CC BY
29
DOI: 10.34617/4a9q-wn62 УДК 636.22/.28.082.2:575.1
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ЖИВОТНЫХ, НОСИТЕЛЕЙ АЛЛЕЛЯ А1 ЛОКУСА БЕТА-КАЗЕИНА USE OF SITE-SPECIFIC PCR FOR
IDENTIFICATION OF ANIMALS, CARRIERS OF ALLEL OF A1 LOCUS OF BETA-CASEINE
Ковалюк Наталья Викторовна1, , д-р биол. наук, Якушева Людмила Ивановна1, канд. биол. наук, Шахназарова Юлия Юрьевна1, Кесем Амани Айман2, магистрант :ФГБНУ КНЦЗВ, Российская Федерация, г. Краснодар, 2ФГБОУ КубГУ, Российская Федерация, г. Краснодар, Kovalyuk Natalia Viktorovna Dr.Biol.Sc., Yakusheva Kyudmila Ivanovna Cand. Biol. Sc., Shakhnazarova Yulia Yurievna1 , researcher, Kesem Amani Ayman2 ,undergraduate, 1Krasnodar Research Centre for Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Krasnodar, Russian Federation, 2Kuban State University, Krasnodar, Russian Federation
Аннотация: разработана функциональная тест - система на основе АС-ПЦР для выявления полиморфизма локуса бета казеина (CSN2). Планируется использовать тест-систему для поиска носителей аллеля А1 случайно попавших в группу животных, производящих молоко типа А2.
Ключевые слова: ген CSN2; тест-система; аллель А1.
Abstract: a functional test-system has been developed - a system based on AC-PCR for detecting polymorphism of the beta casein locus (CSN2). It is planned to use a test system to search for carriers of the A1 allele that incidentally fall into the group of animals that produce milk of A2 type.
Key words: CSN2 gene; test system; A1 allele.
Проблема производства безопасной для потребителя молочной продукции достаточно актуальна. В последние годы проведены исследования, посвященные изучению влияния полиморфизма локуса бета-казеина (CSN2) на безопасность молока и молочных продуктов. Установлено, что существует связь между потреблением молочного Р-казеина типа А1 и различными заболеваниями [1-7].
При расщеплении ферментами желудочно-кишечного тракта молока, содержащего фракцию В-казеина А1 (полученного от коров с генотипом А1А1 и А1А2), образуется опиоидный пептид В-казоформин 7 (ВСМ7) в значительно большем количестве, чем при соответствующем расщеплении молока, содержащего фракцию В-казеина А2 (полученного от коров с генотипом А2А2).
Считается, что более высокий уровень ВСМ7 связан с более высокими показателями смертности от ишемической болезни сердца. ВСМ-7 - возможная причина неожиданного синдрома младенческой смерти. Кроме того, неврологические расстройства, такие как аутизм и шизофрения, как представляется, связаны с потреблением молока и более высоким уровнем ВСМ-
7 [3].
Вероятно, опиоидный пептид ВСМ-7 имеет более высокое сродство, по сравнению с иными метаболитами, к ряду рецепторов мозговой ткани, иммунных клеток и клеток кишечника и запускает реакции воспаления, особенно у детей и людей с нарушениями функции пищеварения [4].
В исследовании СЫа, J.SJ. et а1. (2017) приведены доказательства того, что молочный белок А1 Р-казеина коров является основным причинным триггером диабета типа 1 у людей с генетическими факторами риска [5].
При изучении патологической симптоматики после потребления молока А2 и А1 группой взрослых людей с непереносимостью молока (п=600) установлены значительные различия для симптомов вздутия живота, боли в животе, частоты стула и консистенции стула (все Р<0,0001) в пользу употребления молока А2 [6, 7].
Установлено, что А1-подобные типы бета-казеина вызывают воспалительную реакцию в кишечнике через активацию пути Th2, чего нельзя сказать о типах А2 [1].
В настоящее время рядом хозяйств в России и в Краснодарском крае, в частности, начат отбор животных и формирование групп коров, производящих молоко типа А2. Естественно, что при этом существует риск субъективных ошибок и на заключительном этапе формирования таких групп требуется проведение скрининговых анализов, подтверждающих отсутствие животных - носителей аллелей А1.
Методика. Исследования проведены на базе лаборатории биотехнологии ФГБНУ КНЦЗВ. Объектом исследования являлись образцы крови от 327 коров голштинской и айрширской пород (КФХ «Сокольский» и КФХ «Езубов А.И.») и пробы молока от 23 коров. Для выделения ДНК из образцов использовали наборы реагентов Diatom™ DNA Prep 100 (ООО «Лаборатория Изоген», г. Москва). Для постановки реакций использовали наборы реагентов Gene Pak PCR Core (ООО Лаборатория «Изоген», г. Москва) и праймеры следующей последовательности:
1. 5'AGG GAT GTT TTG TGG GAG GCT CTT3'
2. 5'ATA AAA TCC ACC CCT TTG CCC AGA 3'
3. 5'GGA TGT TTT GTG GGA GGC TGT TAT3'
4. 5'ATA AAA TCC ACC CCT TTG CCC AGA 3'
Обработку ПЦР-продуктов эндонуклеазой BstDEI проводили без предварительной очистки.
