Использование трансглутаминаз для модификации структуры сырья с целью получения пищевой продукции из лососей с нерестовыми изменениями Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

2008

Известия ТИНРО

Том 152

УДК 577.112.384.4:664.951.6

М.В. Орлова, С.В. Леваньков, Т.Н. Пивненко, Е.В. Якуш, А.П. Ярочкин

ТИНРО-центр, г. Владивосток pivnenko@tinro.ru

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТРАНСГЛУТАМИНАЗ ДЛЯ МОДИФИКАЦИИ СТРУКТУРЫ СЫРЬЯ С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ ИЗ ЛОСОСЕЙ С НЕРЕСТОВЫМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ

Изучены биохимические свойства, кинетические и термодинамические параметры, стабильность мышечных белков нерестовых лососей — кеты, горбуши, кижуча, нерки. Учет особенностей химического состава изученных объектов позволил определить наиболее перспективные направления переработки и вырабатать биотехнологические подходы к производству формованной продукции. Определены оптимальные условия использования фермента трансглутаминазы (ТГ) при производстве формованной продукции из нерестовых лососей. Получены данные по собственной трансглутаминазной активности мышц исследованных объектов. Активность тканевой ТГ лососей изменяется в интервале 0,22-0,31 нМ/мг ч. Сделан вывод, что эффективная полимеризация мышечных белков лососей возможна только при условии внесения дополнительного количества экзогенных ферментов. В зависимости от количества использованного фермента (от 75 до 550 ед/кг мышечной ткани) изменялось относительное содержание димерной формы тяжелых цепей миозина. Относительное содержание димера в зависимости от объекта изменялось от 25 до 65 %. Степень полимеризации зависела от величины рН реакционной смеси. Максимальный выход продуктов полимеризации наблюдали в диапазоне значений рН 6,5-6,8. Эластичность, когезионные, прочностные и вязкостные характеристики мышечных белков после формования значительно улучшались при использовании фермента в количестве не менее 0,5 % от общего количества фаршевой смеси. Даже при сроке хранения 9 мес фарши кеты сохраняли значительные показатели липкости и вязкости и обеспечивали высокое качество формованной продукции. Показано, что использование ТГ влияет на состав мио-фибриллярных белков и процессы структурообразования и обеспечивает универсальность технологии формованных изделий на основе фаршей из нерестовых лососей независимо от степени выраженности нерестовых изменений, технохимических характеристик сырья и продолжительности его морозильного хранения.

Orlova M.V., Levankov S.V., Pivnenko T.N., Yakush Ye.V., Yarochkin A.P. Transglutaminase using for structure modification of forcemeats from salmons with spawning changes for food production // Izv. TINRO. — 2008. — Vol. 152. — P. 348-355.

Biochemical properties, kinetic and thermodynamic parameters, and stability of myofibril proteins are investigated in the raw materials from spawning salmons (chum, pink, red, and silver salmon) of two groups: with weak spawning changes and strong spawning changes (fluid milts). Possible ways of the fish processing are determined and biotechnological approaches for foodstuff producing are developed. The optimal way is defined as structuring the forcemeat by transglutaminase enzyme (TG).

The proper TG activity in the muscle tissue of salmons was 0.22-0.31 nM / mg per hour that is not enough for effective polymerization of myofibril proteins. Addition of exogenous enzyme in the amount from 75 to 550 nM per 1 kg of tissue increased relative content of heavy dimeric myosin from 25 to 65 %. The polymerization degree depended on pH value in reacting mixture with the maximum in conditions of pH 6.5-6.8.

Durability and gelatinization of the forcemeat structured by TG were tested, including the testing with inhibitors (EDTA) and activators (Ca2 +) of TG. Both factors provided forming of stronger and elastic gels. Addition of TG in quantity > 0.5 % of forcemeat mass improved considerably the properties of elasticity, cohesion, and viscosity of muscular proteins after formation. Even after 9 months storage the chum salmon forcemeat kept its high stickiness and viscosity that provided high quality of forming products. The TG influence on myofibril proteins content and structure didn't depend on degree of spawning changes and had positive effect on the raw materials with any technical and chemical parameters or duration of their freezing storage.

