CC BY
133
УДК 616.981.42+616.981.51
Использование теста активации базофилов для лабораторной диагностики бруцеллеза и сибирской язвы
Д.Г.Пономаренко, Е.Л.Ракитина, О.В. Логвиненко patomorf@yandex. ru ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора
В настоящее время для выявления сенсибилизации организма разработан комплекс методов, включающий кожные пробы и аллергологические тесты in vitro.
Для определения аллергической перестройки организма наиболее часто применяют накожное аллерготестирование. Однако его использование сопряжено с риском возникновения общих и местных реакций на дополнительную антигенную нагрузку. Не рекомендуется постановка кожных аллергических проб детям до пяти лет и беременным.
Кожно-аллергическая проба с бруцеллином и антраксином, так называемые проба Бюрне и антраксин-кожный тест, были разработаны во второй половине XX века. Согласно методическим указаниям МУ 3.3.1889-04 и МУК4.2.2413-08, кожно-аллергические тесты используются для лабораторной диагностики бруцеллеза и сибирской язвы, а также с целью определения напряженности поствакцинального иммунитета перед повторной иммунизацией.
Постановка аллергических тестов с бруцеллином и антраксином имеет ряд недостатков. Так, у лиц, высокосенсибилизированных к бруцеллезному и сибиреязвенному антигену, возможно развитие реакции в виде повышения температуры, озноба, головной боли, лимфангита, артралгии и т.д. К недостаткам можно отнести риск возникновения ложноположительного результата при
иммунопатологических состояниях. Учет реакции осуществляется через 24-48 часов.
C конца XX века и по настоящее время ведутся исследования, направленные на замену инвазивных аллергических тестов на более безопасный метод оценки аллергической перестройки организма in vitro. Предложенные к использованию тесты радиоаллергосорбентный, метод микроскопической оценки дегрануляции базофилов по окраске щелочными красителями или определение концентрации освобожденного гистамина (метод Шелли), реакция лейкоцитолиза (тест аллергической альтерации лейкоцитов), выявления специфических иммуноглобулинов Е имеют ряд ограничений, обусловленных трудоемкостью воспроизводимости, низкой чувствительностью и слабой специфичностью.
В 1994 году Sainte-Laudu et al. впервые предложили метод определения дегрануляции базофилов методом проточной цитометрии. Сущность теста сводится к тому, что при внесении в пробу известного тест-аллергена, при наличии сенсибилизации, он взаимодействует со специфическими молекулами IgE, которые связаны с поверхностными рецепторами базофилов. Это инициирует каскад ферментных реакций, приводящих к дегрануляции эффекторной клетки с экспрессией маркера клеточной перестройки CD63 (gp53). Благодаря используемой технологии CAST® (Cellular Antigen Stimulation Test, тест антигенной стимуляции клеток), способ обладает высокой специфичностью по сравнению с классическими методиками.
Целью настоящей работы явилось изучение возможности применения теста активации базофилов для диагностики бруцеллеза и сибирской язвы.
Исследовали кровь 73 человек, из них 20 - больных острым и хроническим бруцеллезом, 12 человек, вакцинированных Brucella abortus 19 BA (на 30-35 сутки после иммунизации), 5 - больных кожной формой сибирской язвы на седьмые сутки после инфицирования (на 2-4 день заболевания), 5 человек, иммунизированных вакциной Bacillus anthracis СТИ-1 на 21 сутки после вакцинации. С целью определения специфичности и чувствительности используемого метода исследовали кровь беременных - 7 человек (31-33 неделя беременности), 18 обследованных в возрасте от 2-х до 37 лет с иммунопатологическими процессами, контрольную группу составили 5 человек, не имеющих в анамнезе симптомов аллергии, не переболевших бруцеллезом и сибирской язвой и не вакцинированных против этих инфекций.
Экспрессию на базофилах CD63 определяли на проточном цитометре FACSCalibur (США), используя набор моноклональных антител Buhlmann laboratories (Швейцария). Для определения фонового значение, с целью исключения ложноположительного результата, использовали «буфер для стимуляции» (Flow 2 CAST). При учете результата значение фоновой пробы вычитали из аналогичного показателя при стимуляции аллергеном, полученные цифровые данные отражают процент активированных базофилов.
