CC BY
38
5. Allen J, Howell K. Microvascular imaging: Techniques and opportunities for clinical physiological measurements. Physiol Meas 2014; 35 (7): 91-141.
6. Datsenko AV, Fomina TV, Dyoshin IA, Kazmin VI. Investigation of the relationship between changes in thermographic and flowmetric parameters of skin peripheral hemodynamics in laboratory rats. Saratov Journal of Medical Scientific Research 2017; 13 (4): 901-7. Russian (Даценко А. В., Фомина Т. В., Дёшин И. А., Казьмин В. И. Исследование взаимосвязи изменений термографических и флоуметрических показателей состояния кожной периферической гемодинамики у лабораторных крыс. Саратовский научно-медицинский журнал 2017; 13 (4): 901-7).
7. Lahiri BB, Bagavathiappan S, Jayakumar T, Philip J. Medical applications of infrared thermography: A review. Infrared Physics & Technology 2012; 55 (4): 221-35.
8. Kozhevnikova IS, Pankov MN, Gribanov AV, et al. The use of infrared thermography in modern medicine (Literature review). Human Ecology 2017; (2): 39-46. Russian (Кожевникова И. С., Панков М. Н., Грибанов А. В. и др. Применение инфракрасной термографии в современной медицине (обзор литературы). Экология человека 2017; (2): 39-46).
9. Kumar US, Sudharsan NM. Non invasive detection of abnormalities using thermal image. Int J Pharm Technol 2017; 9 (2): 29524-32.
10. Potekhina YuP, Golovanova MV. The reasons of the change of local body temperature. Medical Almanac 2010; 11 (2): 297-8. Russian (Потехина Ю. П., Голованова М. В. Причины изменения локальной температуры тела. Медицинский альманах 2010; 11 (2): 297-8).
11. Konoplev VA, Gorokhov VE, Bokarev AV, Kovalev SP. Infrared thermography of the pathology of the distal part of the limbs of household and agricultural animals. International bulletin of Veterinary Medicine 2018; (1): 93-7. Russian (Коноплев В. А., Горохов В. Е., Бокарев А. В. Инфракрасная термография патологии дистальной части конечностей домашних и сельскохозяйственных животных. Международный вестник ветеринарии 2018; (1): 93-7).
12. Rekant SI, Lyons MA, Pacheco JM, et al. Veterinary applications of infrared thermography. Am J Vet Res 2016; 77 (1): 98-107.
13. Stewart M, Webstert JR, Schaefer AL, et al. Infrared thermography as a non-invasive tool to study animal welfare. Anim Welfare 2005; 14 (4): 319-25.
14. Vianna DM, Carrive P. Changes in cutaneous and body temperature during and after conditioned fear to context in the rat. Eur J Neurosci 2005; 21 (9): 2505-12.
15. Lecorps B, Rödel HG, Feron C. Assessment of anxiety in open field and elevated plus maze using infrared thermography. Physiol Behav 2016; 157: 209-16.
16. Cheung BM, Chan LS, Lauder IJ, Kumana CR. Detection of body temperature with infrared thermography: accuracy in detection of fever. Hong Kong Med J 2012; 18 (3): 31-4.
17. Sagaidachnyi AA, Fomin AV. Analysis of time derivative of the temperature response of fingers on the brachial occlusion and its relationship with hemodynamic parameters. Regional blood circulation and microcirculation 2017; 16 (3): 31-40. Russian (Сагайдачный А. А., Фомин А. В. Анализ временной производной температурной реакции пальцев рук на плечевую окклюзию и ее взаимосвязь с параметрами гемодинамики. Регионарное кровообращение и микроциркуляция 2017; 16 (3): 31-40).
18. DiLeo T, Roberge RJ, Kim JH. Effect of wearing an N95 filtering facepiece respirator on superomedial orbital infrared indirect brain temperature measurements. J Clin Monit Comput 2017; 31 (1): 67-73.
19. Z^bala M, Kaczmarska K, Bogucki J, et al. Intraoperative assessment of cerebral blood flow changes in normal and pathological brain tissue using an infrared camera. Quantitative Infrared Thermography Journal 2018; 15 (2): 240-51.