Введение

Современные тенденции развития отечественной и зарубежной пищевой технологии свидетельствуют о возрастающей роли структурообразователей в производстве продуктов регулируемого качества. Природные структурообразова-тели используются при производстве пищевых продуктов на основе рыбных фаршей. Эффективность их применения зависит от температуры, концентрации, рН. Формирование структуры белковых гелей происходит за счет образования новых связей различных типов: водородных, гидрофобных, электростатических, дисульфидных (Измайлова, Ребиндер, 1974), поэтому исследование методов модификации белков и разработка эффективных технологий формованных продуктов в настоящее время остаются актуальной задачей.

Изучение биохимических свойств, кинетических и термодинамических параметров, стабильности мышечных белков с учетом особенностей их химического состава позволяет определять основные наиболее перспективные направления переработки недоиспользуемых видов рыб и вырабатывать биотехнологические подходы к производству формованной продукции.

Одним из наиболее продуктивных методов управления структурой является ферментативная модификация белков под действием трансглутаминаз. Трансглу-таминазы (ТГ) (ЕС 2.3.3.13) — подкласс ферментов, катализирующих образование меж- и внутримолекулярных ковалентных связей в полипептидных цепях белков (Lorand, Conrad, 1984; Greenberg et al., 1991; Willemijn, 2002). Основной реакцией, которую катализируют ТГ, является поперечное сшивание белков по е-(у-глутамил)лизиновым аминокислотным остаткам. Образуемые в результате реакции межбелковые связи стабильны при повышенных температурах и обработке протеолитическими ферментами, что позволяет получать продукты с высокими реологическими характеристиками (Griffin, Wilson, 1984; Melino et al., 1994).

Целью данной работы было исследование условий полимеризации мышечных белков под действием ТГ для производства формованной продукции из лососей с нерестовыми изменениями.

Материалы и методы

Важным критерием выбора объектов исследования явился интерес рыбоперерабатывающих предприятий к промыслу и эффективной переработке лососей с нерестовыми изменениями. Переработка этих объектов осуществляется на береговых предприятиях, что позволяет использовать разнообразные технологические приемы и специализированное оборудование (Орлова и др., 2003).

В качестве объектов исследования использовали мышечную ткань кеты (On-corhynchus keta), горбуши (O. gorbuscha), кижуча (O. kisutch), нерки (O. nerka) (группа A — рыба со слабовыраженными брачными признаками, выловлена в море перед заходом в реку; группа В — рыба с текучими гонадами, с ярко

выраженными нерестовыми изменениями, выловленная на расстоянии 0,5-1,0 км от устья). Тушку рыбы разделывали, извлекали внутренности, снимали кожу, отделяли мышцы. Филе мышц для биохимических исследований замораживали в 50 %-ном растворе глицерина (1 : 1) при температуре минус 24 °С, хранили при минус 18 оС. Образцы для реологических испытаний замораживали воздушным способом при минус 18 оС.

Общее количество белка определяли по общепринятой методике (Лазаревский, 1976). Количественное определение азота проводили на приборе Kjeltec Auto 10 SO Analyser (Швеция). Количество воды фиксировали инфракрасным влагомером Kett F-1A (Kett Electric Laboratory, Япония). Влагоудерживающую способность белков мышечной ткани устанавливали методом прессования (Мельникова, 1977). Реологические показатели измеряли приборами Rheolograph Sol-535 (Toyo Seki, Япония) и Rheotech (Fudo, Япония). Когезионные характеристики фаршей определяли методом В.А. Николаева (1964).

