CC BY
10
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
DOI: 10.25930/0372-3054/011.4.12.2019 УДК: 633.521:631.527
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ SSR-МАРКЕРОВ В ИЗУЧЕНИИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ СОРТОВ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА
Т.А. Базанов, И.В. Ущаповский
Значительное количество сортов льна-долгунца, представленных в постоянно обновляющемся Государственном реестре селекционных достижений Минсельхоза России, свидетельствует о результативности отечественной селекционной работы. ДНК-маркирование, в том числе использование микросателлитных SSR-маркеров, рассматривается как наиболее информативный метод для анализа генетического полиморфизма и повышения эффективности селекции сельскохозяйственных культур. Исследование проведено на 12 сортах российской селекции из коллекции ФНЦ лубяных культур (г. Тверь). Генетический анализ проводился с использованием набора из 14 SSR-маркеров, синтезированных компанией ООО «НПФ Синтол». В исследуемых сортах льна-долгунца было определено 117 аллелей, что позволило оценить их генетическое разнообразие, 17 детектированных аллелей оказались редкими, что позволило выделить 10 сортов, обладающих возможностью генотипирования по трем маркерам. Кластерный анализ позволил разделить сорта на несколько ветвей, демонстрирующих различное географическое происхождение и сведения о генеалогии исследованных сортов. Дальнейшие исследования позволят расширить представление о генетическом разнообразии льна-долгунца российской селекции.
Ключевые слова: лен, молекулярные маркеры, ПЦР, генетическое разнообразие, селекция
USE OF SSR MARKERS IN THE STUDY OF FIBER FLAX (LINUM USITATISSI-MUM L.) VARIETIES GENETIC DIVERSITY
T.A. Bazanov, I.V. Uschapovsky
A significance amount of fiber flax cultivars, presented in the constantly updating State Register of Breeding Achievements for the Ministry of Agriculture in Russia, is the evidence of domestic breeding work efficiency. DNA marking, including the use of microsatellite SSR-markers, is considered as the most informative method for analysing genetic polymorphism and improving the efficiency of crop selection. The study was conducted on 12 fiber flax cultivars of Russian selection from the collection of the Federal Scientific Center for Bast Crops (Tver). Genetic analysis was carried out using a set of 14 SSR markers synthesized by the Syntol company: 117 alleles were identified in studied fiber flax cultivars, which made it possible to evaluate their genetic variability; 17 identified alleles were rare, that allowed allocating 10 cultivars, with the possibility of genotyping for three markers. Cluster analysis made it possible to divide varieties into a few groups with different geographical origin and information about the genealogy of the studied varieties. Further research will expand the understanding for the genetic diversity of fiber flax cultivars of the Russian selection.
Key words: flax, molecular markers, PCR, genetic diversity, selection
Введение. Льноводство является традиционной отраслью отечественного сельского хозяйства, особенно в регионах Нечерноземной зоны страны. В настоящее время культуре льна уделяется дополнительное внимание, поскольку современные технологии переработки волокнистого сырья позволяют получать продукцию, заменяющую импортный хлопок в текстильной, медицинской, химической промышленности. Большинство сортов льна-долгунца, представленных в Государственном реестре селекционных достижений Минсельхоза России, - результат многолетней работы российских селекционных учреждений. Селекционные программы по льну-долгунцу сориентированы, в основном, на увеличение и стабильность урожая волокнистой продукции [1].
Успех селекционной работы по основным хозяйственно ценным признакам определяется исходным материалом, вовлеченным в скрещивания, степени его разнообразия и генетической изученности [2]. Внутривидовое генетическое разнообразие льна относительно невелико вследствие самоопыления и невысокого числа исходных форм, что требует расширения генофонда льна за счет новых методов гибридизации, отбора и введения новых ценных генов [3].
В настоящее время для повышения эффективности процесса селекции льна наиболее рациональным считается применение высокоточных, быстрых и надежных молекулярно-генетических методов, основанных на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР) [4]. Наиболее эффективными для льна являются микросателлитные или SSR (Simple Sequence Repeats) маркеры, количество которых превышает 1300, и работа по их изучению и использованию только начинается [5]. Полученные на основании ДНК-маркеров данные можно использовать для подбора родительских форм, паспортизации сортов и линий, идентификации ценных генотипов, а также для маркирования отдельных генов и локусов растений [6, 7].
Целью настоящей работы стало изучение генетического разнообразия сортов льна-долгунца различного происхождения на основе ДНК-анализа с использованием набора оригинальных SSR-маркеров.