20. Khugaeva VK. Legends and real pattern of microcirculation. Pathogenesis 2013; 11 (2): 32-41. Russian (Ху-гаева В. К. Легенды и реальные закономерности микроциркуляции. Патогенез 2013; 11 (2): 32-41).
УДК [57+61]:575.224.232:616-00 Оригинальная статья
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТРЕХЦВЕТНОГО FISH-МЕТОДА ОКРАСКИ ХРОМОСОМ ПРИ АНАЛИЗЕ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННЫХ АБЕРРАЦИЙ ХРОМОСОМ:
ПИЛОТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Е. И. Добровольская — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, врач-генетик специализированной лаборатории цитологии, генетики и иммунологии; В. Ю. Нугис — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, заведующий лабораторией радиационной гематологии и цитогенетики, доктор биологических наук; Г. П. Снигирева — ФГБУ «Российский научный центр рентгено-радиологии» Минздрава России, заведующая лабораторией молекулярной биологии и цитогенетики, доктор биологических наук; М. Г. Козлова — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, научный сотрудник лаборатории радиационной гематологии и цитогенетики; В. А. Никитина — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, ведущий научный сотрудник лаборатории радиационной гематологии и цитогенетики, биолог криобанка Центра биомедицинских технологий, кандидат медицинских наук.
USE OF THE TRICOLOR FISH-PAINTING METHOD OF CHROMOSOMES FOR THE ANALYSIS OF RADIATION-INDUCED CHROMOSOMAL ABERRATIONS: A PILOT STUDY
E. I. Dobrovolskaya — State Research Center — Burnasyan Federal Medical Biophysical Center of Federal Medical Biological Agency, Doctor-geneticist of Specialized Laboratory of Cytology, Genetics and Immunology; V. Yu. Nugis — State Research Center — Burnasyan Federal Medical Biophysical Center of Federal Medical Biological Agency, Head of Laboratory of Radiation Hematology and Cytogenetics, DSc; G. P. Snigiryova — Russian Scientific Center of Roentgenoradiology, Head of Laboratory of Molecular Biology and Cytogenetics, DSc; M. G. Kozlova — State Research Center — Burnasyan Federal Medical Biophysical Center of Federal Medical Biological Agency, Researcher of Laboratory of Radiation Hematology and Cytogenetics; V. A. Nikitina — State Research Center — Burnasyan Federal Medical Biophysical Center of Federal Medical Biological Agency, Leading Researcher of Laboratory of Radiation Hematology and Cytogenetics, Biologist of Specialized Laboratory of Cytology, Genetics and Immunology of Center for Biomedical Technologies, PhD.
Дата поступления — 25.07.19 г. Дата принятия в печать — 05.12.2019 г.
Добровольская Е.И., Нугис В.Ю., Снигирева Г.П., Козлова М.Г., Никитина В.А. Использование трехцветного FISH-метода окраски хромосом при анализе радиационно-индуцированных аберраций хромосом: пилотное исследование. Саратовский научно-медицинский журнал 2019; 15 (4): 982-985.
Цель: сравнить частоты радиационно-индуцированных транслокаций, выявляемых с помощью трехцветного FISH-метода, при использовании различных наборов ДНК-зондов. Материал и методы. Материалом для цитогенетического исследования послужила венозная кровь одного здорового донора мужского пола, подвергнутая гамма-облучению in vitro в дозах 0,1-3,0 Гр. Культивирование лимфоцитов и приготовление препаратов хромосом осуществляли с помощью вариантов стандартных методик. Хромосомы окрашивали раздельно трехцветными ДНК-зондами: для 1, 4 и 12 пар и для 2, 3 и 8 пар. Результаты. Возрастание дозы вызывало увеличение частоты транслокаций при использовании обоих наборов ДНК-зондов. При применении любого из них частоты FISH-регистрируемых транслокаций во всех клетках (стабильных и нестабильных) существенно не отличались от аналогичной величины только в стабильных клетках. Сравнение частот транслокаций, выявляемых с помощью ДНК-зондов разных видов, также показало отсутствие статистически существенных различий как во всех, так и в стабильных клетках. Заключение. Использование двух выбранных наборов ДНК-зондов продемонстрировало отсутствие значимых различий между ними по наблюдаемым частотам индуцированных радиацией транслокаций хромосом.