Исследование качественного и количественного состава белков мышечной ткани лососей проводили с использованием метода диск-ДСН-электрофореза на оборудовании фирмы Pharmacia Biotech AB (Швеция) в полиакриламидном геле. В качестве концентрирующего геля использовали 3,5 %-ный полиакриламидный гель. Концентрирование вели при силе тока 15 мА и напряжении 210-220 В. Постоянная концентрация разделяющего геля составляла 10 % . Разделение вели при силе тока 5-7 мА и напряжении 100-110 В в течение 6-8 ч. Молекулярную массу (м.м.) исследуемых белковых фракций определяли, сопоставляя их электрофоретическую подвижность с подвижностью белков-маркеров.

Общую трансглутаминазную активность мышечной ткани устанавливали по методу Секи (Takeda, 1996). За единицу активности принимали количество мо-нодансилкадаверина, включенного в 1 мг белка за 1 ч инкубации при температуре 20 ± 2 оС.

При проведении реакции ферментативной полимеризации использовали тканевую ТГ из печени морской свинки (Sigma, США) и микробиальную ТГ (TG-Activa™, Ajinomoto, Япония). Тканевую ТГ растворяли в 0,5 М NaCl, 5,0 мМ CaCl2 и 50,0 мМ Трис-HCl (рН 7,5), микробиальную — в 0,5 М NaCl, 50,0 мМ Трис-HCl (рН 7,5) буфере. Время реакции 1 ч, температура соответственно 25 и 4 оС. Реакцию останавливали быстрым нагревом реакционной смеси до 93-95 оС на водяной бане. Полимеризацию тяжелых цепей миозина мышечных тканей исследовали, используя метод диск-ДСН-электрофореза в 5 %-ном полиакриламидном геле. Образцы для анализа растворяли при 90-95 оС в буфере, содержащем 0,5 М ТРИС-НС1, глицерин, 0,1 М ЭДТА, 1 % ДСН, меркаптоэтанол и 0,05 %-ный раствор бромфенолового синего.

Результаты и их обсуждение

Известно, что глобулярные белки за редким исключением являются плохими субстратами трансглутаминаз, в отличие от фибриллярных белков (Greenberg et al., 1991), поэтому модельные эксперименты проводили на концентратах мио-фибриллярных белков, полученных после промывки измельченных мышц водой. Предварительно нами были получены данные по собственной трансглутаминаз-ной активности мышц исследованных объектов (табл. 1).

Как видно из приведенных данных, активность тканевой ТГ большинства видов лососей изменяется в интервале 0,22-0,31 нМ/мг ч. Исключение составила горбуша, для которой активность фермента была почти в 2 раза выше, чем для остальных видов. В целом же активность ТГ лососей аналогична известным данным для других видов пелагических рыб и значительно ниже, чем у пресноводных. Для осуществления полимеризации белков брали тканевую ТГ из печени морской свинки и микробиальную ТГ, нашедшую широкое применение в пищевой промышленности как фермент-структурообразователь.

Вид Активность трансглутаминазы, нМ/мг ч

Кета 0,23±0,04

Горбуша 0,56±0,08

Нерка 0,29±0,03

Кижуч 0,31±0,02

коннектин

<^димер , 410-420 кДа

<= ~235-240 кДа

Молекулярно-массовое Таблица 1

распределение миофибрил- Активность трансглутаминаз в мышечной ткани лярных белков скелетных л°с°сей с нерест°выми изменениями