Материалы и методы исследования. Материалом для данного исследования послужили 12 сортов льна-долгунца, включенных в Государственный реестр селекционных достижений Российской Федерации: Александрит, Дипломат, Сурский, Росинка («тверская селекция»); Восход, Добрыня, Пересвет («псковская селекция»); Томич, Тост 4, Тост 5, Томский 17, Памяти Крепкова («томская селекция»). Образцы семян получены из коллекции ФНЦ ЛК (г. Тверь). ДНК выделяли из проростков растений с применением CTAB-метода. Для проведения ПЦР были использованы 14 пар прайме-ров, разработанных и синтезированных ООО «НПФ Синтол» (г. Москва). Для проведения ПЦР использовался амплификатор Т100 (BIO-RAD). Разделение продуктов ПЦР проводилось с использованием вертикального электрофореза в 8%-ном полиакрила-мидном геле в ячейке mini Protean (BIO-RAD). Детекция линий ДНК производилась с помощью гель-документирующей системы ChemiDoc (BIO-RAD), анализ электрофоре-грамм выполнялся с использованием программы Image Lab (BIO-RAD Software). Генетический анализ полученных данных выполнялся с использованием надстройки GenAlex 6.5 (GenAlex software), для построения дендрограммы генетического подобия использовали программное обеспечение DARwin v.6 (DARwin software).
Результаты и обсуждение. Полученная SSR-база данных с использованием 14 пар SSR-праймеров позволила оценить генетическое разнообразие 12 сортов льна-долгунца. В таблице 1 приведены данные, отражающие количество и размер детектированных аллелей.
Таблица 1 - Характеристика полиморфных ББЯ-локусов льна-долгунца
SSR-маркер Аллели Число аллелей Число редких аллелей
Лен1 245 - 252, 282 - 286 11 4
Лен2 171 - 183 8 0
Лен3 395 - 412 7 0
Лен4 210 - 217 6 0
Лен5 302 - 308 6 0
Лен6 147 - 161 6 0
Лен6.1 147 - 155 6 0
Лен7 369 - 376 8 0
Лен8 168 - 177, 602 - 625 15 7
Лен 10 174 - 369 6 0
Лен 11 235 - 255 9 0
Лен12 381 - 389 8 0
Лен 13 320 - 326 7 0
Лен15 155 - 160, 179 - 188 14 6
В целом у изученных генотипов было определено 117 аллелей размером от 147 до 625 п.н. Число аллелей на локус в изученной выборке сортов варьировало от 6 (ББК-маркеры Лен4, Лен5, Лен6, Лен6.1) до 15 (ББЯ-маркер Лен8), при этом среднее значение составило 8,4. Таким образом, использованный набор маркеров показал достаточно высокие показатели информационного содержания. Частота встречаемости аллелей 14 микросателлитных локусов варьировала от 4,2 до 41,7%.
Оценивая генетическое разнообразие у изученных сортов, отдельно учитывали частоту встречаемости редких аллелей. Аллели относились к редким, если встречались в исследуемой выборке только у одного сорта. Обнаружено 10 сортов, каждый из которых имеет от одного до двух редких аллелей (табл. 2). Из 117 аллелей, обнаруженных в выборке, 17 были редкими. В дальнейшем наличие таких редких аллелей может послужить для точного генотипирования различных сортов льна, различимость которых по морфологическим признакам затруднена.
Таблица 2 - Редкие аллели изученных сортов льна-долгунца
Аллель Сорт Аллель Сорт
Лен1 245 Александрит Лен15 156 Тост 4
247 Дипломат 160 Пересвет
282 Тост 5 180 Сурский
283 Восход 184 Тост 4
Лен8 170 Дипломат 187 Томич
602 Восход 188 Пересвет
609 Памяти Крепкова
612 Росинка
622 Тост 5
623 Пересвет
625 Сурский
Для подтверждения достоверности полученных данных был выполнен кластерный анализ. На основании анализа генетических дистанций с использованием метода связывания ближайших соседей по Нею была построена дендрограмма генетического подобия исследованных образцов (Рис. 1.)
Сурский
Дипломат
Александрит Росинка.
Добрыня
Тост 4
Томич
Томский 17
Тост 5
Пересвет _Восход
Памяти Крепкова
Рис. 1. Дендрограмма генетического подобия исследованных сортов льна-долгунца Проведенный анализ разделил сорта исследованной выборки на несколько кластеров. В один вошли сорта Дипломат, Александрит, Сурский и рядом с ними, но обособленно, сорт Росинка. Все они относятся к группе средне-позднеспелых сортов
«тверской селекции», то есть созданных селекционерами ВНИИЛ с использованием вологодских кряжевых форм и других общих родительских генотипов [8]. В других кластерах оказались сгруппированы раннеспелые сорта псковской и томской селекции, имевшие в своих родословных близкородственные родительские генотипы (псковские кряжи) [9,10]. Результаты ПЦР-анализа на основе использованного набора оригинальных SSR-праймеров соотносятся с данными о происхождении изученных генотипов, что предполагает дальнейшее изучение особенностей применения ДНК-маркеров для генотипирования сортов и выявления связей с их хозяйственно ценными признаками.