Ключевые слова: культура лимфоцитов периферической крови, FISH-метод, транслокация, облучение.
Dobrovolskaya EI, Nugis VYu, Snigiryova GP, Kozlova MG, Nikitina VA. Use of the tricolor FISH-painting method of chromosomes for the analysis of radiation-induced chromosomal aberrations: a pilot study. Saratov Journal of Medical Scientific Research 2019; 15 (4): 982-985.
Purpose: to compare the frequency of radiation-induced translocations detected by three-color FISH-method using different sets of DNA probes. Material and Methods. The material for the cytogenetic study was venous blood of one healthy male donor subjected to in vitro gamma-radiation in doses of 0.1-3.0 Gy. Cultivation of lymphocytes and preparation of chromosome specimens were carried out using variants of standard techniques. Chromosomes were stained separately with three-color DNA probes: for 1, 4 and 12 pairs and for 2, 3 and 8 pairs. Results. The increase of dose produced frequency of translocations growth when using both sets of DNA probes. When using any of them, the frequencies of FIsH-registered translocations in all cells (stable and unstable) did not differ significantly from the same value only in stable cells. A comparison of the translocation frequencies detected using DNA probes of different species also showed absence of statistically significant differences in both all and stable cells. Conclusion. The use of two selected sets of DNA probes demonstrated absence of significant differences between them in the observed frequencies of radiation-induced chromosome translocations.
Key words: peripheral blood lymphocyte culture, FISH-method, translocation, irradiation.
Введение. Подсчет аберраций хромосом с помощью их классической окраски в культурах лимфоцитов периферической крови является общепринятым методом биологической индикации дозы в ближайшие сроки после острого внешнего облучения в дозах, вызывающих развитие острой лучевой болезни, и основан на определении частоты дицен-триков, которая имеют тенденцию к снижению с течением времени [1]. Для ретроспективной оценки дозы или ее индикации при пролонгированном/хроническом облучении рекомендуется использовать FISH-окрашивание хромосом [1], которое позволяет выявлять реципрокные транслокации, не представляющие механического препятствия для протекания митоза и относящиеся поэтому к стабильному (во времени) типу перестроек хромосом. Для оценки дозы по средней частоте дицентриков обычно используют кривые «доза — эффект», полученные по результатам облучения крови здоровых доноров in vitro. Аналогичным образом предложено поступать и для ретроспективной оценки дозы по частотам ре-ципрокных транслокаций с помощью FISH-метода.
До настоящего времени основным для цитоге-нетической ретроспективной оценки дозы является одноцветный вариант FISH-методики с использованием комплементарных к ДНК хромосом ДНК-зондов с присоединенным каким-то одним флуорохромным красителем. При этом обычно выбирают хромосомы из групп А, В и С, так как они являются наиболее крупными в кариотипе человека. С другой стороны, исследователи, по-видимому, не хотят ограничиваться наибольшими хромосомами только из группы А, хотя в целом большинство исходит из гипотезы о зависимости вероятности вовлечения каждой данной хромосомы в перестройку только от количества содержащееся в ней ДНК. Однако было бы интересно и полезно узнать, насколько может повлиять
Ответственный автор — Нугис Владимир Юрьевич Тел.: +7 (925) 8463120 E-mail: nugisvju@list.ru
на чувствительность FISH-метода регистрация обменов не только между тремя выбранными FISH-окрашенными и контрокрашенными хромосомами, но и между самими этими FISH-окрашенными хромосомами.
Цель: сравнить частоты радиационно-индуциро-ванных транслокаций, выявляемых с помощью трехцветного FISH-метода, при использовании различных наборов ДНК-зондов.