Table 1

мышц кеты представлено на _ , А . . , А.1<Ш1С

рис 1 Transglutaminase (TG) activity in muscle tissue

р ' 1 of salmons with spawning changes

Полимеризация мышечных белков под действием ТГ сопровождалась образованием димерной формы миозина, которую регистрировали на элек-трофореграмме в виде сигнала с м.м., вдвое большей (410420 кДа) м.м. тяжелых миози-новых цепей. Одним из основных продуктов трансглутами-назной реакции был белок с м.м. около 240 кДа, являющийся продуктом конденсации одной тяжелой цепи миозина и легкого белка с м.м. около 2530 кДа. Обнаруженные изменения практически полностью совпадают с теми, что ранее были установлены для процесса ферментативной реакции полимеризации миофибрилляр-ных белков у глубоководных рыб (Караулова и др., 2007). Установлено, что независимо от типа использованного в реакции фермента состав основных продуктов практически одинаков. Некоторые различия заключались в том, что при использовании микробиального фермента было обнаружено более высокое количество минорных продуктов реакции. Сравнение физико-химических свойств актомиозиновых комплексов после реакции полимеризации позволило установить ряд общих и отличительных свойств в зависимости от использованного фермента (табл. 2). Димеры, полученные в обоих случаях, характеризовались низкой растворимостью в растворах с высокой ионной силой, и их растворимость зависела от величины рН. Наибольшую растворимость димеры имели при рН 9,8-10,2 (раствор Вебера) — 0,37-0,43 мг/мл. Димер, полученный с помощью тканевой ТГ (Т-димер), обладал значительно более высокой растворимостью в растворах Хас-сельбаха-Шнайдера (0,16-0,18 мг/мл) и Губа-Штрауба (0,22-0,24 мг/мл) по сравнению с димером, полученным с помощью микробиального фермента (М-димером) — соответственно 0,04-0,06 и 0,11-0,13 мг/мл. Активность магний-зависимой АТФазы Т-димера составляла около 2/3 активности АТФазы интакт-ного актомиозина (0,24 мкМ/мг мин), в то время как активность М-димера была следовой. Т-димер суперпреципитировал со скоростью в 4 раза большей, чем интактный актомиозин (0,42 мин). М-димер агрегировал в растворах с низкой ионной силой вне зависимости от концентрации АТФ в растворе в диапазоне 0,05-2,50 мМ (табл. 2). В зависимости от количества использованного в экспе-

Тяжелые цепи миозина , ~ 205-207 кДа

< 200 кДа

Рис. 1. Состав миофибриллярных белков скелетных мышц кеты после инкубирования с микроби-альной ТГ (электрофорез в 5 %-ном полиакриламид-ном геле при 15-5 мА и 240-90 В в течение 6,5 ч) Fig. 1. C ontents of myofibril proteins of keta skeletal muscles after incubation with bacterial TG after separation by electrophoresis method in 5 % polyacril-amide gel at 15-5 мА and 240-90 В during 6.5 hours

риментах фермента (от 75 до 550 единиц активности на 1 кг мышечной ткани) изменялось относительное содержание димерной формы тяжелых цепей миозина. При количестве фермента 220-250 ед./кг мышечной ткани относительное содержание димера изменялось в зависимости от объекта — от 25 (горбуша) до 60 % (кижуч). Степень полимеризации также зависела от величины рН реакционной смеси (рис. 2). Максимальный выход продуктов полимеризации наблюдали в диапазоне значений рН, близких к нейтральному — 6,5-6,8.

Таблица 2

Физико-химические свойства актомиозинов, полученных под действием ТГ различного происхождения

Table 2

Modification of physical-chemical properties of actomyosins by different TG action

Компонент Растворимость, мг/мл Раствор Раствор Вебера Хассельбаха-Шнайдера Раствор Губа-Штрауба Активность АТФазы, мкМ/мг мин Скорость суперпреципитации

Интактный

актомиозин - - - 0,24 0,42

Т-димер 0,37-0,43 0,16-0,18 0,22-0,24 0,18 1,68

М-димер 0,37-0,43 0,04-0,06 0,11-0,13 Следы Нет

s s

m S

a

s

^

о с

►.с SE

fu

60

50

40

30

20

10

1

f •

2

; / \

: / U

\/ „

if •

6.5

7.5

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

И

SE S

s

ai k E

о SE

ai

a

H 1-е f-

o

0 SE в s

1

Исследование влияния полимеризации мышечных белков на прочностные характеристики мышечных фаршей было выполнено методом измерения модуля сохранения в режиме нагревания золей в ячейке реометра.

