа для упрочнения протезов сосудов.

Для того чтобы определить, как влияют добавки биополимеров в составе полимерного матрикса на механические характеристики материалов до и после облучения были изготовлены трубки из поликапролактона, содержащие в составе волокон 10% желатина и 0,5 % гепарина. Трубки были облучены дозой облучения в диапазоне от 25-100 кГр. Данные механических испытаний представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Зависимость механических характеристик протезов сосудов, изготовленных из поликапролактона с 10% желатина и из поликапролактона с 10% гепарина от дозы облучения.

Образец материала доза облучения кГр Прочность в области упругой деформации/относительное удлинение МПа/% Прочность на разрыв в продольном направлении/относительное удлинение МПа/% Прочность на прорыв ниткой грамм силы Прочность на сдавливание грамм силы

ПКЛ+10% желатина 0 1,4±0,2/11±2 2,1±0,5/450±100 170±20 19±2

25 1,4±0,3/11±2 2,1±0,4/450±110 170±25 20±2

100 2,7±0,3/18±2 3,7±0,3/300±50 360±20 50±5

ПКЛ+0,5% гепарина 0 1,2±0,2/7,5±2 2,1±0,3/760±120 160±25 20±4

25 1,3±0,3/7,5±2 2,3±0,4/720±120 155±30 19±2

100 2,0±0,3/4,5±1 2,3±0,3/630±40 330±35 40±5

Из таблицы следует, что облучение протезов сосудов из поликапролактона с желатином или гепарином дозой 25 кГр не влияет на механические свойства протезов и может быть использовано для стерилизации изделий.

При облучении протезов дозой 100 кГр механические свойства материалов повышаются практически в два раза по сравнению с необлученными

также как и для материалов, не содержащих биополимеры, что демонстрирует эффективность предложенного способа для упрочнения протезов сосудов, изготовленных из химически синтезированных полимеров с дополнительно введенными биологическими полимерами.

Было исследовано, как влияет облучение на способность матриксов поддерживать адгезию и пролиферацию первичных эндотелиальных клеток из пупочной вены и фибробластов из ткани десны человека. Для этого клетки культивировали на поверхности

культурального пластика и на поверхности матриксов как описано в методической части. Было показано, что способность клеток прикрепляться и пролиферировать на поверхности необлученного и облученного 3Д матрикса не отличаются.

Таблица 3.

Жизнеспособность и адгезия первичных культур клеток (эндотелиоцитов и фибробластов) на поверхности матриксов, изготовленных из поликапролактона с 10% желатина и на материале, облученном

Матрикс Клеточная культура Прикрепившиеся клетки*,% Доля мертвых клеток**,%

ПКЛ+10% желатина Первичные фибробласты человека 93±5% 2±0,5%

Первичные эндотелиоциты человека 95±7% 22±3%

ПКЛ+10% желатина, 100 кГр Первичные фибробласты человека 91±6% 2±0,5%

Первичные эндотелиоциты человека 90±5% 18±2%

*Прикрепившиеся клетки определяли, как долю от контрольных клеток, пересеянных на поверхность пластиковой чашки Петри (TPP, Швейцария)

**Долю мертвых клеток определяли, как долю клеток, окрашенных пропидиум иодидом относительно всех клеток. Жизнеспособные клетки окрашивали Calcein АМ (Пика, США).

Таким образом, было показано, что при облучении волокнистого материала из поликапролактона происходит увеличение прочности в области упругой деформации практически в два раза по сравнению с необлученными материалами, такие материалы не токсичными для клеток, что позволяет использовать облучение пучком быстрых электронов для модификации механических свойств протезов сосудов, предназначенных для протезирования сосудов малого диаметра.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 14-15-00493

Список литературы 1. Lafont A., Guzman L.A., Whitlow P.L. et al. Restenosis after experimental angioplasty. Intimal, medial, and adventitial changes associated with constrictive remodeling. Cir. Res., 1995, 76. - 9961002.

2. Lowery J.L., Datta N., Rutledge G.C. Effect of fiber diameter, pore size and seeding method on growth of human dermal fibroblasts in electrospun poly(epsilon-caprolactone) fibrous mats. Biomaterials, 2010, 31. -491-504.

3. Nottelet B., Pektok E., Mandracchia D. et al. Factorial design optimization and in vivo feasibility of poly(epsilon-caprolactone)-micro- and nanofiber-based small diameter vascular grafts. J. Biomed. Mater. Res. A, 2009, 89. - 865-875.

4. Scales J.T. Tissue reactions to synthetic materials. Proc. R. Soc. Med., 1953, 46. - 647-652.

5. Schaner P.J., Martin N.D., Tulenko T.N. et al. Decellularized vein as a potential scaffold for vascular tissue engineering. Journal of Vascular Surgery, 2004, 40. - 146-153.

6. Цейнек Маркус, Краичек Милан, Дворжак Ян и соавторы. Протез кровеносного сосуда. Патент CCCP № 835182 A, 1985.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ОЧИСТКЕ, СТОЧНЫЫХ ВОД ГИДРОБИОЦЕНОЗАМИ ВОДНОЙ ЭКОСИСТЕМЫ

Использование экологически несовершенных технологий в промышленности и сельском хозяйстве, сброс недостаточно очищенных промышленных, коммунальных и сельскохозяйственных стоков, поступление загрязнений с рассредоточенным стоком с

Субботина Юлия Михайловна

к.с-х.н доцент РГСУ Смирнова Ирина Робертовна Профессор д.в.н. МГУПП Зубкова Валентина Михайловна Профессор д.б.н. РГСУ водосборных территорий ведут к повсеместному загрязнению водных ресурсов.

Актуальнейшей стала проблема «чистой воды», т.е. совершенствование

Способов охраны водных ресурсов, в первую очередь малых рек и рыбохозяйственных водоемов, от органического

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.