Материал и методы. Материалом для данного первичного цитогенетического исследования послужила полученная из кубитальной вены кровь одного здорового донора мужского пола (возраст — 41 год). Радиационное воздействие производилось in vitro при комнатной температуре гамма-лучами 60Со на терапевтической установке «Луч» в дозах 0,10; 0,15; 0,25; 0,35; 0,50; 0,75; 1,00; 1,50; 2,00 и 3,00 Гр (мощность дозы равнялась 0,5 Гр/мин). Одна проба осталась необлученной для регистрации контрольного уровня аберраций хромосом. Облученная и необлученная кровь использована для постановки в стерильных условиях 50-часовых культур лимфоцитов периферической крови в соответствии с принятой в лаборатории методикой, которая в целом аналогична подходу, представленному в рекомендациях МАГАТЭ (2011) [1]. Препараты хромосом также готовили стандартным способом. При выполнении трехцветного FISH-метода окрашивания хромосом использовали готовые наборы ДНК-зондов к парам целых хромосом № 1, 4, 12 и № 2, 3, 8 (контркраситель DAPI) фирмы MetaSystems. Следует отметить, что по суммарному относительному содержанию ДНК оба эти набора близки друг к другу. Доля ДНК в них по отношению к диплоидному набору хромосом у мужчин равняется 0,1917 и 0,19бб соответственно. При обработке и окраске препаратов хромосом руководствовались прилагаемой к набору фирменной инструкцией.
В настоящем первичном исследовании решили ограничиться сравнением выхода радиационно-ин-
дуцированных транслокации при использовании различных наборов ДНК-зондов и во всех (стабильных и неаберрантных) и нестабильных клетках, причем учитывали аберрации с участием как Р^Н-окрашенных, так и контрокрашенных хромосом. Для этого применен G-критерий знаков для двух связанных выборок при критическом уровне значимости, равном 0,05 (пакет статистических программ Statistica 6).
Результаты. В табл. 1 представлены результаты цитогенетического анализа культур лимфоцитов периферической крови выбранного здорового донора
при использовании трехцветного FISH-окрашивания с помощью ДНК-зондов к 1, 4 и 12 парам хромосом. Аналогичные данные приведены в табл. 2 для ДНК-зондов к 2, 3 и 8 парам хромосом. Показаны данные для аберраций хромосом, в образовании которых участвовали FISH-окрашенные структуры.
Обсуждение. Наряду с ожидаемыми транслокациями между FISH- и контрокрашенными хромосомами и между разными FISH-окрашенными хромосомами при достаточно больших дозах (больше 1 Гр) встречались редкие и интересные находки в виде клеток с наблюдавшимся обменом дисталь-
Таблица 1
Результаты цитогенетического трехцветного FISH-анализа культур лимфоцитов периферической крови здорового донора в контроле и после гамма-облучения in vitro при использовании ДНК-зондов к 1, 4 и 12 парам хромосом
со ^ Я 3 1 i ан О 1 * Число стабильных клеток Число транслокаций Частота транслокаций на 100 клеток -р Ф о "о ^ т- * и1 о m То ь 0 и § 1 ¡5 1 1 О й^ х 0 ас1 к И ™ £ х ° ц1 к аао а нт Частота транслокаций на 100 клеток на весь геном
О 1ц: с о ® о äc о со ^ с полных неполных все клетки стабильные клетки ане ё >1 5 ä ^ а Ч той е Р5 со ^ IT о в Б х о ае0 Чц1 ~ х ц Ё-S Й m £ оол ь * * Ш Q. Чт все клетки стабильные клетки
0 1018 1016 3 0 0,3 0,3 0 0 0 0 0,1 0,9 0,9
0,10 611 609 3 0 0,5 0,5 0 0 0 0 0,2 1,4 1,4
0,15 366 362 2 0 0,6 0,6 0 0 0,3 0 0 1,6 1,6
0,25 668 661 6 0 0,9 0,9 0 0 0,3 0 0 2,6 2,7
0,35 636 634 8 1 1,4 1,4 0 0 0,2 0 0,6 4,1 4,2
0,50 1116 1107 14,5 0 1,3 1,3 0 0 0,2 0 0,4 3,8 3,8
0,75 511 498 20 2 4,3 4,2 0 0 0,8 0 0 12,6 12,4
1,00 969 915 42 2 4,5 4,6 0 0 2,2 0 0,8 13,3 13,4
1,50 442 416 33 3 8,1 8,4 0 0,2 1,1 0 0,9 23,8 24,6
2,00 372 300 36 1 10,0 8,3 0 0 5,1 0 3,8 29,1 24,4
3,00 428 236 106,5 3 25,6 23,1 0,2 0,2 15,2 1,2 13,1 74,9 67,6
Примечание: хромосомам.