Рис. 2. Зависимость степени полимеризации миозина мышечной ткани кеты и активности ТГ от величины рН реакционной смеси: 1 — доля поли-меризованного миозина; 2 — активность ТГ

Fig. 2. pH-response relationship polymerization degree of keta muscle tissue myosin and TG activity: 1 — part of polymerized myosin; 2 — TG-activity

pH

Для модельных экспериментов использовали метод измерения с равномерным и ступенчатым подъемом до температуры становления гелей (80 оС). Результаты показали практически полную инертность собственных мышечных ТГ в указанных условиях.

Полученные результаты позволяют считать, что наиболее прочные и эластичные гели образуются при рН 7,5 и температуре становления не ниже 40 оС.

Влияние величины активности ТГ на реологические характеристики фаршей, в том числе в зависимости от сроков морозильного хранения сырья, показано на рис. 3 и 4. Количество фермента указано в процентах к общей массе фарша (активность микробиальной ТГ — 1 ед, что соответствует 1,375 мг; доля мышечной ткани в фарше — 65 %).

о

га q

о

58 56 54 52 50 48 46 44 42 40

i

ш

¥

0,3 0,5

0,7

0 0.3 0.5 0.7

0 0.3 0.5 0.7 0 0.3 0.5 0.7

Концентрация ТГ, %

4 6

Срок хранения сырья, мес

Рис. 3. Изменение реологических характеристик мышечных тканей нерестовой кеты под влиянием различных концентраций ТГ: А — изменение эластичности фаршей кеты в зависимости от концентрации ТГ, Б — изменение когезии фаршей кеты в зависимости от концентрации ТГ и сроков морозильного хранения сырья

Fig. 3. Variations of rheological characteristics of muscular tissues of a spawning keta under influence of various concentration TG: A — change of keta forcemeats depending on concentration TG; Б — cohesion change of a elasticity keta forcemeats depending on concentration TG and dates of freezing storage of raw material

9

Продолжительность морозильного хранения сырья, мес

Рис. 4. Изменение характеристик фаршей кеты после обработки ТГ в зависимости от сроков морозильного хранения сырья. Количество ТГ соответствует данным рис. 3

Fig. 4. Variations of characteristics of keta forcemeats after processing TG depending on dates of freezing storage of raw material. TG quantity corresponds to the data fig. 3

Эластичность, когезионные, прочностные и вязкостные характеристики мышечных белков после формования значительно увеличиваются при использовании фермента в количестве не менее 0,5 % (~ 250 ед./кг) от общего количества фаршевой смеси. Полученные данные свидетельствуют о том, что даже при сроке хранения 9 мес фарши кеты сохраняют высокие показатели липкости и вязкости, а значения прочностных характеристик определяют эффективность использования ТГ в производстве формованной продукции.

Сравнительный анализ реологических показателей продуктов типа "камабо-ко" на основе фаршей из лососевых подтверждает вывод об эффективности использования экзогенных ферментов (табл. 3).

При использовании ТГ для объектов со сроком хранения 9 мес наблюдали стабилизацию реологических модулей сырых фаршей.

Полученные данные свидетельствуют о том, что использование ТГ определяет возможность получения формованной продукции на основе фаршей лососей с нерестовыми изменениями даже после длительного морозильного хранения. На примере мышечных фаршей кеты с различной степенью выраженности нерестовых изменений была продемонстрирована эффективность ТГ в технологии формованных изделий (табл. 4).