Обеззараживание исследуемого материала от больных бруцеллезом и сибирской язвой осуществляли согласно санитарноэпидемиологическим правилам - СП 1.3.1285-03.
Полученные результаты обрабатывали статистически с помощью программы Statistica 6.0.
При постановке теста активации базофилов с бруцеллином и антраксином достоверных различий в показателях у беременных, лиц,
имеющих в анамнезе дисфункциональные изменения в иммунной системе, и контрольной группы не установлено, в связи с этим они были объединены в контрольную группу.
Проведенные исследования показали, что у больных острой формой бруцеллеза число активированных бруцеллином базофилов находилось в передах от 10 до 17% и в среднем составило 13,75±1,65%. У больных хроническим бруцеллезом выявили от 38 до 47% дегранулированных базофилов, среднее значение составило 39,7±3,84%. В группе иммунизированных против бруцеллеза количество детектируемых клеток варьировало от 9 до 27%, в среднем составив 20,0±3,95%. В контрольной группе исследуемый показатель находился в пределах от 0 до 5%, при среднем значении 2,22±0,36%.
У больных кожной формой сибирской язвы определено от 41 до 79% активированных антраксином базофилов, при этом среднее значение по группе составило 54,4±6,5%. У иммунизированных Bacillus anthracis СТИ-1 количество детектируемых клеток варьировало от 12 до 26%, в среднем 21,7±3,02%. В контрольной группе процент активированных антраксином базофилов находился на уровне от 1,7 до 6,7%, среднее значение составило 4,12 ±0,85%.
При проведении исследований установлено, что у больных острой формой бруцеллеза количество активированных бруцеллином базофилов в 4,7 раза превышало значения контрольной группы. В случае хронического течения заболевания и у иммунизированных пациентов выявляли увеличение определяемых клеток - в 18 и 9 раз соответственно относительно контрольного уровня. У больных острым бруцеллезом и у вакцинированных исследуемый показатель был в 3,7 и 2 раза ниже, чем у пациентов с хронической формой заболевания.
При внесении в исследуемые пробы антраксина выявлено увеличение количества клеток, экспрессирующих рецепторы к CD63 у больных кожной формой сибирской язвы в 13,2 раза по сравнению с контрольной группой и в 2,5 раза - по сравнению с группой иммунизированных людей. Формирование вакцинного процесса сопровождалось увеличением количества дегранулированных базофилов в 5,3 раза относительно контрольных значений.
Полученные результаты указывают на перспективу применения аллергического теста in vitro для диагностики бруцеллеза и сибирской язвы. Учет результатов проводят через 1 час от начала исследования, при этом возможна количественная оценка степени сенсибилизации организма. Предложенная методика исключает добавочное антигенное воздействие на организм, что предупреждает возникновение
осложнений и дополнительной аллергизации организма и может быть использована как альтернатива пробе Бюрне и АКТ.
Считаем необходимым отметить, что дифференциация степени сенсибилизации, при остром бруцеллезе и после иммунизации, с помощью теста активации базофилов возможна с учетом комплекса клинических и лабораторных исследований.
Таким образом показана принципиальная возможность и перспектива использования теста активации базофилов в комплексе лабораторных методов диагностики бруцеллеза и сибирской язвы, а также для оценки поствакцинального иммунитета.
Предложен новый метод лабораторной диагностики бруцеллеза и сибирской язвы в условиях in vitro, основанный на способности базофилов активироваться под действием специфического антигена.
Тест активации базофилов позволяет дифференцировать вакцинный и инфекционный процессы при хроническом бруцеллезе и сибирской язве.
Метод может быть использован для оценки напряженности поствакцинального иммунитета перед повторной иммунизацией против бруцеллеза и сибирской язвы.
Использование метода исключает добавочное антигенное воздействие на организм и позволяет проводить постановку и учет реакции в течение 1 часа.