при определении стабильности клеток учитывали аберрации не только по Р^Н-окрашенным, но и по контрокрашенным
Таблица 2
Результаты цитогенетического трехцветного FISH-анализа культур лимфоцитов периферической крови здорового донора в контроле и после гамма-облучения in vitro при использовании ДНК-зондов к 2, 3 и 8 парам хромосом
Доза, Гр Число проанализированных клеток Число стабильных клеток Число транслокаций Частота транслокаций на 100 клеток Частота инсер-ций на 100 клеток Частота инверсий на 100 клеток Частота дицентриков на 100 клеток Частота центрических колец на 100 клеток Частота ацен-триков на 100 клеток Частота транслокаций на 100 клеток на весь геном
полных неполных все клетки стабильные клетки все клетки стабильные клетки
0 175 174 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0,10 688 686 3 0 0,4 0,4 0 0 0 0 0,2 1,2 1,2
0,15 509 508 2 0 0,4 0,2 0 0 0 0 0,4 1,1 0,6
0,25 952 948 6 0 0,6 0,6 0 0,1 0,2 0 0 1,8 1,8
0,35 1005 1000 10 0 1,0 0,9 0 0 0,1 0 0,5 2,9 2,6
0,50 1093 1075 18 1 1,7 1,8 0,1 0 0,6 0 0,6 5,0 5,1
0,75 1100 1045 24 0 2,2 2,1 0 0 0,9 0,2 0,5 6,2 6,0
1,00 438 414 16 0 3,6 3,6 0 0 0,9 0 0,5 10,5 10,4
1,50 374 335 26 0 7,0 6,9 0 0 3,5 0 1,1 19,9 19,7
2,00 546 470 62,5 3 12,0 10,7 0 0,9 5,1 0,4 3,5 34,4 30,8
3,00 565 362 146 3 26,4 21,0 1,4 0,4 12,2 0,5 10,4 75,5 60,1
Примечание: при определении стабильности клеток учитывали аберрации не только по Р^Н-окрашенным, но и по контрокрашенным хромосомам.
ными участками между тремя хромосомами как бы «по кругу». Например, найдена метафаза, в которой часть хромосомы 3 присоединилась к хромосоме 8, часть хромосомы 8 присоединилась к контрокра-шенной хромосоме, а часть контрокрашенной хромосомы присоединилась к 3-й хромосоме. В этом случае произошло три разрыва в трех хромосомах, что может быть зарегистрировано только при рассматриваемом трехцветном FISH-методе. Возникает вопрос: сколько же образуется в этом случае транслокаций? Действительно, при одной обычной транслокации происходит два разрыва в двух хромосомах, при двух независимых транслокациях — четыре разрыва в четырех хромосомах. Поэтому мы посчитали возможным обозначить обнаруженный феномен как 1,5 транслокации, хотя в статье [2] авторы предлагают считать, что имеется 2 транслокации. В связи с тем что мы приняли решение так учитывать данные взаимосвязанные транслокации, в табл. 1 и 2 имеются парадоксальные количества транслокаций в виде целого числа с половиной: N,5 ^ — целое число).