Таблица 4

Реологические характеристики "камабоко" из нерестовой кеты групп А и В со сроком хранения 9 мес при использовании ТГ

Table 4

Rheological characteristics of comaboko from keta with sprawing changes with TG using (shelf life of raw materials 9 months)

ТГ, % Разрушающее напряжение, г Прочность, г-см А В С Д

Группа А

0 253-256 251-254 69 40(57) 40 32

0,1 300-303 297-300 132 106(80) 42 33

0,5 386-413 382-409 189 144(76) 39 34

1,0 460-500 455-495 Группа В 290 228(79) 38 30

0 138-166 137-164 151 100(66) 28 37

0,1 198-210 196-208 102 83(81) 28 35

0,5 253-296 250-293 142 105(74) 31 33

1,0 310-313 306-309 157 123(78) 28 32

Примечание. Разрушающая деформация 0,99 см; А — усилие при резании плоским ножом (толщина 0,5 мм), г; В — то же на глубине 1 см, г; в скобках — доля от режущего усилия, %; С — упругость при нагрузке 150 г, %; Д — то же при 450 г, %.

Таким образом, использование ТГ влияет на состав миофибриллярных белков и процессы структурообразования и обеспечивает универсальность технологических приемов при производстве формованных изделий на основе фаршей из лососей с нерестовыми изменениями независимо от степени их выраженности, технохимических характеристик сырья и продолжительности его морозильного хранения.

Таблица 3

Структурно-механические показатели продуктов типа "камабоко" на основе фарша нерестовых лососей, приготовленных с использованием ТГ (срок хранения сырья 9 мес), %

Table 3

The changes of water hold properties and elasticity of comaboko from forcemeats from salmons with spawning changes with TG using (shelf life of raw materials 9 months), %

Концентрация ТГ Вода ВУС Эластичность

Нерка

0 74,0 46,3-48,8 46-51

0,5 74,0 51,0-55,0 49-56

Кижуч

0 74,0 44,0-47,3 53-58

0,5 74,0 48,8-49,0 56-57

Семга

0 70,0 42,0-44,0 51-52

0,5 72,0 51,0-53,0 54-55

Список литературы

Измайлова В.Н., Ребиндер П.А.. Структурообразование в белковых системах. — М.: Наука, 1974. — 268 с.

Караулова Е.П., Леваньков С.В., Якуш Е.В. Влияние трансглутаминазы на состав тяжелых цепей миозинов скелетных мышц некоторых видов глубоководных рыб // Изв. ТИНРО. — 2007. — Т. 148. — С. 322-329.

Лазаревский А.А. Технохимический контроль в рыбообрабатывающей промышленности. — М.: Пищепромиздат, 1976. — 515 с.

Мельникова О.М. О влагоудерживающей способности мышечных тканей // Рыб. хоз-во. — 1977. — № 2. — С. 72-73.

Николаев В.А. Измерение структурно-механических свойств пищевых продуктов. — М.: Экономика, 1964. — 170 с.

Орлова М.В., Чибиряк Л.М., Леваньков С.В., Якуш Е.В. Технохимическая характеристика нерестовой кеты // Хранение и переработка сельхозсырья. — 2003. — № 1. — С. 24-27.

Greenberg C.S., Birckbichler P.J., Rice R.H. Transglutaminases: multifunctional cross-linking enzymes that stabilize tissues // FASEB J. — 1991. — Vol. 5. — P. 3071-3077.

Griffin M., Wilson J. Detection of e(g-glutamyl) lysine // Molec. Cell. Biochem. — 1984. — Vol. 58. — P. 37-49.

Lorand L., Conrad S. Transglutaminases // Molec. Cell. Biol. — 1984. — Vol. 58. — P. 9-35.

Melino G., Annicchiarico-Petruzzelli M., Piredda L. et al. Tissue transglutam-inase and apoptosis: sense and antisense transfection studies with human neuroblastoma cells // Molec. Cell. Biol. — 1994. — Vol. 14. — P. 6584-6596.

Takeda H., Seki N. Enzyme-catalyzed cross-linking and degradation of myosin heavy chain in Walley Pollack surimi paste during setting // Fish. Sci. — 1996. — Vol. 62. — P. 462-467.

Willemijn L. Specificity of tissue transglutaminase explains cereal toxicity in coeliac disease // J. Exp. Med. — 2002. — Vol. 195. — P. 643-649.

Поступила в редакцию 8.06.07 г.