Визуализацию ПЦР-продуктов и фрагментов рестрикции проводили в 2,5 % агарозном геле.
Результаты исследований и их обсуждение. Генотипи-рованием животных по локусу CSN2 (n=327) установлено, что генотип А2А2 по локусу CSN2 несли 97 голов (30 %). 23 коровы были выделены в отдельную группу для производства молока типа А2.
Для исключения субъективных ошибок при формировании группы нами было проведено тестирование предоставленных проб молока (n=23) на предмет наличия ДНК типа А1. Выделе-
ние ДНК из проб молока производилось по методике производителя после предварительного центрифугирования 1 мл молока каждой пробы при 4000 об/мин. и удаления 900 мкл надосадоч-ной жидкости.
В качестве контроля использованы пробы молока от коров с генотипом А1А1 и А1А2. В ходе тестирования положительный сигнал получен при АС - ПЦР ДНК, выделенной именно из контрольных проб молока (А1А1+А1А2).
Выводы. Таким образом, праймеры 3 и 4 можно использовать в скрининговых исследованиях для подтверждения достоверности отбора животных-продуцентов молока типа А2.
Список литературы
1. Parashar, A., Saini,R. K. A1 milk and its controversy-a review // International Journal of Bioassays. - 2015. - № 4.12. -P: 4611-4619.
2. Kaminski, S., Cieslinska, A., Kostyra, E. Polymorphism of bovine beta-casein and its potential effect on human health // J Appl Genet 48:189-98, 2007. - DOI: 10.1007/BF03195213.
3. Parashar, A., Saini, R. K. A1 milk and its controversy-a review // International Journal of Bioassays. - 2015. - № 4. -P: 4611-4619.
4. Chia, J.S.J., McRae, J.L., Kukuljan, S., Woodford, K., Elliott, R.B., Swinburn, B., Dwyer, K.M. A1 beta-casein milk protein and other environmental pre-disposing factors for type 1 diabetes // Nutr Diabetes - 2017. - Pubmed reference: 28504710. DOI: 10.1038/nutd.2017.16.
5. He M., Sun J., Jiang Z.Q., Yang Y.X. Effects of cow's milk beta-casein variants on symptoms of milk intolerance in Chinese adults: a multicentre, randomised controlled study // Nutr J 16:72. -2017. - DOI: 10.1186/s12937-017-0275-0.
6. Woodford, Ho. S., Kukuljan, K., Pal S. Comparative effects of A1 versus A2 beta-casein on gastrointestinal measures: a blinded randomised cross-over pilot study // Eur J Clin Nutr 68:994-1000, 2014. Pubmed reference: 24986816. DOI: 10.1038/ejcn.2014.127.
7. Duarte-Vázquez, M.Á., García-Ugalde, C., Villegas-Gutiérrez, L.M., García-Almendárez, B.E., Rosado, J.L. Production
of Cow's Milk Free from Beta-Casein Aland Its Application in the Manufacturing of Specialized Foods for Early Infant Nutrition // Foods 6:- 2017. Pubmed reference: 28704923.
DOI: 10.3390/foods6070050.
DOI: 10.34617/dgww-tw07 УДК 636.22/.28.082.2:575.1
МУТАЦИЯ В ЛОКУСЕ TFB1M И ЕЕ РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ В СУБПОПУЛЯЦИИ СКОТА КРАСНОДАРСКОГО КРАЯ MUTATION IN THE TFB1M LOCUS AND ITS PREVALENCE IN THE SUBPOPULATION OF THE CATTLE OF KRASNODAR TERRITORY
Ковалюк Наталья Викторовна1, д-р биол. наук, Якушева Людмила Ивановна1, канд. биол. наук, Шахназарова Юлия Юрьевна1, Асякина Алевтина Сергеевна 2, бакалавр Самойленко Мария Владимировна 2, бакалавр 1ФГБНУ КНЦЗВ, Российская Федерация, г. Краснодар, 2ФГБОУ КубГУ, Российская Федерация, г. Краснодар Kovalyuk Natalia Viktorovna1 ,Dr.Biol.Sc., Yakusheva Kyudmila Ivanovna1 ,Cand. Biol. Sc., Shakhnazarova Yulia Yurievna1 , researcher, Asyakina Alevtina Sergeevna2, bachelor, Samoilenko Maria Vladimirovna2, ,bachelor, 1Krasnodar Research Centre for Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Krasnodar, Russian Federation, 2Kuban State Agrarian University, Krasnodar, Russian Federation
Аннотация: на базе лаборатории биотехнологии ФГБНУ КНЦЗВ проведено генотипирование 80 голов коров и 100 голов быков-производителей по локусу TFB1M. Установлено, что в изученной выборке животных, частота встречаемости дефектного гаплотипа НН5 составила 2,2 %.