Основное предположение, лежавшее в основе предложения использовать FISH-метод для ретроспективной оценки дозы, заключалось в стабильности их частоты во времени. Однако продолжительные цитогенетические наблюдения за лицами, пострадавшими в результате реальных радиационных аварий на Чернобыльской АЭС (1986 г.) [3] и в г. Гойянии, Бразилия (1987 г) [4], показали, что данное первоначальное положение о сохранности индуцированных частот стабильных перестроек с течением времени после облучения оказалось соответствующим действительности только до уровня доз 0,8-2 Гр, хотя на практике в подавляющем большинстве случаев при необходимости осуществления ретроспективной оценки дозы этого, по-видимому, вполне достаточно.
В целом упомянутое снижение уровней реци-прокных транслокаций при реальном наблюдении за облученными лицами по сравнению с ожидаемыми по результатам исходного определения частот дицентриков в ближайшие сроки после облучения обусловлено совместным нахождением стабильных и нестабильных аберраций в одних и тех же клетках и их совместной элиминацией при репродуктивной гибели клеток из-за наличия нестабильных перестроек хромосом. Поэтому некоторые авторы предложили при ретроспективной оценке по FISH-методу подсчитывать перестройки хромосом только в стабильных клетках.
Проведенное на материале данной работы сравнение между собой частот транслокаций в стабильных и нестабильных клетках и при использовании разных наборов ДНК-зондов с использованием G-критерия знаков для двух связанных выборок позволило продемонстрировать следующее:
1. При применении любого из двух наборов ДНК-зондов частоты FISH-регистрируемых транслокаций
во всех (стабильных и нестабильных) клетках существенно не отличались от аналогичной величины только в стабильных клетках: р=0,724 и 0,131 для 1, 4 и 12 и для 2, 3 и 8 пар хромосом соответственно.
2. При объединении всех данных независимо от выбранного набора ДНК-проб в диапазоне всех доз радиационного воздействия от 0,1 до 3,0 Гр частоты транслокаций во всех и стабильных клетках также значимо не различались друг от друга с р=0,628. Однако при сужении диапазона доз (0,75-3,0 Гр) уровень значимости снижался до р=0,114.
3. При сравнении частот транслокаций, выявляемых с помощью разных наборов ДНК зондов для 1, 4 и 12 и для 2, 3 и 8 пар хромосом, статистически существенные различия также отсутствовали как во всех, так и в стабильных клетках: р=0,343 и 0,114 соответственно.
Проведенное исследование является только началом запланированной работы по построению зависимостей «доза — эффект» для частот транслокаций, выявляемых с помощью трехцветного FISH-метода. Ясно, что для получения статистически надежных зависимостей и выявления других связанных эффектов необходимо продолжение работы с использованием облученной in vitro крови других доноров.
Заключение. Использование двух выбранных наборов ДНК-зондов продемонстрировало отсутствие значимых различий между ними по наблюдаемым частотам индуцированных радиацией транслокаций хромосом.
Конфликт интересов не заявляется. Работа финансировалась из бюджета по теме НИР
Авторский вклад: концепция и дизайн исследования — В. Ю. Нугис, Г. П. Снигирева; получение и обработка данных — Е. И. Добровольская, М. Г. Козлова, В. А. Никитина; анализ и интерпретация результатов, написание статьи — Е. И. Добровольская, В. Ю. Нугис; утверждение рукописи для публикации — В. Ю. Нугис.
References (Литература)
1. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies. Vienna: IAEA, 2011; 229 p.
2. Suto Y, Akiyama M, Noda T, Hirai M. Construction of a cytogenetic dose — response curve for low-dose range gamma-irradiation in human peripheral blood lymphocytes using three-color FISH. Mutat Res/Genet Toxicol and Environmental Mutagenesis 2015; 794: 32-8.
3. Sevankaev AV, Khvostunov IK, Mikhailova GF, et al. Novel data set for retrospective biodosimetry using both conventional and FISH chromosome analysis after high accidental overexposure. Applied Radiation and Isotopes 2000; 52 (5): 1149-52.
4. Natarajan AT, Santos SJ, Darroudi F, et al. Cesium-induced chromosome aberrations analysed by fluorescence in situ hybridization: Eight years follow up of the Goiania radiation accident victims. Mutat Res 1998; 400 (1): 299-312.