Заключение. Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что использованный в работе набор SSR-праймеров российской разработки позволил выявить генетическое разнообразие у сортов отечественной селекции, созданных тремя различными ори-гинаторами - Псковским НИИСХ, ВНИИЛ (оба филиалы ФГБНУ ФНЦ ЛК) и Томской ГОСХОС (филиал ФГБУН СибФНЦА РАН). Использование молекулярных маркеров подтвердило сведения о наличии родственных связей между сортами псковской и томской селекции, что позволяет расширить исследования представленных в Госреестре сортов льна для разработки системы генетической паспортизации и адаптации методов маркер-ассоциированной селекции для культуры льна.
Работа выполнена в рамках Государственного задания Минобрнауки России по теме № 0477-2019-0023.
Авторы выражают благодарность ООО «НПФ Синтол» за предоставленный для исследования набор SSR-праймеров.
Литература
1. Понажев В.П., Медведева О.В. Современные достижения селекции и семеноводства для выращивания льна //Достижения науки и техники АПК. 2015. Т. 29. № 9. С. 36-39.
2. Брач Н.Б., Шаров И.Я., Павлов А.В., Пороховинова Е.А. Разнообразие признаков льна, связанных с формированием волокна, и влияние условий выращивания на их проявление //Экологическая генетика. 2010. Т. 8. № 1. С. 25-35.
3. Ущаповский И.В., Лемеш В.А., Богданова М.В., Гузенко Е.В. Особенности селекции и перспективы применения молекулярно-генетических методов в генетико-селекционных исследованиях льна (Linum usitatissimum L.) //Сельскохозяйственная биология. 2016. Т. 51. № 5. С. 602-616.
4. Vromans, J. Molecular genetic studies in flax (Linum usitatissimum L.) : PhD thesis /J. Vromans //Wageningen University, The Netherlands, 2006. 143 p.
5. Лемеш В.А., Богданова М.В., Семашко Т.В., Бейня В.А., Кильчевский А.В., Хотылева Л.В. Полиморфизм микросателлитных локусов льна (Linum usitatissimum L.) как основа генетической паспортизации сортов //Доклады НАН Беларуси. 2013, 57(2): 74-78.
6. Soto-Cerda B.J.,Saavedra H.U.,Navarro C.N., Ortega P.M. Characterization of novel genetic SSR markers in Linum usitatissimum (L.) and their transferability across eleven Linum species //Electron. J. Biotechnol. - V. 14, N 2 [Electronic resource]. 2011. Mode of access: http://www.ejbiotechnology.info/index.php/ejbiotechnology/article/view/v14n2-6/1285. -Date of access : 07.12.2019.
7. Kale S.M., Pardeshi V.C., Kadoo N.Y., Ghorpade P.B., Jana M.M., Gupta V.S. Development of genomic simple sequence repeat markers for linseed using next-generation sequencing technology //Mol. Breed. 2012. V. 30, N 1. P. 597-606.
8. Павлова Л.Н., Герасимова Е.Г., Румянцева В.Н. Новые методы в селекции льна-долгунца //В сборнике: Инновационные разработки для производства и переработки лубяных культур; материалы Международной научно-практической конференции ФГБНУ ВНИИМЛ. - Тверь, Изд-во ТвГУ, 2017. С. 85-88.
9. Степин А.Д., Рысева Т.А., Кострова Г.А., Уткина С.В., Романова Н.В. Селекционная оценка гибридных популяций льна-долгунца в Псковском НИИСХ //Известия Великолукской государственной сельскохозяйственной академии. 2018. 4. С. 26-35.
10. Попова Г. А., Мичкина Г. А. Томской селекции и семеноводству льна-долгунца 80 лет //Материалы межрегиональной научно-практической конференции с международным участием: Льноводство: современное состояние и перспективы развития. - Томск, 04 июля 2017. С. 10-15.
Базанов Тарас Александрович, к.х.н., ведущий научный сотрудник ФГБНУ ФНЦ ЛК, Тверская обл., г.Тверь, E-mail: t.bazanov@fnclk.ru
Ущаповский Игорь Валентинович, к.б.н., доцент, заместитель директора ФГБНУ ФНЦ ЛК, Тверская обл., г. Тверь, E-mail: i.uschapovsky@fnclk.ru
Bazanov Taras Alexandrovich, Cand. of Sci., Leading Researcher of FSBSI FSC for Bast Crops. Tver, Tver region, E-mail: t.bazanov@fnclk.ru
Uschapovsky Igor Valentinovich, Cand. of Biol. Sci., Deputy Director of FSBSI FSC for Bast Crops. Tver, Tver region, E-mail: i.uschapovsky@f
